马铃薯sgt3基因启动子克隆及其功能鉴定

【目的】克隆马铃薯茄啶鼠李糖基转移酶基因(sgt3)的启动子序列并对其进行功能鉴定.【方法】采用染色体步移技术(genome walking)进行启动子的克隆,构建了该启动子驱动报告基因gfp::gus的植物双元表达载体p1304sgt3p,以pCAMBIA1304为阳性对照表达载体,采用农杆菌介导的烟草叶片瞬时表达及稳定遗传转化,结合GUS组织化学染色对其进行功能鉴定.【结果】电泳图表明为1条长约2 500bp的特异扩增条带,瞬时表达和稳定遗传表达的烟草叶片的GUS组织化学染色结果均显示gus基因在转化烟草叶片中高效表达,并且低于阳性对照,非转化烟草叶片中无表达.【结论】成功克隆到sgt3基因起始密码子上游2392bp的启动子序列并且该启动子具有活性.     

白桦BpGT14基因启动子克隆及表达活性分析

本文利用SiteFinding-PCR方法克隆了白桦BpGT14基因起始密码子ATG上游2 169 bp序列,并通过PLACE启动子预测工具对其进行元件分析。结果表明,该启动子片段含有启动子核心元件及多种逆境及激素响应元件,同时具有植物苯丙烷及木质素生物合成的MYB类转录因子的重要结合基序。研究选取了其中含有启动子核心元件的1 156 bp片段构建了pBpGT14∷GUS植物表达载体,利用农杆菌侵染的方法将pBpGT14∷GUS报告基因瞬时转化烟草植株,鉴定该启动子在烟草中的表达活性及对非生物胁迫和激素的响应模式。对转基因烟草植株进行GUS染色,结果表明该启动子具有启动活性,且在茎段处活性较高;进一步分析非生物胁迫对烟草中GUS酶活性的影响,表明该启动子对ABA、NaCl、PEG及高温处理均有明显响应,且对于NaCl及PEG处理响应迅速。为了更好的鉴定白桦BpGT14基因启动子在白桦细胞中的启动活性及响应模式,本文构建了pBpGT14∷GFP载体并瞬时转化白桦茎段悬浮细胞,进行研究。GFP转录水平分析结果与GUS酶活性结果基本一致,但其中部分时间点仍存在差异。选取PEG处理3、6、12及24 h的转GFP基因白桦茎段悬浮细胞,在显微镜下观察其绿色荧光蛋白,以此揭示该启动子对干旱的响应模式。结果表明,该启动子在白桦茎段悬浮细胞中启动了GFP的表达,在处理初期(3 h),荧光效果明显;随着处理时间的增加,细胞脱水明显,且在细胞壁表现高亮度荧光。      

刚毛柽柳水通道蛋白ThPIP基因启动子的克隆及其活性分析

[目的]研究刚毛柽柳水通道蛋白ThPIP基因启动子的克隆及其活性分析.[方法]采用染色体步移技术,克隆到刚毛柽柳ThPIP基因起始密码子上游1241bp启动子序列,并通过PLACE和HantCARE预测启动子序列中所包含的主要顺式作用元件.将该启动子替换pCAMBIA1301上的35S启动子,构建融合表达基因proThPlP∷GUS,通过基因枪瞬时转化烟草,并进行GUS组织化学染色.[结果]该启动子具有活性,能够驱动GUS基因的表达.[结论]为进一步鉴定该启动子中的顺式作用元件及相互作用的调控因子奠定基础,从而为揭示刚毛柽柳ThPIP基因的分子调控机制提供依据.     

