差速离心结合脉冲电泳分离枣疯病植原体DNA

为了解枣疯病植原体的分子特征,明确植原体的致病机理及其与寄主的互作关系,以枣疯病组培苗为材料,利用差速离心结合脉冲电泳分离枣疯病植原体DNA。结果表明:感病组培苗在1600²200 kb之间出现一条明亮的条带,而健康组培苗没有,回收后经PCR检测,证明该目的条带是植原体DNA,实时定量PCR的分离结果表明:该实验方法能有效地将植原体基因组和植物基因组分离。     

差速离心结合脉冲电泳分离枣疯病植原体DNA

为了解枣疯病植原体的分子特征,明确植原体的致病机理及其与寄主的互作关系,以枣疯病组培苗为材料,利用差速离心结合脉冲电泳分离枣疯病植原体DNA。结果表明:感病组培苗在1600~2200 kb之间出现一条明亮的条带,而健康组培苗没有,回收后经PCR检测,证明该目的条带是植原体DNA,实时定量PCR的分离结果表明:该实验方法能有效地将植原体基因组和植物基因组分离。     

超速离心结合Real-time PCR分离纯化枣疯病植原体DNA

分离纯化枣疯病植原体基因组DNA,有助于进一步开展对此病原全基因组测序的研究,CTAB法提取枣疯病叶片的总DNA后,采用氯化铯双苯酰亚胺密度梯度离心法从枣树总DNA中富集纯化枣疯病植原体DNA,并通过Real-time PCR方法对分离纯化效果进行定量检测。在此基础上,探索了不同CsCl初始密度对DNA分离效果的影响。在20℃,初始密度为1.650 0g/cm3,经206 000×g下离心23h后,感染枣疯病样品(IS)的离心管中出现2条DNA亮带,正常枣树样品(NS)离心管中只有1条。Real-time PCR检测结果表明NS管中的条带为枣树基因组DNA;IS管中与NS管中相同位置的条带为枣树基因组DNA,另1条带为枣疯病植原体基因组DNA。在保留其他试验条件下,不同CsCl初始密度,会影响DNA条带的位置,也会影响枣疯病植原体DNA与枣树DNA的分离效果,在1.562 2g/cm3的初始浓度下分离效果最好。采用超速离心法可以有效地从感染枣疯病的枣树中分离得到纯的枣疯病植原体DNA,同时利用Real-time PCR法可以实现分离效果的评价,利用此方法分离得到的DNA可用于枣疯病植原体的全基因组测序。     

应用等密度梯度离心法提纯传染性支气管炎病毒

采用分段取样,测ＯＤ２６０,及电镜观察等方法,对用等密度梯度离心法提纯的传染性支气管炎病毒粒子在蔗糖溶液中的病毒富集带和纤突丢失程度进行了分析和总结,提出度离心后３０－５０％区带蔗糖溶液２为较理想的取样位置。     

赞皇大枣枣疯病植原体分子分类

 【目的】枣疯病是一种重要的植原体病害,本试验旨在明确惟一已知的天然三倍体品种--赞皇大枣枣疯病植原体的分类地位,为赞皇大枣枣疯病植原体分类研究提供参考。【方法】利用植原体16S rDNA通用引物对赞皇大枣枣疯病病株的DNA进行PCR扩增和克隆测序,通过BLAST比对进行序列分析,利用临位相连法构建16S rDNA系统演化树,并应用DNAstar软件进行虚拟RFLP分析。【结果】获得的赞皇大枣枣疯病植原体16S rDNA序列长度为1 850 bp（GenBank登录号GU184180）,包括1 529 bp的16S rDNA基因全序列、264 bp的邻近间隔区序列及57 bp的23S rDNA部分基因序列。同源分析表明,赞皇大枣枣疯病病原16S rDNA序列与其它植原体的相似性在87%—98%,其中与榆树黄化 Elm yellows（EY）(GenBank登录号l33763)最高相似性为98%;与大多数二倍体枣品种的植原体序列相似率达99%以上;其虚拟RFLP图谱与4个16SrⅤ亚组的代表序列图谱差异显著,赞皇大枣枣疯病植原体延伸因子tuf基因的序列(GenBank登录号JN001985) 比对结果表明,与其它亚组序列同源性为52.3%—76.7%。【结论】三倍体赞皇大枣枣疯病病原属于榆树黄化组(16Sr V),并与其中的B亚组亲缘关系最近;与二倍体品种的病原分类地位一致,说明枣疯病植原体在系统进化上比较保守。     

