实时荧光定量PCR检测犬GAPDH基因

建立犬3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的qPCR检测体系,为犬功能基因mRNA水平的定量分析提供有用的方法学基础。对反应体系进行优化,建立了基于SYBR GreenI染料技术的real-time PCR方法。结果表明,其标准曲线相关系数达到0.999,扩增效率为105.8%,熔解曲线为特异性单峰,组内变异系数（CV%）为0.25-2.8,组间变异系数（CV%）为1.31-2.85。该研究所建立的荧光定量RT-PCR法灵敏、稳定、高效,为犬GAPDH基因作为内参基因用于犬相关基因定量表达分析奠定了基础。     

芜菁实时荧光定量PCR内参基因筛选

为筛选适宜芜菁(Brassica rapa L.ssp.rapa)基因表达分析的内参基因,在ICG(http://icg.big.ac.cn/index.php/Main_Page)中以十字花科作物为参照选择10个候选内参基因。实时荧光定量PCR结果显示ACT、TIP41、Tub-a、UBC30、CyP、UBC21 6个内参基因重复性较好,均能特异扩增并有较高的扩增效率,利用geNorm、NormFinder、BestKeeper和RefFinder软件对内参基因在不同组织中的表达稳定性进行分析,为芜菁基因差异表达研究提供可靠的内参基因,以确保分析结果的可靠性。结果表明,ACT、Tub-a和CyP的M值大于geNorm程序的默认值1.5,稳定性相对较差,6个候选内参基因的表达稳定性排序为:UBC21=TIP41UBC30ACTTub-aCyP,所以,UBC21和TIP41是最稳定的组合。NormFinder的分析结果显示稳定性排序为TIP41ACTTub-aUBC30UBC21CyP,TIP41为最优内参基因,与geNorm分析结果一致,BestKeeper分析结果同geNorm和NormFinder的结果一致。通过RefFinder软件综合分析得出TIP41和UBC21为芜菁不同组织基因表达分析比较理想的内参基因,本研究首次评价了芜菁内参基因的稳定性,为该物种基因表达分析提供了参考。     

实时荧光定量PCR对犬乳腺肿瘤组织VEGF-C基因的定量检测研究

运用实时荧光PCR定量检测了38例犬乳腺肿瘤病例(包括15例良性乳腺肿瘤和23例恶性乳腺肿瘤)、4例正常乳腺组织.结果表明:在犬恶性乳腺肿瘤组织中,VEGF-C表达量明显高于良性乳腺肿瘤和正常乳腺组织,两者差异极显著(P<0.001);在伴有淋巴结转移的犬乳腺癌组织中,VEGF-C基因表达量明显高于没有发现转移的乳腺癌组织,两者差异极显著(P<0.01),但VEGF-C的表达量与肿瘤的大小和发病动物年龄无关.由此表明,VEGF-C在犬乳腺癌组织中的表达量远高于其在正常乳腺和良性乳腺肿瘤组织中的表达,且与淋巴结是否发生转移相关,因此VEGF-C有可能作为乳腺癌转移、复发的预测指标之一.     

虎杖PcMYB1基因实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测虎杖(Polygonum cuspidatum)转录因子PcMYB1基因表达的方法,将PcMYB1基因的ORF片段亚克隆于pUC19载体,得到重组质粒pUC19-PcMYB1,再以pUC19-PcMYB1作为标准样品,建立目的基因的标准曲线,优化qRT-PCR反应体系与反应条件,分析qRT-PCR的灵敏度。结果表明,在qRT-PCR体系中,退火温度为54.1℃时检测结果最好;构建的目的基因标准曲线,其循环阈值与模板拷贝数对数值呈良好的线性关系,扩增效率为92.3%;该方法最低可检测10~1copies/μL的目的基因。     

基于多重PCR的主要食源性致病菌的快速检测

根据单核增生李斯特菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌0157:H7的特异性序列分别设计4对特异性引物,建立了一种快速检测上述4种常见食源性致病菌的多重PCR方法,并对反应体系中的模板、引物、rTaq酶、MgSO_4添加量以及退火温度进行了优化。结果显示:4对引物序列的特异性均较好,利用单重PCR对4种致病菌的灵敏度进行检测,其检测限均达到10~3copies/mL。多重PCR同时检测4种致病菌的灵敏度为10~3copies/ml,对人工污染猪肉中的4种致病菌的灵敏度检测为10~3cfu/mL。该检测方法不与其他菌产生交叉反应,与传统方法相比大大缩短了检测时间,并提高了检测的准确度。     

