中国兔病毒性出血症病毒衣壳蛋白基因的克隆及遗传变异分析

对中国兔病毒性出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus, RHDV)JX/97株的衣壳蛋白基因进行了克隆和测序。结果表明，该蛋白的核苷酸序列长度为1739 nt，推导的氨基酸序列为579 aa。利用分子生物学软件分析了该病毒与国内外22株RHDV的基因序列，结果显示，RHDV不同分离株之间的序列同源性几乎都在90％以上。衣壳蛋白基因的系统发生树分析结果表明，所选的RHDV参考毒株按照一定的遗传距离，可以分为4个基因群，基因群之间的距离有加大的趋势，表明RHDV受环境的影响有向不同方向演变的趋向，即RHDV在长期适应特定环境的过程中，有可能逐渐演变成各具特色的RHDV。     

兔出血症病毒NJ85株衣壳蛋白基因在原核系统中的高效表达

从兔出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV)中国早期流行株NJ85中成功地克隆出衣壳蛋白(VP60)基因。序列分析表明该基因长度为1740nt，编码579aa，与已报道的另2个RHDV中国毒株WX84和TP的VP60基因的同源性分别为92．7％和97．2％。构建了NJ85株VP60基因原核表达质粒pET—VP60，用SDS—PAGE分析，重组VP60蛋白的表达量占菌体总蛋白的40％，分子量约62kD，在菌体内以包涵体形式存在。免疫印迹实验表明，重组VP60蛋白与RHDV抗体反应形成1条带，证明它具有抗原性。     

猪流行性腹泻病毒纤突蛋白基因克隆与序列分析

对猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)DX株纤突蛋白基因进行了克隆与测序。结果表明,该基因核苷酸序列长为4152bp,推导氨基酸序列为1383aa,与比较毒株氨基酸同源性都在90%以上。系统发生树分析结果表明,比较毒株可分为3个基因群,而且每个群的毒株均来自同一个国家。利用生物软件分析结果表明PEDV发生微小的变异,尤其在韩国变异明显,而DX株与中国JS-2004-2株亲缘关系很近。     

猪圆环病毒2d亚型衣壳蛋白在昆虫细胞中的表达

为了在昆虫细胞中表达猪圆环毒病2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)衣壳蛋白,本研究设计合成引物从临床病料中扩增获得猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV)山东株衣壳蛋白基因缺失核定位区的序列,并进行序列分析.将该片段克隆到杆状病毒供体载体pFastBac-1上,然后转化大肠杆菌(Escherichia coli) DH 10-Bac感受态细胞,获得重组穿梭杆粒,将该杆粒转染到sf9昆虫细胞中,观察重组杆状病毒致细胞病变效应,并采用PCR、间接免疫荧光实验、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)和Western blot鉴定衣壳蛋白的表达情况.结果表明,扩增获得的猪圆环病毒山东株属于PCV2d亚型,与我国目前使用的商品化疫苗株(PCV2a及PCV2b亚型)在160～180 aa抗原位点有差异.成功构建了重组供体质粒pFastBac l-PCV2d-Cap和重组穿梭杆粒Bacmid-PCV2d-Cap,获得的重组杆状病毒在昆虫细胞中成功表达了约24 kD的PCV2d-Cap,该蛋白可以与猪圆环病毒阳性血清及His标签抗体发生反应,证明具有良好的反应原性.本研究是我国首次采用杆状病毒系统表达PCV2d亚型衣壳蛋白,为制备PCV2d亚单位疫苗以及酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒、防范PCV2d亚型流行提供了理论依据.     

猪源冠状病毒纤突蛋白基因的克隆与特征

摘要:对猪源冠状病毒PEDV DX株纤突蛋白基因进行了克隆与测序。结果表明该基因核苷酸序列长为4152 nt, 推导氨基酸序列为1383aa，与比较毒株氨基酸同源性都在90%以上。系统发生树分析结果表明，比较毒株可分为3个基因群，而且每个群的毒株均来自同一个国家。利用生物软件分析结果表明PEDV发生着微小的变异，尤其在韩国变异明显，而DX株与中国JS-2004-2株亲缘关系很近。     

传染性喉气管炎病毒北京株胸苷激酶基因的克隆和序列分析

传染性喉气管炎病毒（infectous laryngotracheitis virus,ILTV)是一种能感染鸡（Gallina)群，导致产生急性上呼吸道感染的α－疱疹病毒。ILTV对鸡群的感染率约为100％，致死率约为40％，致死率约为40％，胸苷激酶(thymidine kinase,TK)基因是疱疹病毒的一个重要的毒力基因，该基因的删除有助于构建缺失tk基因的重组ILTV。为了得到缺失tk的重组ILTV病毒。报道了ILTV北京E2株的tk基因的克隆和测序，并分析了该序列与其它已经发表的其它ILTV毒株tk基因之间的同源性。由DNA序列推导TK的氨基酸序列，并将该序列与其它疱疹毒TK氨基酸序列的同源性进行了分析，可以看到这疱疹病毒TK氨基酸序列在某些区域出现较高的同源性。     