一个烟草葡糖基转移酶基因启动子的克隆与诱导表达

利用笔者所在的实验室从烟草中克隆的一个葡糖基转移酶基因(GT-like),通过PCR扩增得到该基因开放阅读框5′端-1150~0上游调控区。序列分析表明该启动子序列含有多个基因表达调控元件。将GT-like基因启动子与gus报告基因连接,构建植物表达载体pGT-gus,经根癌农杆菌介导法转化W38型烟草。转基因烟草植株GUS组织化学染色结果表明:该基因上游-1150~0序列具有启动子活性,能启动gus基因在烟草叶片中表达,而在根中的表达受时间和环境影响。GUS诱导活性的定量分析结果表明,该启动子的表达不但受甲基茉莉酸的强烈诱导,而且也受水杨酸的强烈诱导。对这一启动子的诱导表达机理的分析将有助于进一步研究甲基茉莉酸和水杨酸之间拮抗作用的相互关系。     

大豆天冬氨酸蛋白酶基因启动子的克隆及其表达活性分析

【目的】克隆大豆天冬氨酸蛋白酶基因(soyAP1)启动子,并对其表达方式及活性进行分析。【方法】利用TAIL-PCR方法从大豆基因组DNA中克隆soyAP1基因启动子片段。利用启动子在线预测工具分析soyAP1基因启动子片段的启动子元件,并用克隆得到的SAP片段替换pCAMBIA1301中的CaMV35S启动子,构建表达载体pCAM-SAP。通过农杆菌介导法,使其在大豆各组织中进行瞬时表达,用GUS组织化学染色法分析SAP在各组织中的表达活性。【结果】克隆获得了大豆soyAP1基因的启动子片段,长1 650bp,并将之命名为SAP,其转录起始位点可能是553bp处的A;PLACE分析表明,SAP序列中含有多种典型的种子特异性表达元件;GUS组织化学染色显示,SAP驱动的GUS基因在大豆根、茎、叶中基本不表达,但在种子中有较高的表达活性,且表达强度与CaMV35S启动子相近。【结论】大豆SAP启动子可能具有种子特异表达特性。     

马铃薯3个StSnRK2基因启动子的克隆与序列分析

【目的】克隆马铃薯StSnRK2.1、StSnRK2.2和StSnRK2.4基因的启动子片段,为马铃薯StSnRK2基因表达与功能研究奠定基础.【方法】以马铃薯(Solanum tuberosum L.)品种‘陇薯3号’为试材,采用PCR技术从马铃薯基因组DNA中分离得到了3个SnRK2基因启动子.通过PCR扩增,酶切鉴定,测序,利用PlantCARE和PLACE在线分析软件预测分析所得序列.【结果】获得与预期大小基本一致的目的片段,分别为StSnRK2.1基因启动子、StSnRK2.2基因启动子和StSnRK2.4基因启动子.分析软件预测分析表明,启动子调控序列中除含有典型的真核生物核心启动子外,还含有多个CAAT-box、TATA-box等启动子元件,以及相应的ABRE、DRE/CRT、LTRE等与激素应答、逆境胁迫相关的顺式作用元件.【结论】这些结果预示StSnRK2.1、StSnRK2.2和StSnRK2.4基因调控机制相对复杂,可能参与了ABA,干旱,盐等多种逆境胁迫信号的转导过程,在马铃薯逆境胁迫应答过程中具有重要的功能作用.     

马铃薯蛋白激酶基因StPK1启动子的克隆及活性分析

 【目的】研究马铃薯蛋白激酶基因StPK1,为在马铃薯抗病反应中的功能提供证据。【方法】利用 TAIL-PCR技术,从马铃薯晚疫病水平抗性、垂直抗性和感病等3种材料中,分别克隆了该基因的启动子区域。此外,将从水平抗性材料中克隆得到的启动子与GUS连接构建植物表达载体,通过农杆菌介导的遗传转化法转化本氏烟(Nicotiana benthamiana),将得到的转基因烟草分别用水、晚疫病原菌或水杨酸(SA)溶液处理,并进行表达活性分析。【结果】3个启动子长度分别为922、929和922 bp,均具有TATA-box和CAAT-box以及多种与抗病反应和基因时空表达有关的元件,而三者的主要差异是个别碱基的不同。GUS组织化学染色表明,用晚疫病原菌或SA处理的转基因烟草被染成蓝色。【结论】StPK1启动子为有活性的启动子,且为病原和SA诱导型启动子。     