实时荧光定量PCR技术在检测外源基因拷贝数中的应用

通过对PCR法、Southern Blot法、IPCR法与实时荧光定量法4种转基因外源基因检测方法的比较认为:PCR扩增虽十分灵敏,但有时会出现假阳性扩增,因而对外源基因是否整合还需进行验证.Southren方法准确性高,特异性强,但存在费时、费力的缺点.同时实际操作中就需要较大量的植物材料来提取DNA,而转基因植物的愈伤组织在无菌条件下经过筛选、重新分化后,一般都比较细弱,不宜大量取样.IPCR法虽可以转座突变分离基因,但当转座子作为外源基因通过农杆菌介导等方法导入植物时,由于T DNA整合到染色体中引起插入突变并分离基因造成误差.实时定量PCR技术的特异性和高信噪比为转基因拷贝数定量提供了方便,实时定量PCR法,花费试剂少、节省劳力和时间,需要DNA样品量少、并不进行放射检测.同时对实时荧光定量PCR法计算进行了详细介绍.     

柠檬色百合实时荧光定量PCR内参基因筛选

为筛选柠檬色百合(Lilium leichtlinii)实时荧光定量PCR稳定的内参基因,以柠檬色百合不同发育时期花被片、根、茎、叶和鳞片为试验材料,测定比较总类胡萝卜素含量;使用RT-PCR和荧光定量PCR检测9个候选内参基因(AP4、Actin、β-TUB、CYP、eIF、GAPDH、RH2、UBC和18S)特异性及表达水平,利用geNorm、NormFinder、Bestkeeper、ΔC_T程序和RefFinder网站综合评估候选内参基因表达稳定性;选用八氢番茄红素酶基因PSY对内参基因稳定性进行验证,最终确定合适且稳定的内参基因。结果表明：1)柠檬色百合花被片发育过程中Actin和AP4为9个候选内参基因中最稳定的内参基因,UBC为最不稳定的内参基因。2)柠檬色百合不同器官间eIF和AP4为候选内参基因中最稳定的内参基因,18S为最不稳定的内参基因。3)在柠檬色百合花被片发育过程和不同器官间,以筛选出最稳定的内参基因为参照计算所得PSY基因表达情况与实际测得总类胡萝卜素含量变化趋势一致;以筛选出最不稳定的内参基因作为参照计算所得PSY基因表达情况与总类胡萝...     

实时荧光定量PCR定量方法研究进展

实时荧光定量PCR以其特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点而成为了分子生物学研究中的重要工具,综述了实时荧光定量PCR技术及其定量方法的研究进展,并展望了其应用前景。     

转基因烟草中外源基因实时荧光定量PCR检测方法的建立

[目的]建立SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测转基因烟草中外源基因拷贝数的方法,为转基因植物中外源基因拷贝数的检测提供参考.[方法]采用SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法,检测转基因烟草中外源绿色荧光蛋白基因(GFP)的拷贝数,以烟草单拷贝的内源核糖核酸还原酶基因(RNR2)作为内参基因,建立相对定量的双标准曲线法检测转基因烟草中外源基因拷贝数的方法.[结果]构建RNR2基因、GFP基因实时荧光定量PCR的标准曲线,分别为y=-0.2858x+5.6695和y=0.2826x+2.1048,R2分别为0.9994和0.9989,相关性较高.在检测的5株转基因烟草中GFP基因的拷贝数分别为5、8、19、28和45,非转基因烟草植株的GFP基因拷贝数为0.[结论]建立的转基因烟草中外源基因SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法具有简单、快速、准确等优点,可用于基因工程中对优良转化植株的筛选及外源基因表达量的快速检测和定量分析.     

实时荧光定量PCR法检测抗虫棉历基因拷贝数方法的建立

[目的]建立并完善Taqman实时荧光定量PCR检测转基因抗虫棉Bt基因的方法.[方法]通过Bt基因序列,利用软件Primer5.0设计引物和探针.然后利用10倍系列稀释含有目的基因的质粒pG4AB,进行实时荧光定量PCR反应,制作标准曲线.[结果j抗虫基因拷贝数与Ct值的关系为Ct=-3.549 632X 43.783 512,相关系数R2为0.997 867.[结论]实时荧光定量PCR检测转基因抗虫棉Bt基因的方法具有特异性好、灵敏度高的特点.     