PCV2衣壳蛋白羧基端基因在T4噬菌体表面的展示

用PCR扩增猪圆环病毒II型广东分离株的衣壳蛋白羧基端基因,将PCR产物连接到重组型质粒pR上,转化DH5α细胞并筛选阳性克隆;重组质粒经PCR鉴定并测序后,转化E2菌,将重组E2菌与缺陷型噬菌体T4-Z1同源重组后,得到重组噬菌体,SDS-PAGE和Westernbloting分析,表明衣壳蛋白基因在噬菌体表面正确展示,表达的融合蛋白的分子量约为25Ku。     

鸡传染性法氏囊病毒Ts、OH毒株、鱼传染性胰脏坏死病毒DRT毒株的同源性分析

用幼鸡成纤维细胞繁殖鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)Ts毒株,病毒颗粒经提纯后提取基因组dsRNA.根据已报道的加拿大OH株序列设计引物,用RT-PCR进行 cDNA扩增,获得976 bp、774 bp和997 bp的三个部分重叠的片段,分别克隆于pGEM-Teasy载体,利用SP6,T7特异引物及PCR引物进行序列分析,并连接为一个完整的大片段.结果表明,所克隆片段为2 665 bp的IBDV VP1基因的大开放读框.序列分析表明:Ts株与OH株的核苷酸序列同源性为91 %;与DRT毒株的氨基酸序列同源性为42.5 %.尽管Ts株与DRT株的整体同源性很低,但在VP1蛋白的中部仍发现有高同源区段.在两种病毒中均发现与GTP结合蛋白、依赖于RNA的RNA聚合酶(RdRp)相关的保守序列.然而,与单链RNA病毒不同的是:作为RdRp家族特征的G-D-D序列在两种病毒中都未发现.     

新城疫病毒F48E8株核衣壳蛋白基因在鸡痘病毒中的表达及其部分序列分析

通过反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增了新城疫病毒(NDV)F48E8株核衣壳蛋白(NP)基因,并克隆到pUC18中,得阳性克隆pUCNP.应用分子克隆技术,将NP基因导入鸡痘病毒(FPV)转移载体pFG1175-1中P7.5启动子的下游,得到含NDV NP基因的质粒pFGNP1175-1.利用脂质体转染技术,将该质粒转染FPV疫苗株282E4感染3～4 h的鸡胚成纤维细胞,采用蓝斑筛选方法纯化多次,得到稳定的重组FPV.用狄高辛标记的探针进行斑点杂交实验,结果表明pFGNP1175-1已与FPV 发生同源重组;用抗NDV的SPF鸡的阳性血清进行间接免疫荧光实验,证实重组FPV在感染细胞中表达了F48E8株NP蛋白.该基因两端部分序列与已发表的D26株NP基因对应区域的核苷酸同源性为89.1%,推断的氨基酸同源性则为93.1%.     

腾冲红花油茶花蜜蛋白1,6-二磷酸果糖醛缩酶的鉴定、克隆与分析

为鉴定出花蜜中某些影响花蜜化学组成的功能蛋白,并探讨其在花蜜分泌及组分调控过程中的功能,以腾冲红花油茶为试验材料,利用MALDI-TOF/MS质谱分析方法初步鉴定出腾冲红花油茶花蜜中含有1,6-二磷酸果糖醛缩酶(FBP2),然后根据质谱得到的部分肽段序列设计特异性引物,采用SMART RACE方法克隆腾冲红花油茶花蜜FBP2全长cDNA,命名为CRFBPase (GenBank登录号:MG764086)。序列分析表明,该cDNA全长1 077 bp,编码358个氨基酸,分子质量为38 428.13 Da,等电点为7.56。经同源比对分析发现CRFBPase基因序列与普通油茶的FBP2基因序列同源性高达98.8%,同时酶活检测结果也进一步证实该花蜜中含有FBP2,且该酶的活性会随着花蜜分泌累积时间的延长而增加。实时荧光定量PCR结果显示,CRFBPase基因在开花后第5天的蜜腺和花部组织中均有一定量的表达且蜜腺中表达量最高,开花后第5天(泌蜜高峰期)蜜腺显著高于花蕾期。本研究结果为进一步揭示FBP2在植物花蜜形成、分泌及糖组分调控过程中的作用机制提供了一定的理论依据。     

