大豆凝集素和脂肪氧化酶双价RNAi表达载体的构建及其遗传转化

【目的】应用RNA干扰技术,同时抑制大豆凝集素(Soybean agglutinin,SBA)和脂肪氧化酶(Lipoxygenase,Lox)基因在种子中的表达,改良大豆营养品质,为培育优质大豆材料奠定基础。【方法】根据RNAi原理,酶切获得Lox目的片段,构建以除草剂Bar基因为筛选标记、种子特异性启动子P7αP启动SBA和Lox双干扰的pCAMBIA3301-SBA-Lox(pSBA-Lox)干扰表达载体,并通过农杆菌介导法转化大豆(品种为吉农28),采用PCR、Southern杂交和实时荧光定量PCR对转基因植株进行检测。【结果】质粒PCR和酶切鉴定结果表明,双价RNAi植物表达载体pSBA-Lox构建成功。将其转入到大豆中,对转化植株进行PCR、Southern杂交检测,结果显示,外源基因以单拷贝形式整合到植物基因组中,并能遗传给后代。T1代转基因植株的实时荧光定量PCR分析显示,转基因植株中SBA基因和Lox基因在籽粒中的表达量比未转化受体植株均明显降低,SBA基因表达量降低了35.9%~47.2%,Lox基因表达量降低了32.8%~56.1%,而在幼嫩叶片中的表达量相比对照植株变化不大。【结论】获得了大豆凝集素和脂肪氧化酶表达量均明显降低的T1代转基因大豆。     

水稻osvdac基因RNAi表达载体的构建及遗传转化

[目的]构建水稻osvdac3和osvdac5基因RNA干涉表达载体,获得转干涉载体的转基因水稻植株。[方法]采用TRIzol法提取水稻幼苗总RNA,以反转录的cDNA为模板,扩增得到osvdac3和osvdac5的分别靠近5’端和3’端约500～600bp的特异序列,用Gateway重组克隆技术构建RNA干涉表达载体,采用农杆菌介导的愈伤组织侵染法进行遗传转化。[结果]成功构建水稻2个osvdac3和2个os-vdac5基因RNA干涉表达载体,并获得转osvdac3干涉载体的阳性植株。[结论]干涉osvdac3和osvdac5的植株为研究其功能提供材料。     

烟草atp9基因RNAi表达载体的构建及遗传转化

atp9基因是烟草的雄性不育相关基因。为研究atp9基因的功能及其在烟草雄性不育形成中的作用,根据atp9基因全长序列,设计特异性引物,扩增正、反义干扰片段,将长度为239bp的atp9基因的正、反向干扰片段分别连接到linker片段的两侧,最后插入到植物表达载体pCAMBIA1301中,成功地构建了atp9基因的RNAi表达载体。利用农杆菌介导法将其转化烟草保持系品种中烟90,结果证明atp9基因的RNAi表达载体已整合到中烟90基因组中。经抗性筛选以及分子检测最终获得41株转pCAMBIA1301-atp9-RNAi烟草植株,其中阳性烟草有20株,转化率为48.8%。研究结果为下一步验证atp9基因的功能及其在烟草雄性不育形成中的作用奠定了基础。     

Pi-ta+和Bchi基因双价表达载体构建及水稻的遗传转化

稻瘟病是水稻上最重要的病害之一.本研究所用Pi-ta+基因是一个来自景洪直立型紫秆普通野生稻的基因,该基因属于稀有的抗稻瘟病Pi-ta+等位基因,具有抗稻瘟病的能力;几丁质酶是一种以几丁质为底物的水解酶,它可以降解病原真菌细胞壁中的几丁质,破坏细胞新物质的沉积使病原体死亡.为获得抗稻瘟病的水稻新材料和进一步培育聚合多个抗稻瘟病基因的转基因水稻新品种,本研究采用一种新的方法构建了Pi-ta+和Bchi的双价表达载体pCAMBIA1300-Pi-ta+-Bchi,通过农杆菌介导法转入栽培稻品种云资粳41中,经过一定浓度的甘露糖筛选培养,分化得到的再生苗经氯酚红显色法和PCR检测,获得11棵转基因阳性植株,离体检测证明外源基因的导入增强了转基因水稻的稻瘟病抗性.     

水稻TWH基因RNAi载体的构建及遗传转化

根据RNAi表达载体的设计原则,以TWH基因为靶基因,将长度253 bp目的片段通过正反两个方向插入表达载体pR1301中,构建RNAi表达载体pR1301-TWH.通过根癌农杆菌EHA 105介导法将其导入水稻品种武育粳3号,获得34株阳性转基因植株,为进一步深入研究TWH基因功能奠定了基础.     