洋葱ANS基因启动子的克隆与瞬时表达分析

通过PCR方法对洋葱花青素合成酶基因(AcANS)上游启动子序列进行扩增,获得长度为1.8 kb和2.2 kb的两种片段,命名为ANSPM1和ANSPM2。序列分析表明,克隆到的两个启动子除含有多个TATA-box、CAAT-box等基本启动子元件,还含有与MYB转录因子结合的元件,以及参与光响应、逆境、激素应答的顺式作用元件。同时构建ANSPM1和ANSPM2驱动GUS报告基因的植物表达载体,通过洋葱表皮细胞瞬时表达分析,表明两个启动子均有活性。     

油菜Oleosin基因启动子的克隆、分析及瞬时表达

以甘蓝型油菜幼苗为材料,根据油脂蛋白Oleosin(O20)基因的启动子序列设计引物,PCR扩增了长度为935 bp的片段,把该片段连接到pBI101载体,GUS瞬时染色结果表明,该片段可以驱动GUS基因在油菜幼苗根部特异性表达。油菜油脂蛋白是一个蛋白质家族,为进一步鉴别扩增到的935 bp油脂蛋白启动子,该研究利用油菜基因组信息进行序列对比,结果表明935 bp的启动子和Oleosin(O20)的启动子序列之间有较多的变异,但和油菜1号染色体上的序列完全一致;1号染色体上紧跟的编码框序列和油脂蛋白Oleosin(O20)的编码框序列也完全一致,但油脂蛋白Oleosin(O20)的基因组序列要比油菜1号染色体的基因组序列短。通过PLACE和PlantCARE软件对935 bp启动子进行了扫描预测,结果表明该启动子中含有许多顺式作用元件,尤其是脱落酸、茉莉酸甲酯和水杨酸这3个与激素有关的元件;将该研究扩增到的另一个928 bp长度的启动子与935 bp的启动子相比,前者启动子区域水杨酸顺式作用元件缺少了1个碱基,同时也缺失了1个碱基的片段,这些序列的变化可能是该启动子丧失活力的原因。     

小麦蛋白激酶TaNPK启动子的克隆及活性分析

 【目的】克隆小麦蛋白激酶基因TaNPK启动子,并分析5′非编码区对盐胁迫的响应,探索TaNPK的调控机制,为解析小麦抗盐机制提供理论依据。【方法】利用染色体步移技术从小麦中分离TaNPK读码框上游序列,构建启动子缺失突变体,在PEG4 000介导下将重组质粒转入拟南芥叶片原生质体进行瞬时表达分析,以gus为报告基因研究不同调控序列的活性及盐诱导性分析。【结果】获得了TaNPK读码框上游2 004 bp的启动子序列,PEG介导的拟南芥原生质体瞬时表达分析表明,5′端缺失片段都在不同程度上驱动了GUS的表达;经过NaCl处理后的原生质体,GUS的表达量比不经处理的对照组明显提高,这与NaCl处理下TaNPK的实时荧光定量分析结果一致。【结论】经克隆获得了受盐胁迫诱导的小麦TaNPK启动子,启动子缺失区段在不同程度上驱动了gus的表达,-1 083—-1 296 bp区段可能含有响应盐胁迫的负调控元件。     

