非洲猪瘟病毒VP73蛋白的B细胞表位预测

[目的]预测非洲猪瘟病毒VP73蛋白的B细胞表位。[方法]综合分析二级结构、亲水性、表面可及性与抗原性指数,预测非洲猪瘟病毒VP73蛋白的抗原表位。[结果]推测B细胞表位位于非洲猪瘟病毒VP73蛋白N端的11~18、26~48、73~82、136~150、159~174、181~1891、91~2102、47~276、279~295、313~323和382~392区段内或上述区段附近。[结论]应用多参数预测非洲猪瘟病毒VP73蛋白的B细胞表位,为今后进一步研究非洲猪瘟病毒VP73蛋白的特征以及表位疫苗的研制奠定了基础。     

非洲猪瘟病毒B646L基因序列分析及p72蛋白质结构与细胞抗原表位预测

为探究非洲猪瘟病毒B646L基因序列的碱基组成特点,及预测该基因所编码的p72蛋白质结构与细胞抗原表位,利用PCR技术对非洲猪瘟病毒B646L基因ORF框的序列进行扩增、测序及碱基组成分析;运用软件EXPASY、PRABI与SWISS-MODEL对p72蛋白质进行理化性质分析及二、三级结构预测;运用在线软件ABCpred Prediction、Scratch、IEDB和NetCTL对p72蛋白在B、T细胞的抗原表位进行预测。结果表明,非洲猪瘟病毒B646L基因ORF框序列全长为1 941 bp,其中,碱基A含量为26.9%,T含量为28.9%,G含量为24.2%及C含量为20.0%,A+T的含量为55.8%,G+C的含量为44.2%,AT含量显著高于GC含量;该序列共编码646个氨基酸,p72蛋白大小为76 ku;在整个p72蛋白分子的二、三级结构中,α-螺旋占19.35%,β-转角占5.42%,无规卷曲占50.15%,扩展链为25.08%,以无规卷曲为主要结构;该蛋白存在细胞质的概率最大,其次是细胞核,存在于线粒体、高尔基体和内质网的概率较低;p72蛋白B淋巴细胞优势抗原表位分别为1...     

N端B细胞表位缺失的兔出血症病毒VP60蛋白的表达及其免疫原性

本研究将A3C单抗识别的VP60蛋白NTA区域作为识别标记,设计一系列编码VP60 NTA区域重叠多肽的基因序列并连接于pGEX-4T-1载体,确定A3C单抗识别的精确表位。然后构建重组质粒Bacmid-VP60△A3C,将Bacmid-VP60△A3C转染Sf9昆虫细胞,得到重组杆状病毒rBac-VP60△A3C。RT-PCR、HA、IFA和Western Blot鉴定结果表明,重组蛋白VP60△A3C在Sf9细胞中高效表达,电镜观察显示其形态和结构与兔出血症病毒VP60蛋白类似。将重组蛋白VP60△A3C以每只200μg免疫2月龄RHDV血清阴性的新西兰兔,免疫后14 d,以兔出血症病毒WF株攻毒新西兰兔。结果表明,免疫组无死亡,而对照组全部死亡。本研究结果为制备表位缺失的兔出血症亚单位疫苗奠定了基础。     

非洲猪瘟病毒VP73蛋白的B细胞表位预测

非洲猪瘟(African Swine Fever,ASF)是由ASF病毒(AS-FV)引起的猪急性、烈性传染病。ASFV可以编码34种以上的结构蛋白。VP73蛋白作为ASFV主要的抗原性结构蛋白,能够诱导机体产生中和抗体,而且抗原性极为稳定,可作为ASFV的主要诊断试剂。笔者利用生物信息学方法,分析了来自Spain7     