水稻OsLecRK基因RNAi载体的构建及遗传转化

凝集素类受体蛋白激酶(Lectin-like receptor kinase,Lec RK)是一类植物特有并分布广泛的蛋白激酶。采用RT-PCR从水稻(Oryza sativa L.)品种B5中克隆了Os Lec RK基因靠近翻译起始位点下游的530 bp的特异基因片段,将该片段以正、反向分别连入p KANNIBAL载体,从而获得p KAN-Os Lec RKRNAi的中间表达载体,进而将其克隆到植物双元表达载体p CAMBIA1301中,构建ds RNAi表达载体p CAMBIA-Os Lec RK-ds RNAi。经酶切和测序鉴定正确后,利用农杆菌介导转化水稻,通过抗性筛选和标记基因hyg进行PCR鉴定,筛选出12株转基因水稻植株。     

OsWAX2基因的植物表达载体构建及遗传转化

利用拟南芥的WAX2基因序列,BLAST检索出3个水稻同源基因,分别命名为OsWAX2-1,OsWAX2-2,OsWAX2-3,与拟南芥WAX2基因的同源性分别为56.0%,55.2%,52.0%;其预测的编码蛋白与WAX2蛋白的同源性分别为61.5%,60.5%,64.7%.这3个蛋白都存在4个跨膜结构和2个固醇去饱和酶的保守区,说明这3个蛋白质都属于跨膜蛋白,并可能与角质层的蜡质合成有关.从全长cDNA数据库检索获得了3个OsWAX2的全长cDNA.以pCAMBIA-1300-multi为载体,构建了CaMV35S启动子驱动的3个OsWAX2的过表达载体pOEOSW2-1,pOEOSW2-2,pOEOSW2-3及3个RNAi表达载体pCROSW2-1,pCROSW2-2,pCROSW2-3,并通过冻融法将6个表达载体转化到根癌农杆菌EHA105,LBA4404和GV3101中,采用农杆菌介导法进行水稻日本晴品种的遗传转化,得到了具有Hyg抗性的水稻转基因苗,PCR检测到阳性植株.     

百合AGPase基因RNAi载体构建及遗传转化研究

【目的】AGPase基因可在百合鳞茎膨大发育过程中影响淀粉的合成代谢,从而调控鳞茎发育,构建干扰AGPase基因RNAi载体并遗传转化进行反向下调作用研究,可为该调控机制的研究提供更多信息。【方法】克隆300 bp的AGPase基因保守序列,利用Gateway技术通过BP反应将该序列插入入门载体p DONR221,进行LR反应将该序列正反向插入干扰载体p Jawohl8-RNAi中,经过酶切鉴定所构建RNAi载体的正确性;并通过农杆菌介导法转入百合组培苗中,PCR检测RNAi载体转化农杆菌,荧光定量PCR检测农杆菌转化植株的AGPase相对表达量变化。【结果】成功构建p DONR221-AGPase入门克隆与p Jawohl8-RNAi-AGPase表达载体,遗传转化百合愈伤诱导出AGPase表达量下调的转化植株。【结论】采用Gateway技术可方便构建RNAi表达载体,选择的AGPase保守序列能作为干扰片段对百合AGPase自身转录的mRNA进行下调。     

可用于植物转化的RNAi载体构建方法

利用PCR方法扩增杨树Poptr;CYCD1;1基因的一段内含子序列,并克隆到pROKⅡ载体中,以构建可用于植物特定基因表达干扰的RNAi载体。为了验证载体的效果,构建pCAMBIA-1303载体转化烟草,经检测,转基因烟草能过量表达外源GUS与GFP融合蛋白。把GUS及GFP片段序列连接于RNAi载体,并导入pCAMBIA-1303载体转化烟草。试验结果表明,GUS及GFP干扰序列的导入均能大大降低外源GUS与GFP融合基因的表达。结果说明构建的载体能有效干扰特定基因的表达。     

烟草orf25基因植物表达载体的构建及遗传转化

为更好地研究烟草雄性不育的机理,构建orf25基因的植物表达载体。orf25基因是ATP合成酶F(0)部分的4个亚基因之一。以雄性不育烟草MS革新3号为受体材料,利用组成型启动子Ca MV35S构建orf25基因植物表达载体,将表达载体p BI121-orf25导入根癌农杆菌LBA4404。采用根癌农杆菌介导orf25基因遗传转化MS革新3号,结果证明载体上的目的基因orf25已整合到烟草基因组中,并获得了52株转p BI121-Ca MV35Sorf25基因烟草植株,经PCR鉴定,转基因阳性植株有14株,转化率为26.9%。为下一步研究该基因的功能及其与烟草雄性不育性的关系提供依据。     