广西巴马小型猪ANK1基因启动子克隆及其活性分析

[目的]克隆广西巴马小型猪ANK1基因启动子,确定其活性核心区,为研究ANK1基因启动子与肉质性状的相关性及构建动物疾病模型打下基础.[方法]通过在线软件对ANK1基因启动子的转录因子结合位点进行预测,根据转录因子结合位点设计特异引物扩增不同长度的ANK1基因启动子片段,并利用双荧光素酶试剂盒检测其荧光值,以确定不同ANK1基因启动子片段的活性.[结果]发现ANK1基因启动子存在1个转录起始位点(TSS)、2个CpG岛和多个转录因子结合位点,并以此作为ANK1基因启动子的分段依据,将其分割为P638、P791、P1113、P1163、P1648、P1694、P1796和P2074等8个不同长度的目的片段.成功克隆获得的8个ANK1基因启动子片段经KpnⅠ和HindⅢ双酶切、T4真核表达载体连接、细胞转染等方法构建8个双荧光素酶重组报告基因,双荧光素酶试剂盒检测结果显示,广西巴马小型猪ANK1基因启动子在P1796片段活性最强,与其他片段存在显著差异(P<0.05).[结论]成功克隆获得广西巴马小型猪ANK1基因启动子的8个片段,且利用双荧光素酶试剂盒检测确定其核心启动子区域出现在P1796片段.     

小麦TaPR1基因启动子的克隆及启动活性分析

PR1是植物病程相关（Pathogenesis related,PR）蛋白家族成员之一,参与植物抗病防御反应。研究前期明确了小麦TaPR1基因受叶锈菌及信号分子水杨酸（Salicylic acid,SA）、脱落酸（Abscisic acid,ABA）的诱导表达。本研究基于中国春小麦数据库,克隆获得了小麦TaPR1基因上游2 200 bp启动子序列,对启动子区域所包含的顺式作用元件进行分析预测,利用β-葡萄糖苷酸酶（β-Glucuronidase,GUS）组织化学染色、绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein,GFP）观察对不同长度启动子区段进行启动活性验证,结果表明TaPR1基因启动子-2 200～-290 bp区段具有启动活性,为进一步解析TaPR1基因转录调控机制提供了理论依据。     

甘薯IbHKT-like基因的克隆与表达分析

植物高亲和钾转运体HKT基因具有Na+(或K+)单向运输或Na+-K+共转运作用.为了探究甘薯高亲和钾转运体HKT的离子转运情况及其对非生物胁迫的响应,本研究克隆得到1个甘薯钾离子转运体IbHKT-like基因.生物信息学分析结果表明,IbHKT-like基因序列全长为1647 bp,编码548个氨基酸.IbHKT-l...     

马铃薯StTrxF基因的克隆与功能分析

为探究马铃薯硫氧还蛋白基因(StTrxF)的耐盐生理机制,通过RT-PCR方法从马铃薯品种中薯5号中克隆得到全长549bp硫氧还蛋白基因(StTrxF)。该基因编码182个氨基酸,预测蛋白质分子量为44.17ku,理论等电点(pI)为5.23,具有典型的Thioredoxin结构域。由StTrxF基因推导的氨基酸序列与番茄、拟南芥、芝麻和赤霞珠等TrxF蛋白质氨基酸序列的同源性为96.02%～59.28%。构建植物过表达载体,导入拟南芥中,获得转基因拟南芥纯系植株。通过对转基因拟南芥植株的耐盐离体和盆栽鉴定,表明转基因植株的耐盐性显著提高。同时盐胁迫下,转基因植株的超氧化物歧化酶(SOD)活性和脯氨酸含量显著提高,丙二醛(MDA)含量显著降低。结果表明,表达StTtxF基因通过增加转基因植株脯氨酸含量,提高SOD活性,降低MDA含量,以维持细胞渗透平衡并激活ROS清除系统,具有提高转基因拟南芥植株耐盐性的显著效果。     

牙鲆Follistatin基因启动子克隆与分析

为研究海水鱼中Follsitatin基因的组织表达特异性,利用PCR方法获得牙鲆Follistatin基因启动子并进行序列分析,用RT-PCR和显微注射方法研究Follistatin基因与肌肉发育的关系.结果表明,所获得的启动子含有USF、F47、MyoD、NF-Y等多种转录因子结合位点;在牙鲆成体组织中,Follistatin基因在体肾、肠、心脏、头肾、脾中有表达,而在肌肉和肝脏中没有表达;显微注射证明Follistatin基因参与了肌肉的早期发育.     