实时荧光定量PCR法检测抗虫棉Bt基因拷贝数方法的建立

[目的]建立并完善Taqman实时荧光定量PCR检测转基因抗虫棉Bt基因的方法。[方法]通过Bt基因序列,利用软件Primer5.0设计引物和探针,然后利用10倍系列稀释含有目的基因的质粒pG4AB,进行实时荧光定量PCR反应,制作标准曲线。[结果]抗虫基因拷贝数与Ct值的关系为Ct=-3.549 632X+43.783 512,相关系数R2为0.997 867。[结论]实时荧光定量PCR检测转基因抗虫棉Bt基因的方法具有特异性好、灵敏度高的特点。     

实时荧光定量PCR检测转基因玉米MON88017

为完善中国转基因生物及产品定量分析标准化技术体系,保障中国生物安全和降低生态风险,本研究建立了转基因玉米MON88017及产品的实时荧光定量PCR分析方法,并用特异性、准确度、灵敏度以及测量不确定度等指标评价了该方法。结果显示该方法分析转基因玉米MON88017特异性很强;29次重复测量含量为1.50%的转基因玉米MON88017样品,平均测量值(1.541%)接近真实值(1.50%),相对偏差为2.70%,测量值的变异系数为0.110 4,回收率为100.00%,测量不确定度为0.096;在97.5%的置信水平下能检测到最低含量为5个拷贝的MON88017分子片段。因此,本研究建立的转基因玉米MON88017实时荧光定量PCR方法具有较高的特异性、准确度和灵敏度,能为中国转基因生物安全监管提供良好的技术支撑。     

猪GAPDH基因实时荧光定量PCR方法的建立

根据GenBank上猪GAPDH基因的序列设计并合成一对引物,采用SYBR GreenⅠ染料建立了Real-time PCR方法。以阳性重组质粒为标准品,建立了标准曲线,并进行了融解曲线分析。结果表明,所建立的方法具有快速、高通量、线性范围广以及重复性强等特点。研究结果为GAPDH作为内参基因用于猪相关基因定量表达分析奠定了基础。     

实时荧光定量PCR技术的实验研究

实时荧光定量PCR技术是在普通PCR定性技术基础上发展起来的核酸定量技术,已广泛应用于不同研究领域。论述了荧光定量PCR技术的基本原理、主要类型和定量实验方法,探讨了实验条件的控制、影响因素和优化实验结果的方法。     

CPT-I基因荧光定量PCR检测方法的建立

CPT-ImRNA的表达对研究奶牛肝脏脂肪酸氧化代谢具有重要作用,CPT-I在肝脏中脂肪酸从细胞浆转移到线粒体过程中起关键作用。本研究应用双标准曲线方法,建立了CPT-I基因的相对荧光定量方法。结果表明,所建立的SYBRGreenI荧光定量PCR方法检测CPT-I基因具有较好的效果,为肝细胞CPT-I基因定量分析奠定了基础。     

烟草花叶病毒实时荧光定量PCR检测体系的构建

[目的]防止隐症携带烟草花叶病毒(TMV)的烟苗移栽到大田造成产量损失。[方法]根据TMV的外壳蛋白(coat protein, CP)基因保守序列设计引物及探针,通过绘制标准曲线、重复性、特异性及灵敏性分析,建立了一种TMV的TaqMan-qPCR检测方法。[结果]该方法特异性好,与其他常见的烟草病毒无交叉反应;灵敏度高,检测下限可达到4.53×10¹ copies/μL,比常规RT-PCR检测灵敏度提高了10倍;建立的标准曲线斜率为-3.299,决定系数(R²)为0.993 3,扩增效率为100.97%,且循环阈值(Ct)与质粒标准品浓度之间线性关系良好,重复性试验结果可靠。[结论]利用建立的TaqMan-qPCR检测方法与常规RT-PCR检测方法同时检测烟苗样品,检测结果一致,进一步验证了荧光定量PCR方法的可靠性。     

云南省十字花科蔬菜根肿病的实时荧光定量PCR检测

根肿病是十字花科蔬菜严重的土传病害之一。为快速和准确的检测根肿病菌在土壤中的含量,本研究利用实时荧光定量PCR技术,结合传统的生物学测定方法对云南省十字花科蔬菜基地22份土壤样品进行了检测。结果表明:土壤孢子数量和病情指数呈线性相关,随着土壤中根肿病孢子数量增加,生物学测定的病情指数也随之增加;所检测的土壤中孢子密度最高为110sup8.96 g-1,病情指数为95.56%,最低为1103.12 g-1,相应的病情指数为3.33%。该方法可以快速检测和定量土壤中病原菌,为种植十字花科蔬菜土壤的检测预报提供了有效的技术手段。     

实时荧光定量PCR筛选鸡基因表达最佳内参基因

为筛选在鸡基因表达时稳定表达的内参基因,本试验以6、14、22及30周龄的地方品种固始鸡与6周龄的商业品种罗斯308肉鸡为试验动物,以B2M、28S、GAPDH、β-actin及HSP70为候选内参基因,利用qRT-PCR对这5个候选内参基因的相对表达量进行测定,通过独立评价软件geNorm、NormFinder、SP...