一种植物RNAi双元载体的构建

[目的]为利用RNAi技术研究植物基因组功能奠定基础。[方法]通过PCR技术克隆一系列RNAi双元载体所需要的元件：绿色荧光蛋白基因（gfp）、花椰菜花叶病毒启动子（CamV35S）、氨基糖苷3＇-腺苷酰基转移酶基因（aada）、胭脂碱合成酶基因终止信号（nos）,并进行组装,在双元载体质粒pCAMBIAl301的基础上构建目的载体。[结果]通过7种中间载体的构建,最后成功得到双元载体质粒pHBMT14。[结论]该载体的成功构建为以后的植物基因组功能研究提供了技术平台。     

猪肝脏BHMT基因植物表达载体构建及玉米遗传转化

甜菜碱高半胱氨酸甲基转移酶(BHMT)是一种甲基代谢酶,在动物和微生物体内存在,能催化甜菜碱向高半胱氨酸转移甲基,促进甲硫氨酸形成。本试验通过RT-PCR扩增猪肝脏BHMT基因ORF的cDNA序列,成功构建了p3301-BHMT植物表达载体,并利用农杆菌介导法转化玉米萌动胚,经PPT筛选和PCR检测,初步确定获得4株抗性植株。试验结果将为研究BHMT基因在植物中的作用,提高玉米甲硫氨酸含量和抗逆性提供试验材料。     

pCAMBIA2300-betA-BADH双价基因植物表达载体的构建

将载体pCAMBIA2300-35s-OCS进行改造,增加了酶切位点Sac Ⅰ,之后,PCR扩增编码胆碱脱氢酶(CDH)的基因并用Sma Ⅰ和Xba Ⅰ将其与改造后的pCAMBIA2300-35s-OCS连接,得到单价植物表达栽体p2300-gz-betA.再通过Sal Ⅰ、Hind Ⅲ、Sac Ⅰ等酶切位点将编码甜菜碱醛脱氧酶(BADH)的基因及其启动子和终止序列连接到栽体p2300-gz-betA上,最终得到pCAMBIA2300-betA-BADH双价植物表达载体,并将其导入根癌农杆菌GV3101和LBA4404.betA和BADH是编码甜菜碱合成途径的两个关键酶的基因(CDH和BADH),也是近年来研究较多的耐盐基因,其双价植物表达栽体应用于遗传转化后,有望进一步提高转基因植物的耐盐性.     

虾青素合成关键酶基因bkt和CrtR-B双价植物表达载体的构建及对花生的遗传转化

虾青素是一种具有极强抗氧化活性的类胡萝卜素,具有广泛的应用价值。β-胡萝卜素酮化酶(BKT)和β-胡萝卜素羟化酶(CrtR-B)是虾青素的生物合成途径中的两个关键酶。采用LaTaqDNA聚合酶用PCR的方法分别从pET-28a(+)-bkt,pET-28a(+)-CrtR中扩增得到bkt和CrtR-B基因,用bkt基因替换pBI221中的GUS基因形成含有CaMV 35S启动子和NOS终止子的bkt基因表达盒,然后插入植物表达载体pCAMBIA1301的多克隆位点,再用CrtR-B基因替换pCAMBIA1301中的另一个GUS基因,形成CrtR-B基因表达盒,最终获得带有抗性基因的双价植物表达载体pCAMBIA1301-bkt-CrtR。通过农杆菌EHA105介导将其转入花生(花育23),获得了经卡那霉素筛选的抗性植株,通过PCR扩增验证,花生基因组中含有这两个基因。     

大豆胰蛋白酶抑制剂和脂肪氧化酶基因双价RNAi表达载体的改造及转化

【目的】应用RNA干扰技术同时抑制大豆脂肪氧化酶(Lox)和胰蛋白酶抑制剂(KTi)基因的表达,改良大豆品质,培育缺失Lox和KTi的大豆新材料。【方法】应用RNAi原理,以双价RNAi植物表达载体pCAM-BIA1301-KtiRi-LoxRi为基础,以植物表达载体pCAMBIA3301的质粒DNA为模板,利用CaMV35S启动子的上游引物和CaMV35S终止子的下游引物,PCR扩增含有除草剂抗性基因bar的整个表达原件,然后将其插入到pCAM-BIA1301-KtiRi-LoxRi中,构建以除草剂为筛选标记的双价RNAi表达载体,并通过花粉管通道法转化至大豆吉农18、吉农28和吉农27 3个品种中,对转基因植株进行PCR、Southern杂交、RT-PCR分子水平检测和除草剂抗性检测。【结果】质粒PCR和酶切鉴定以及测序结果表明,双价RNAi植物表达载体pCAMBIA1301-KtiRi-LoxRi-bar构建成功。将其转入到大豆中,分别获得吉农18、吉农28、吉农27T1代籽粒47,25和86粒,以及T2代转基因植株50株。RT-PCR结果表明,转基因株系中脂肪氧化酶和胰蛋白酶抑制剂mRNA积累受到明显抑制。【结论】获得了转pCAMBIA1301-KtiRi-LoxRi-bar的T2代转基因大豆。     