猪细小病毒自然弱毒N株VP1蛋白二级结构及B细胞抗原表位预测

以PPV—N株的VP1蛋白基因序列为材料,采用Chou—Fasman、Garnier—Robson和Karplus—Schultz预测VP1蛋白的二级结构,用Kyte—Doolittle法预测VP1蛋白的亲水性,用Emini法预测VP1蛋白的表面可能性,用Jameson—Wolf法预测VP1蛋白的抗原指数,然后综合分析VP1蛋白的B细胞抗原表位。结果表明,PPV—N株VP1蛋白的二级结构以β-折叠为主,并有较多的转角和无规则卷曲区域,在序列的20～56、61～80、86～130、136～188区域最有可能是B细胞抗原表位的优势区域。本研究为PPV—N株的自然弱毒分子机理以及反向疫苗学研究提供了一定的理论依据。     

BCR-ABL融合蛋白融合区B细胞表位预测

以BCR-ABL融合蛋白氨基酸序列为基础,采用EMBOSS软件及DNAstar软件结合Hopp and Woods亲水性参数、Janin可及性参数、极性参数、柔韧性参数及二级结构方案对慢性粒细胞白血病BCR-ABL融合蛋白(p210~(BCR-ABL))融合区的B细胞表位进行预测。结果表明:BCR-ABL蛋白融合区位于B细胞表位内,该表位含有α-螺旋和无规则卷曲结构。BCR-ABL融合蛋白融合区B细胞表位预测的研究对应用合成肽抗原制备融合区单克隆抗体具有重要的指导意义。     

尼罗罗非鱼DMRT蛋白B细胞表位的预测

[目的]预测尼罗罗非鱼DMRT蛋白B细胞表位。[方法]以尼罗罗非鱼Dmrt基因序列为基础,按Garnier-Robson法,Chou-Fasman法和Karplus-Schulz法预测其编码蛋白的二级结构;用Kyte-Doolittle法,Emini法及Jameso-Wolf法分别预测B细胞表位。[结果]Garnier-Robson法和Chou-Fasman法的预测结果均表明,在尼罗罗非鱼DMRT蛋白分子N端第31~56、68~75、110~116、209~211区段和第239~243区段可能是α螺旋中心;蛋白N端第95~99、177~183、225~234区段和第251~254区段可能是β折叠中心;按Kyte-Doolittle的亲水性方案、Emini方案和Jameson-Wolf抗原指数方案,辅以对DMRT蛋白的二级结构中的柔性区域的分析,预测DMRT蛋白的B细胞表位,DMRT蛋白N端第13~16、35~38、47~54,84~93、101~109、127~156、166~177区段和第198~201区段附近很可能为B细胞表位优势区域。[结论]该研究结果为DMRT蛋白克隆抗体的制备及探索尼罗罗非鱼性别调控机理提供了参考资料。     

北京鸭呼肠孤病毒σA、σB蛋白的二级结构及B细胞抗原表位的预测

应用SOPMA方法和DNAStar Protean软件综合分析了北京鸭呼肠孤病毒分离株DRV-GZ株的σA、σB蛋白的二级结构、亲水性、表面特性、柔韧性和抗原指数,并对各个蛋白的B细胞抗原表位进行了预测.结果表明,σA蛋白的32～37,56～61,82～85,107-116,128-141,202～207,239～246,256～260,274～280,312～317,381～391和σB蛋白的62～86,117～123,141～163,179～186,270～275,287～289,343～345区域内或附近最有可能是B细胞抗原表位的优势区域.     

猪传染性胃肠炎病毒S蛋白的二级结构和B细胞抗原表位的预测

以TGEV（猪传染性胃肠炎病毒）基因组序列为基础,运用Garnier-Robson、Chou-Fasman和Karplus-Schulz方法预测其S蛋白的二级结构,运用Kyte-Doolittle方法对S蛋白的亲水性进行分析,并分别运用Jameson-Wolf方法和Emini方法预测了其抗原指数和表面可及性,最后结合吴玉章的方法综合分析预测了其B细胞抗原表位。结果显示,α螺旋数量少且分散,β折叠占据面积较大,柔性区域主要集中在N端第22～30、45～76、100～172、239～301、348～419、451～519、541～633、645～720、746～796、822～887、921～986、1052～1201、1239～1384、1434～1445区段。S蛋白可能的B细胞抗原位点是N端第20～32、44～54、69～78、97～106、635～655、781～803、949～994、1307～1328、1346～1362、1432～1448区段,这些区段内部或附近都有柔性区域存在,可作为S蛋白的抗原优势表位。     