用蔗糖密度梯度离心法提纯禽脑脊髓炎病毒

用蔗糖密度梯度离心法进行了禽脑脊髓炎病毒的纯化。将禽脑脊髓炎病毒（ＡＥＶ）Ｌ２Ｚ株、Ｖan Ｒoekel株和１１４３株分别经卵黄囊接种６日龄ＳＰＦ鸡胚,接毒后,以４５００r/min离心及胰腺,用玻璃匀浆器制成１０％的组织悬液。组织悬液经３次反复冻融后,以４５００r/min离心１５min,取上清液。而后用氯仿处理,取水相,经冷冻真空浓缩,进行不连续蔗糖密度梯度离心。取出含ＡＥＶ的组分,用ＰＢＳ稀后超速离心除去蔗糖,得到     

北京地区枣疯病植原体16SrDNA基因序列分析

利用植原体16S rDNA基因保守序列通用引物R16F2n/R16R2对北京昌平区西峰山村小枣患病植株总DNA进行PCR扩增,结果得到约1.2 kb的特异性DNA片段.对克隆扩增获得DNA片段测序,结果表明,北京昌平地区枣疯病植原体16S rDNA基因片段长1248 bp,与韩国枣疯病植原体同源性最高,为99.51%.序列同源性比较的结果表明克隆到的植原体归属于榆树黄化组16SrV-C亚组.     

枣疯病植原体LAMP可视化检测方法的建立

根据枣疯病植原体16SrDNA基因保守序列,设计出4条特异性环介导等温扩增(LAMP)引物。通过对反应条件的优化,建立一种适用于枣疯病植原体的可视化LAMP检测技术,对优化后的方法进行特异性、灵敏度评价。结果显示,该方法能够特异性地检测出枣疯病植原体,且LAMP产物的特异性通过MaeⅡ酶切得到验证;灵敏度较常规PCR高出100倍;并可通过肉眼观察反应液颜色变化,直接判定结果。建立的枣疯病植原体LAMP可视化检测方法适用于基层及现场快速检测,为枣疯病的快速检测提供了新方法。     

枣疯病植原体的分子检测与同源性鉴定

[目的]采用植原体16S通用引物建立枣疯病植原体PCR检测体系.[方法]采用植原体16S rDNA通用引物R16mF1/R16mR1,对陕西和山西具有枣疯病的枣树植株总DNA进行PCR扩增,获得了相关的枣疯病植原体序列.采用DNAMAN软件分析其同源性,绘制系统进化树.运用pDRAW32软件对17种具有16S rDNA分组的典型的限制性内切酶进行计算机模拟RFLP,确定枣疯病植原体同源性关系.[结果]从陕西和山西的枣疯病的植株中,分别得到1 433 bp和1 432 bp的条带,与已报道的枣疯病植原体比较,同源性达到99;以上,而与其他植物的植原体16S rDNA同源性多低于93;,并且与16S rDNA V-B组的遗传距离最近.pDRAW32软件模拟RFLP结果表明它们和已报道的JWB的RFLP图谱相似.[结论]枣疯病植原体归属于16SrDNA V-B,为枣疯病植原体PCR检测体系提供了理论基础.RFLP分析进一步验证了枣疯病植原体属于16SrDNA V-B,具有随地域变异性较小的特性,这将有利于不同地区枣疯病检测技术的建立.     