一株信鸽新城疫强毒的分离鉴定和分子特性分析

从发病鸽的体内分离到一株新城疫病毒（Newcastle Disease Virus，NDV）PB9601，经病毒蚀斑克隆纯化后动物回归试验可产生典型的NDV病变，其MDT、ICPI、IVPI分别为50.5、1.65和2.36，表明为NDV强毒。对其F和HN蛋白分别进行基因克隆测序，发现F蛋白多肽裂解位点的序列为111 KRQKRF 117，符合鸽源NDV强毒氨基酸基序。F基因分型及同源性比较显示：PB9601与YN-03、TW-98等鸽源毒株属于VI型，其F基因与基因Ⅱ型疫苗株LaSota氨基酸同源性为88.6%，与基因Ⅰ型疫苗株V4的氨基酸同源性为91.0%，与基因Ⅸ型传统强毒F48E9等的氨基酸同源性为90.6%；与国内鸽分离株GX-05、YN-03、TW-98的氨基酸同源性分别为92.1%、95.5、98.6%、与国外鸽分离株Capital3-97、Tigre6-99、1166-00、IT-227-82、2736-00的同源性分别为93.3%、91.9%、94.6%、95.1%、93.6%。HN基因氨基酸同源比较显示：PB9601与LaSota、F48E9、V4等的氨基酸同源性分别为87.2%、89.2%、87.6%；与国外鸽分离株1166-00、IT-227-82、2736-00的同源性为93.7%、95.5%、92.3%。由此看出PB9601与国内外分离株、LaSota、F48E9、V4等相比，具有明显的地域性和种属性。     

从烟草上分离的中国番茄曲叶病毒及其卫星DNA全基因组结构特征

本研究从具有典型曲叶病症状的广西靖西烟草病植株上分离到病毒分离物JX-2,全基因组序列测定结果表明,JX-2DNA．A全长2738个核苷酸,共编码6个开放阅读框架（openreadingframes,ORFs）,其中病毒链编码AV1（CP）和AV2两个ORFs,互补链编码AC1、AC2、AC3和AC4共4个ORFs。BLAST结果表明,JX-2DNA—A与中国番茄曲叶病毒（Tomato leaf curl Chinavirus,ToLCCNV）各分离物的相似性在93．0％-99．7％之间,其中与ToLCCNV广西番茄分离物ToLCCNV．G32的相似性最高,达99．7％,而与其它双生病毒的同源性均在88．0％以下,表明Jx-2是ToLCCNV的一个分离物。基于Jx-2和已报道的双生病毒属代表种DNA-A全基因组核苷酸序列构建的系统进化树显示,JX-2与ToLCCNV-G32分离物的亲缘关系最近,并与ToLCCNV其它分离物形成一个分支,而与其它10种双生病毒的亲缘关系均相对较远。利用双生病毒卫星DNAβ的特异性引物β01／β02在Jx-2样品中扩增到DNAβ分子（JX-2β）,全长为1341个核苷酸,其互补链编码1个ORF（即βC1）,并包含一个富含A序列和一个卫星病毒保守序列。序列分析表明,JX-2β与ToLCCNV伴随的DNAβ的相似性在91．0％～96．1％之间,其中与ToLCCNV-G61DNAβ和ToLCCNV—G18DNAβ的相似性最高（96．1％）,与其它卫星DNAβ的相似性均低于61．8％。基于JX-2β全基因组核苷酸序列构建的系统进化关系树显示,JX-29与ToLCCNVG61分离物伴随的DNAβ亲缘关系最近,并形成一个独立的分支,再与ToLCCNV其余两个分离物伴随的DNAβ形成一个较大的分支。这是首次报道从烟草中分离到的中国番茄曲叶病毒及其伴随卫星DNA分子的全基因组结构特征。     