DEV核衣壳蛋白二级结构与B细胞表位预测

为预测和分析鸭肠炎病毒NP蛋白的二级结构和B细胞表位,以DEV-NP基因推导的氨基酸序列为基础。采用Chou-Fasman法、Ganmier-Robson法和Karplus-Schulz法预测该蛋白二级结构;按Kyte—Doolittle方案、Emini方案和Jameson-Wolf方案预测其B细胞抗原表位。结果表明,DEV-NP蛋白的二级结构较为复杂,含有较多的转角、无规则卷曲等柔性区域以及α-螺旋与β-折叠区段,且在蛋白肽链中有多个区段可形成B细胞抗原表位,其中第10—15和182—186区段及其附近可能是DEV-NP蛋白的B细胞表位优势区。     

非洲猪瘟病毒VP73蛋白的B细胞表位预测（英文）

[Objective] The B cell epitopes for VP73 protein of African swine fever virus was predicted.[Method]Based on the analysis of the amino acid sequence and the flexible regions of VP73 protein,the B cell epitopes for VP73 protein of African swine fever virus were predicted by method of Kyte-Doolittle,Emini and Jameson-Wolf.[Result]The B cell epitopes were located at or adjacent to the N-terminal No.11-18,26-48,73-82,136-150,159-174,181-189,191-210,247-276,279-295,313-323 and 382-392.[Conclusion]The multi-parameters analytic method was adopted to predict the B cell epitopes for VP73 protein of African swine fever virus,which laid solid foundation for further characterizing the protein of VP73 and researching epitope vaccine.     

非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体制备及线性抗原表位定位

【目的】制备非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）p30蛋白的单克隆抗体（monoclonal antibodies,MAbs）并初步分析其所识别的线性抗原表位,为ASFV及其抗体检测方法的建立及p30蛋白结构和功能的研究奠定基础。【方法】将原核表达并纯化的p30重组蛋白作为免疫原,免疫6—8周龄BALB/c雌鼠,每两周免疫1次,共免疫3次,首次免疫是抗原与等体积的弗氏完全佐剂乳化后免疫,第二次和第三次免疫与等体积的弗氏不完全佐剂乳化,3次免疫后1 w断尾采血,间接酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清抗体效价,选择血清效价最高的小鼠进行加强免疫,3 d后取小鼠脾淋巴细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按照4﹕1的比例使用PEG进行常规细胞融合。利用重组p30蛋白作为包被抗原,间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞,有限稀释法进行克隆纯化,直至筛出能够稳定分泌抗体的MAbs。将ASFV接种于猪肺泡巨噬细胞,以筛选的MAbs为一抗、兔抗鼠HRP-IgG为二抗,进行间接免疫荧光试验（IFA）。将感染和未感染ASFV的细胞沉淀处理后进行 SDS-PAGE并转印至硝酸纤维素膜,分别以IFA鉴定为阳性的MAbs上清为一抗、兔抗鼠HRP-IgG为二抗,进行Western blotting分析,筛选获得p30 MAbs。根据已知序列设计引物扩增p30ab与p30bc两段截短基因,其中p30ab代表由第86—153位氨基酸残基的截短体,p30bc代表由第120—187位氨基酸残基的截短体,原核表达部分重叠的截短p30蛋白,最终获得重组蛋白GST-p30ab与重组蛋白GST-p30bc。分别以GST-p30ab和GST-p30bc融合蛋白为包被抗原,以5株MAbs为一抗,以兔抗鼠HRP-IgG为二抗, 通过间接ELISA方法初步定位p30蛋白的抗原表位。【结果】以纯化的重组蛋白为包被抗原,经间接ELISA试验筛选出25株可分泌抗重组 p30蛋白的杂交瘤细胞株。IFA结果显示,5株MAbs（8F4、1D3、1H2、6C3和8E11）与ASFV感染的猪肺泡巨噬细胞IFA 试验呈阳性;Western blotting结果显示,5株MAbs均能够与ASFV感染的细胞呈阳性反应,与未感染病毒的细胞呈阴性反应。试验构建的p30截短体重组蛋白GST-p30ab以可溶和包涵体两种形式表达,而GST-p30bc仅以包涵体形式表达,以两组截短体融合蛋白为包被抗原,通过间接ELISA检测出MAbs 8F4、1H2和6C3与两个重组蛋白均能有效结合,证明MAbs 8F4、1H2和6C3抗原识别区域为两组截短蛋白重叠区域,即第120—153位氨基酸;MAbs 8E11与1D3则只能与GST-p30ab蛋白结合, 证明MAbs 8E11与1D3抗原识别区域为两个重组蛋白的非重叠区域,即第86—119位氨基酸。【结论】本研究可溶性地表达了p30蛋白的第86—153位氨基酸截短体重组蛋白,制备了5株p30 MAbs,定位到2个p30蛋白抗原表位。结合ELISA和IFA,可建立十分可靠的ASFV及其抗体的检测手段。     