毛白杨抗坏血酸过氧化物酶启动子克隆与分析

[目的]研究毛白杨抗坏血酸过氧化物酶(APX)的基因启动子在转录调控中的作用,为进一步探讨抗坏血酸过氧化物酶启动子在植物抗逆中的应用奠定基础.[方法]依据毛白杨与毛果杨基因的高度同源性,以毛果杨LG-IX染色体上抗坏血酸过氧化物酶启动子序列为模板设计引物,从毛白杨总DNA中克隆一段启动子序列.[结果]克隆出的抗坏血酸过氧化物酶启动子序列长1234 bp,与毛果杨同源基因的同源性高达81.96%.该启动子包含多种可能与胁迫相关的顺式作用元件保守序列,这些顺式作用元件参与光调节转录、激素信号和植物防御信号的应答,PpAPX-IX基因在老叶叶肉和老叶叶脉中表达较多,老叶中表达较多,在新叶中表达较少;在生长旺盛的部分比如根和形成层表达量很低或不表达.[结论]该启动子能为组织特异性启动子,受多种逆境胁迫产生的化学信号的诱导在成熟细胞中特异性表达,可以构建该启动子连接PBI101的表达载体.     

Cloning and analysis of APX gene promoter in Populus tomentosa

[目的]研究毛白杨抗坏血酸过氧化物酶(APX)的基因启动子在转录调控中的作用,为进一步探讨抗坏血酸过氧化物酶启动子在植物抗逆中的应用奠定基础.[方法]依据毛白杨与毛果杨基因的高度同源性,以毛果杨LG-IX染色体上抗坏血酸过氧化物酶启动子序列为模板设计引物,从毛白杨总DNA中克隆一段启动子序列.[结果]克隆出的抗坏血酸过氧化物酶启动子序列长1234 bp,与毛果杨同源基因的同源性高达81.96％.该启动子包含多种可能与胁迫相关的顺式作用元件保守序列,这些顺式作用元件参与光调节转录、激素信号和植物防御信号的应答,PpAPX-IX基因在老叶叶肉和老叶叶脉中表达较多,老叶中表达较多,在新叶中表达较少;在生长旺盛的部分比如根和形成层表达量很低或不表达.[结论]该启动子能为组织特异性启动子,受多种逆境胁迫产生的化学信号的诱导在成熟细胞中特异性表达,可以构建该启动子连接PBI101的表达载体.     

大鼠胰岛素Ⅱ基因启动子克隆与功能验证

【目的】克隆大鼠胰岛素Ⅱ基因启动子（RIP2）序列并对其功能进行验证,为培育胰岛特异性表达外源基因的转基因动物奠定基础。【方法】根据GenBank中已发表的RIP2序列（J00748．1）设计引物,以大鼠基因组DNA为模板,PCR扩增RIP2序列,连接pMD18-T载体后用HindⅢ和BamH I进行双酶切,回收RIP2片段并连接至不含启动子的pEGFP-1载体上构建真核表达载体pEGFP-1-RIP2。重组质粒转染PK15细胞,24h后观察细胞荧光蛋白表达情况。【结果】克隆获得的RIP2序列与参考序列（J00748．1）的同源性为99．9％,存在3处碱基差异,即从起始密码子ATG（＋1）上游-57处有一个G碱基缺失,-387处C突变为A,-707处插入一个G碱基。RIP2序列存在一个TATA-box（-206～201位点）和一个CAAT-box（-343-339位点）。以重组质粒pEGFP-1-PIP2转染PK15细胞,24h后能观察到绿色荧光。【结论】克隆获得的大鼠RIP2序列具有启动子功能,但活性较CMV启动子弱。