北京地区枣疯病植原体16S rDNA基因序列分析

利用植原体16S rDNA基因保守序列通用引物R16F2n/R16R2对北京昌平区西峰山村小枣患病植株总DNA进行PCR扩增,结果得到约1.2 kb的特异性DNA片段。对克隆扩增获得DNA片段测序,结果表明,北京昌平地区枣疯病植原体16S rDNA基因片段长1 248 bp,与韩国枣疯病植原体同源性最高,为99.51%。序列同源性比较的结果表明克隆到的植原体归属于榆树黄化组16SrV-C亚组。     

新疆枣疯病植原体tuf基因的克隆与序列分析

[目的]枣疯病是一种重要的植原体病害,了解新疆枣疯病植原体的系统发育关系及遗传分化,获取其分子特征信息.[方法]利用植原体tuf基因通用引物fTufu/rTufu对新疆枣疯病病株总DNA进行PCR扩增,对部分扩增片段克隆、测序及相似性分析.[结果]获得新疆枣疯病阿克苏株系(JWB-ASZ)和喀什株系(JWB-KHZ)的tuf基因片段分别为841和814 bp.经同源性比较分析,新疆枣疯病阿克苏株系(JWB-ASZ)与喀什株系(JWB-KHZ)均隶属于16S rV-B亚组枣疯病植原体.其中JWB-KHZ株系与枣疯病植原体河北株系的tuf基因核苷酸及氨基酸同源性最高,分别达到90.2;和81.5;;JWB-ASZ与枣疯病植原体陕西株系的tuf基因核苷酸及氨基酸同源性最高,分别达到94.2;和94.6;,而与16S rV其它亚组的核苷酸及氨基酸同源性均低于70;.枣疯病阿克苏株系与喀什株系的tuf基因核苷酸及氨基酸序列之间存在明显差异,同源性仅为为73.5;和63.5;.[结论]研究报道了新疆枣疯病植原体tuf基因序列,为揭示新疆枣疯病植原体不同株系的分子特征、分子变异和遗传多样性提供了基础.     

安徽地方枣种质枣疯病植原体16S rDNA序列分析

为研究安徽地方枣种质枣疯病16S rDNA序列特性,以健康及表现枣疯病症状的繁昌长枣叶片DNA为模板,克隆枣疯病植原体16S rDNA序列,获得1条1 248 bp的片段,命名为JWB-FJP1。同源性分析结果表明,JWB-FJP1属于16Sr V-B组,与重庆地方枣枣疯病植原体JWB-Xch(JQ675716)同源性最高,达到99.92%;与河北枣枣疯病植原体JWB-Hebei(GU184186)同源性最低,为67.06%,说明不同地区枣疯病植原体存在一定的生物学特异性。本研究结果为安徽地方枣种质枣疯病病原分类及其快速鉴定提供了理论依据。     

基于secY基因对山东临沂枣疯病植原体的分子鉴定

利用FD9f／r引物对采自山东临沂的枣疯病样品进行secY基因的PCR扩增,并进行了序列测定,结果表明,该特异片段大小为1421bp。对获得的序列与NCBI数据库中相关植原体序列进行同源性分析、构建系统进化树和模拟RFLP分析,结果显示山东临沂枣疯病植原体属于secYV—C亚组,与secYV—B亚组的樱桃致死黄化株系（CLY5）和secYV—N亚组的桃树致死黄化印度分离株系（PY—IN）的亲缘关系最近,在亚组水平上进一步明确了山东临沂枣疯病植原体的分类地位。     

枣疯病植原体新疆分离物16S rDNA基因克隆与序列分析

利用植原体16SrDNA基因保守序列通用引物对新疆阿克苏地区和喀什地区的疑似枣疯病植株总DNA进行常规PCR和巢式PCR检测,分别扩增出1.5kb和1.2kb的特异性片段。对片段进行克隆、序列测定分析及系统发育树构建,结果表明,新疆枣疯病阿克苏分离物和喀什分离物的16SrDNA基因序列同源性极高,达到100%,与16SrⅤ组植原体的同源性达到98.4%以上,并且与16SrⅤ-B亚组中的枣疯病山东莱芜株系、山东龙口株系同源性最高,达到99.5%,因此归属于榆树黄化组16SrⅤ-B亚组。首次报道新疆枣疯病植原体16SrDNA的序列,确定新疆枣疯病植原体的分类地位,为枣疯病的早期诊断和检测提供依据。     