非洲猪瘟病毒P30蛋白单克隆抗体制备、鉴定及阻断ELISA方法的建立

【背景】非洲猪瘟（ASF）于2018年8月在中国首次出现,对养猪业造成了巨大危害,损失惨重。目前尚无安全有效的疫苗用来预防ASF,于是建立快速特异的检测方法对于防控ASF提供了有效的手段。【目的】制备非洲猪瘟病毒（ASFV）特异性单克隆抗体,建立ASF快速特异性的检测方法。为ASF的检测和防控提供借鉴技术手段。【方法】构建表达载体pET-28a-P30,通过原核表达系统获得ASFV P30重组蛋白,以纯化的P30蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,经过细胞融合和细胞亚克隆制备出ASFV P30蛋白特异性杂交瘤细胞株;对P30蛋白进行截短表达,利用Western Blot和间接酶联免疫吸附试验（iELISA）鉴定单克隆抗体所对应的抗原表位;并利用制备的单克隆抗体建立非洲猪瘟阻断ELISA抗体检测方法。【结果】通过双酶切和PCR验证,结果显示构建出重组载体pET-28a-P30,经测序其序列未发生突变;IPTG诱导后,P30重组蛋白主要表达在包涵体中,分子量约为33 kD。纯化的P30蛋白与弗氏佐剂1﹕1混合免疫小鼠,3次免疫后,小鼠血清效价达到1﹕102 400,说明表达的蛋白具有良好的免疫原性。经细胞融合和亚克隆,获得8株P30蛋白特异性杂交瘤细胞,Western Blot和间接免疫荧光试验（IFA）检测获得的8株单抗均具有良好的反应性。叠加试验显示8株单克隆抗体均针对相同的抗原位点;截短表达P30蛋白不同片段,选取制备的2-12B单克隆抗体与不同的截短P30蛋白反应,显示单克隆抗体的抗原表位区为187—194aa。利用2-12B单克隆抗体并经过条件优化,成功建立了ASF阻断ELISA抗体检测方法,检测了190份临床样品,并与商品化非洲猪瘟ELISA抗体检测试剂盒进行对比,两方法阳性符合率为90.91%,总符合率为96.32%。【结论】本研究成功获得ASFV P30蛋白,经过iELISA、Western Blot和IFA筛选出反应性良好的特异性单克隆抗体8株,抗原识别表位区为187—194aa。并利用制备的单克隆抗体建立了特异性高,敏感性好的ASFV阻断ELISA抗体检测方法,为ASF的检测及其防控提供了手段和支撑。     