HARDY基因植物表达载体的构建及在番茄中的遗传转化

HARDY(HRD)是AP2/ERF-like家族转录因子的一员,已有的研究表明它的过量表达可以增强水稻的抗旱性、提高水稻的水分利用效率.为了研究它是否在其他的农作物中具有普遍的适用性,本试验从拟南芥中克隆了HRD基因,成功构建了HRD基因的高效植物表达载体pBIN-HRD.采用农杆菌介导法转化番茄(亚心87-5),经PCR、RT-PCR分析表明,阳性的转HRD基因植株已获得表达.     

巴西橡胶树HbMT2植物表达载体的构建及遗传转化烟草

将巴西橡胶树金属硫蛋白基因HbMT2插入到植物表达载体pCAMBIA 1304,得到HbMT2基因的植物表达载体pCAMBIA1304-HbMT2.通过电击法将该载体导入根癌农杆菌菌株中并转化烟草.将获得的具有潮霉素(Hyg)抗性的再生植株进行PCR鉴定.结果表明目的基因已经整合到烟草基因组中.抗逆性分析试验显示,转基因烟草对H202处理和紫外线照射耐受性显著提高;重金属离子胁迫下,转基因烟草叶绿素含量、过氧化物酶和过氧化氢酶活性明显高于对照.     

小黑杨PnsICE1基因的植物表达载体构建及遗传转化

[目的]构建PnsICE1基因的植物表达栽体,并进行拟南芥遗传转化,以期为进一步研究小黑杨PnsICE1基因功能提供材料.[方法]以pROKⅡ载体为骨架,利用In-Fusion连接方法构建由CaMV35S调控的小黑杨PnsICE1基因植物表达载体,用农杆菌介导法对拟南芥进行遗传转化.[结果]通过PCR检测,结果证明PnsICE1基因已整合到拟南芥基因组中,获得3株转PnsICE1基因拟南芥.[结论]植物表达载体的构建及转基因植株的获得为研究小黑杨PnsICE1基因功能提供材料.     

无花果ACS1基因RNAi植物表达载体构建

通过构建无花果ACS1基因的RNA干扰植物表达载体,为研究ACS基因的功能及采用生物技术方法培育无花果耐贮新品种奠定基础。本试验根据已克隆的无花果ACS1基因序列及植物表达载体pBI221、pBI121的酶切位点,设计2对带相应酶位点的特异性引物,以测序质粒为模板,进行PCR扩增,获得正、反向扩增片段,分别正、反向插入到pBI221载体中的CaMV35S启动子和gusA基因之间,构建成无花果ACS1基因的RNAi中间表达载体。再将中间载体中的正、反向片段和gusA基因以双酶切方式连接到表达载体pBI121上,构建成pBI121-RNAi-ACS1植物表达载体。通过各种限制性内切酶的酶切鉴定,成功构建了无花果ACS1基因的RNA干扰植物表达载体。     

抗CMV和ToMV RNAi载体的构建及加工番茄遗传转化

【目的】利用农杆菌介导法将抗CMV和ToMV的RNAi表达载体pBi35STC12转入红番3号加工番茄,获得抗CMV和ToMV的加工番茄植株,为加工番茄病毒病的防治奠定基础。【方法】采用RT-PCR扩增,选取新疆加工番茄CMV分离物NS0-4 1a复制酶第1 051-1 350bp序列和ToMV分离物SCS-2 130/180ku复制酶第1 920-2 200bp序列,作为干扰片段CR12和To12。通过T克隆载体将CR12和To12连接成拼接片段TC12,构建成含反向重复结构拼接片段的RNAi表达载体pBi35STC12。通过农杆菌介导法,用其转化红番3号加工番茄,经过筛选、PCR检测得到转基因植株。【结果】成功构建了抗CMV和ToMV的RNAi表达载体pBi35STC12,并用其转化番茄植株,从转化的1 500个愈伤组织中获得33株再生植株,利用PCR对再生植株进行检测,显示从33株再生植株中获得了19株转基因植株,转化率为1.26%。【结论】构建了抗CMV和ToMV的RNAi表达载体pBi35STC12,用其转化红番3号加工番茄,获得了转基因植株。