枣疯病植原体胸苷激酶基因的克隆、序列分析与原核表达

枣疯病(jujube witches’-broom, JWB)俗称枣树的“癌症”,是由枣疯病植原体导致的侵染性病害,给我国的枣栽培与生产造成了严重危害,对枣疯病植原体增殖基因的研究有助于枣疯病的有效防治。为获得枣疯病植原体胸苷激酶基因(tdk),利用PCR方法扩增该基因并测序,结果表明,该基因的开放阅读框长度为576 bp,编码191个氨基酸,其蛋白质分子量为21.76 ku。序列分析和预测表明,该蛋白质为植原体细胞质中性质相对稳定的亲水蛋白质。遗传距离和进化树分析显示,植原体tdk基因比其16S rDNA基因的保守程度低,tdk基因和16S rDNA基因序列的进化树高度相似,表明tdk基因适于植原体分子分类。为获得枣疯病植原体TDK蛋白,成功构建了原核表达载体pET-28a-JWB-Heze-tdk;在诱导条件为0.1 mmol·L^-1 IPTG、20℃、140 r·min^-1时,该原核表达载体在Escherichia coli BL21(DE3)菌株中可表达出大量可溶性的N端融合了6×His标签的JWB-Heze TDK蛋白;利用Ni-I...     

枣疯病植原体越冬后向枣树不同类型新生组织转移特性研究

为明确枣疯病植原体越冬后向新生组织的转移扩散特点,从而指导枣疯病预防和控制,本研究采用PCR和DAPI荧光显微技术,比较枣疯病植原体向枣树不同类型新生组织的转移情况。结果表明:室内水培的疯枣枝在萌芽30d后,新生叶片可以检测到植原体;自然栽培枣树的枣股新生叶片生长发育至24d出现植原体;枣树根蘖在萌芽后12d即可检测到植原体。嫁接试验表明,嫁接于染病冬枣砧木上的易感品种接穗‘唐星’,‘阜星’,其萌发的新生幼叶在第34天即可检测到植原体,而抗病品种‘星光’接穗在第119天才检测到植原体。由此可见,枣疯病植原体在地上和地下部分均可以越冬,越冬的植原体向枣树不同类型和不同品种新生组织中的转移扩散速度存在差异,由快到慢为根蘖>自然生枝条>离体水培枝条>嫁接接穗。     

用单克隆抗体检测枣疯病类菌原体

植物类菌原体(MLO)至今未能人工培养,又不易提纯,因而以前所制备的多克隆血清效价低、特异性差,在使用中存在许多问题.枣疯病是枣树生产的重要病害,为了对枣疯类菌原体进行准确、快速、灵敏的检测,我们利用抗枣疯病 MLO 的单克隆抗体采用间接ELISA 方法测定病枣树,获得了满意的结果.本试验所用病枣树样本采自南京中山植物园。病组织在0.05mol/L 碳酸缓冲液     

植原体分类研究进展

目的明确云南元谋地区发生的萝卜花变叶病病原以及赤霉素合成途径中关键酶基因表达量的变化。方法对自然表现花变叶、丛枝和节间缩短的萝卜感病植株总DNA进行植原体16S rRNA基因扩增、克隆、测序及系统进化树构建,并采用实时荧光定量PCR技术分析赤霉素合成及代谢途径中关键酶基因(GA20ox1、GA3ox1和GA2ox1)表达量的变化。结果该植原体株系与16SrII-A亚组相似性最高(0.98),并与16SrII-A亚组中的其他植原体株系明显形成一个进化支。结论萝卜花变叶植原体(Raphanus sativus phyllody,RsPh-YNym)为植原体16SrII-A亚组成员,且与候选种Candidatus Phytoplasma aurantifolia相关,明确了该株系的分类地位;感病植株茎中3种关键酶基因GA20ox1、GA3ox1和GA2ox1表达水平发生了变化,表达量均下调,说明植原体的侵染造成了植株赤霉素稳态被破坏,从而导致植株表型改变。     

植原体病害研究进展

植原体是一种无细胞壁的原核生物,可以感染多种粮食和经济作物,使其出现丛枝、黄化、花变叶、衰退、簇生、矮化、小叶等症状,造成严重的经济损失,对国家粮食安全造成一定的影响。随着人们对植原体研究的深入,可以使用多种技术对植原体进行检测,发现植原体的种类具有多样性,因此对植原体的检测和分类研究从未停止。本文综述了目前为止国内外对植原体的检测、分类及目前植原体基因组研究的研究进展。