非洲猪瘟病毒分子生物学检测方法研究进展

非洲猪瘟病毒感染猪后可引起猪高热、皮肤和内脏器官出血和高死亡率,死亡率可达100%。自2018年8月非洲猪瘟在中国首次报道以来,迅速席卷全国,给猪业造成严重的经济损失。文章综述6种非洲猪瘟病毒分子生物学检测方法,主要包括核酸探针、纳米PCR、荧光定量PCR、微滴数字PCR、环介导等温扩增技术、重组聚合酶扩增技术等。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP4蛋白B细胞表位的初步筛选

GP4蛋白是猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)的次要结构蛋白,在病毒的复制与侵染中起重要作用。通过合成GP4蛋白的重叠多肽,采用间接ELISA、dot-ELISA的方法对GP4蛋白的B细胞表位进行初步筛选,得到1个免疫显性肽段Ⅰ(50) SCLRHGDSSSPTIRKSS (67),并对其抗体水平进行测定,为PRRSV的抗体检测及其新型表位疫苗的研究奠定基础。     

嵌合双串联OVA T细胞表位的RHDV VP60蛋白免疫特性研究

为研究RHDV VP60作为载体容纳外源片段以及递呈外源T细胞表位的能力,将双串联卵清蛋白T细胞表位插入N端、C端以及替代N端氨基酸的方式获得3种嵌合蛋白,进行免疫试验。3种嵌合蛋白分别命名为DN1、DN2和DC,将蛋白进行浓缩、纯化及定量,利用透射电镜观察VLPs的形成,发现均可形成形态大小与VP60相似的VLPs。将3种嵌合蛋白分别腹腔注射C57BL/6雌性小鼠,利用间接ELISA检测首免后0、4和6周小鼠血清样品中VP60特异性抗体,结果表明嵌合蛋白组与VP60组均能够诱导产生较高水平的抗VP60特异性抗体,2组间无显著差异。首免后6周,利用合成的OVA多肽刺激脾淋巴细胞,ELISPOT检测特异性IFN-γ的分泌水平,结果表明3种嵌合蛋白均能诱导特异性IFN-γ的分泌。该研究扩展了VP60作为载体可携带的外源片段的耐受性及有效递呈T细胞表位的能力,为VP60-VLPs展示系统的研究提供了理论依据。     

非洲猪瘟病毒重组载体疫苗激发/加强免疫策略的初步研究

为了选择合理的非洲猪瘟病毒（ASFV）重组载体的激发/加强免疫策略,构建表达ASFV CD2v-p30-p54融合抗原的重组伪狂犬病毒rPRV-F1,将其与表达相同融合抗原的重组腺病毒rAd-F1分为rAd-F1/rAd-F1、rAd-F1/rPRV-F1、rPRV-F1/rPRV-F1、rPRV-F1/rAd-F1 4个组合进行猪免疫试验,分别于免疫后不同时间采血并分离血清进行ELISA抗体检测,分离的外周血单个核细胞（PBMC）经ASFV抗原刺激后进行IFN-γ检测。免疫荧光与免疫转印试验结果显示,构建的rPRV-F1能在感染细胞中正确表达F1融合蛋白。所有免疫猪均能检测到抗原特异性抗体,加强免疫后的抗体水平显著升高。在测试的4个免疫方案中,尽管rAd-F1/rAd-F1组合初次免疫后的抗原特异性抗体水平和IFN-γ表达水平最高,但加强免疫后的抗体水平和IFN-γ表达水平最低。与此相反,尽管rPRV-F1/rAd-F1组合初次免疫后的抗体水平和IFN-γ表达水平最低,但加强免疫后的抗体水平和IFN-γ表达水平最高。这些研究结果表明rPRV/rAd是较好的ASFV重组载体疫苗的激发/加强免疫策略。