柑橘速衰病毒CP基因的序列变异性分析

以提取的宽皮橘(Citrus reticulata Blanco)总RNA为模板，用RT-PCR扩增柑橘速衰病毒(Citrus tristeza virus, CTV)的外壳蛋白基因(CP )，扩增产物经克隆与测序证实，来自湖南道县和江西崇义的3份样品(HN、JX-1和JX-2)都感染了CTV。单链构象多态性(single-strand conformation polymorphism, SSCP)分析表明，来源于3份样品的CTV的CP基因在遗传上存在变异，其中来自HN和JX-1的CTV的CP基因序列仅含有1种序列类型，而来自JX-2的CP基因序列群体则含有2种主序列。序列分析表明，克隆HN-K与葡萄牙分离物28C和以色列茎陷分离物VT的同源性均为98%；克隆JX-1-1与印度茎馅分离物Pune和Bangalore的同源性分别达98%和99%；克隆JX-2-7、JX-2-17与日本苗黄分离物NUagA和美国加利福尼亚严重茎陷分离物SY568相比，同源性为97%%~98%；4个克隆与佛罗里达速衰分离物T36、弱毒分离物T30和西班牙弱毒分离物T385的同源性仅有91%%~93%。系统发育分析显示，4个中国克隆分属3个不同的族，与地理起源不同的茎陷或苗黄分离物的亲源关系更近，而与速衰和弱毒分离物的亲源关系更远，暗示CTV的地理起源与其核苷酸距离之间没有相关性。     

Unravelling the paradox of rabbit haemorrhagic disease virus emergence, using phylogenetic analysis; possible implications for rabbit conservation strategies

During the past 50 years two readily distinguishable rabbit-specific diseases caused by Myxoma virus (MYXV) and Rabbit haemorrhagic disease virus (RHDV) respectively, have decimated wild rabbit populations worldwide. Combined with the use of these viruses as biocontrol agents, the consequences for farming, commercial rabbit breeding and rare habitat conservation dependent on rabbit grazing, have been both positive and negative. Moreover, rare predators that rely on rabbits as a food resource, and even hunters, have suffered the consequences of rabbit populations being affected by one or other of these viruses.Rabbit haemorrhagic disease virus was first identified after thousands of domestic rabbits died suddenly in China in 1984. Similar epidemics subsequently occurred in other regions of Asia, the Middle East, Europe and North America, suggesting that the virus had dispersed widely following its emergence in China. However, the discovery that RHDV had circulated apparently harmlessly for many years before the first recognised epidemic in China prompted us to investigate the evolution, emergence and dispersal of this virus in relation to its impact on conservation of wildlife species. Accordingly, we have sequenced new isolates of RHDV and combined these data with a global selection of available RHDV sequences. Using phylogenetic analysis we demonstrate that the Chinese epidemic virus diverged from European viruses that circulated many years prior to 1984. We also demonstrate that the lineages of the pathogenic viruses that emerged in the UK in the early 1990s, are distinct from and pre-date those of the 1984 Chinese virus. In other words, European strains of RHDV emerged from apparently harmless strains to cause epidemic outbreaks, independently of the Chinese 1984 epidemic virus. These studies demonstrate how understanding viral epidemiology can improve the development of strategies to conserve rabbits, rare predator species and the habitat.     

水稻OsBTB蛋白在非亲和/亲和互作中表达方式的初步研究

为了解水稻OsBTB蛋白在非亲和/亲和互作中的表达情况,构建含OsBTB全长基因的原核表达载体,经诱导表达及纯化获得OsBTB蛋白。以OsBTB蛋白为抗原制备兔多克隆抗体,经间接ELISA法测定抗体效价为1∶2000。Westernblot分析确认该抗体与OsBTB蛋白可以特异结合。应用该抗体检测受不同稻瘟病菌(Magnaporthegrisea)生理小种侵染的相应水稻(Oryzasativa)品系中OsBTB蛋白的表达,结果表明OsBTB蛋白的表达方式呈多样性,该蛋白在非亲和反应中的表达时间明显早于其在亲和反应中的表达。免疫胶体金技术确认OsBTB蛋白存在于细胞核内。     

桃PpNAC19的克隆及其对PpCCD4启动子活性的调节分析

为探究桃NAC基因对类胡萝卜素积累的调控作用,本研究从桃中克隆得到PpNAC19基因。序列分析表明,PpNAC19(XP_007223324.1)开放阅读框为867 bp,编码288个氨基酸,预测蛋白质分子量为33.2 kDa,平均疏水系数为-0.719,属于亲水性蛋白,含有一个典型的NAM结构域。亚细胞定位预测PpNAC19蛋白定位在细胞核中。氨基酸序列比对与聚类分析表明,PpNAC19与巴旦杏(Prunus dulcis,VVA20514.1)亲缘关系较近。荧光定量PCR结果表明,PpNAC19在桃不同组织中均有表达,且在硬核期果实中表达量最高。在果实成熟过程中,黄肉桃果实中类胡萝卜素含量显著高于白肉桃果实。PpNAC19基因在黄肉桃中表达量较高,类胡萝卜素降解基因PpCCD4在黄肉桃中表达量显著低于白肉桃。双荧光素酶试验结果表明,PpNAC19能够转录抑制PpCCD4启动子活性。本试验为进一步研究PpNAC19基因在桃果实类胡萝卜素代谢过程中的功能提供了理论依据。