不同浓度防冻剂和投液氮温度对牛体外受精胚胎冷冻效果的影响

比较了3种不同浓度的甘油（1.4,1.0,0.7mol/L）和投液氮温度（-25℃、-30℃和-35℃）对牛体外受精胚胎冷冻效果的影响。结果发现,最终投液氮温度为-25℃时,胚胎冻后存活率以1.4mol/L甘油组为最高,同1.0mol/L甘油组相比,差异显著（78.5%vs 64.5%,P〈0.05）;与0.7mol/L甘油组相比,差异极显著（78.5%vs53.5%,P〈0.01）。以1.0mol/L的甘油冷冻,-30℃投液氮的效果优于-25℃的,它们之间冻后胚胎的孵化率差异显著（77.1%vs 64.5%,P〈0.05）。用0.7mol/L甘油冷冻,投液氮温度以-30℃的为最好,冻后胚胎的孵化率（73.3%）极显著（P〈0.01）高于-25℃的（53.5%）。用1.4mol/L甘油冷冻,以-25℃投液氮为最好,冻后胚胎的孵化率（78.5%）显著（P〈0.05）高于-35℃的（65.7%）。结果表明,不同的甘油浓度和投液氮温度对牛体外受精胚胎的冷冻效果有显著的影响。     

投入液氮前的平衡温度及时间对兔胚冻后存活的影响

本研究旨在了解投入液氮前的平衡温度及时间对兔胚冻后存活的影响。经0.5M蔗糖与1.5,2.0或2.5M乙二醇组成的冷冻液处理后的兔胚,在-30℃或-37℃平衡10或20分钟后即投入液氮保存或直接投入液氮保存。胚胎解冻在37℃的水浴进行。当平衡温度由-30℃下降到-37℃时,胚胎的冻后形态正常率及存活率均极显著下降(P<0.01)。在-30℃平衡20分钟与10分钟的冻后存活率无明显差异(P>0.05),但直接投入液氮时,冻后存活率则很低(8.3％)。由此表明:兔胚冻前在-30℃平衡10—20分钟是必要的。     

冷冻距离和冷冻保护剂种类对超低温保存新西兰兔精液品质的影响

为了探讨新西兰兔精液超低温冷冻保存的最佳方法,试验采集新西兰成年公兔精液,采用0.25 mL细管冷冻法进行超低温冷冻,以解冻后精液活率、质膜完整性、顶体完整率为指标,研究距离液氮面不同高度和冷冻保护剂种类对冷冻保存兔精液品质的影响。结果表明:冷冻精液距离液氮面3 cm,其精液活率、质膜完整性和顶体完整率明显优于1 cm和5 cm;在冷冻稀释液中添加甘油相对于其他冷冻保护剂对精液品质的保护效果好,甘油浓度为3%时相对其他浓度效果较好。说明了距液氮面3 cm冷冻,冷冻稀释液中添加3%甘油对兔精液的保存效果较好。     

冷冻兔胚胎的移植

大部分家畜的胚胎冷冻保存于70年代以后相继成功.有关冷冻免胚胎的引进尚未见报道.为探索冷冻负胚胎在我国移植的可行性,我院首次从联邦德国慕尼黑大学引进皮兔冷冻胚胎进行移植试验.现将其结果报告如下.     

新西兰兔精液冷冻保护剂的筛选

本试验的目的是分析在新西兰兔精液冷冻保存稀释液中分别添加不同浓度的海藻糖、透明质酸、维生素E(Ve)、超氧化物歧化酶(SOD)对兔精液冷冻保存效果的影响,以冻后精子活率、质膜完整性、顶体完整率等作为质量评定指标,筛选出效果较好的新西兰兔精液的冷冻保护剂种类及浓度。结果表明,精液冷冻保存稀释液中添加3种浓度的海藻糖均未提高兔精液冷冻后的精子活率、质膜完整率和顶体完整率(P0.05);添加0.5%和1%的透明质酸提高了兔精液冷冻后的精子活率(P0.05),但各组间质膜完整率和顶体完整率无显著差异;添加2 g/L Ve提高了兔精子4℃平衡后的活率、冷冻后精子活率、质膜完整率和顶体完整率(P0.05);添加4 000 IU的SOD提高了兔精子4℃平衡后的活率、冷冻后精子活率、质膜完整率和顶体完整率(P0.05)。结果证实,在新西兰兔精液冷冻保存稀释液中添加适宜浓度的Ve和SOD可提高兔精液冷冻后的精子活率、质膜完整率和顶体完整率。     

不同冷冻保护剂对犬精子冻存的影响

本试验通过对比冷冻保护剂和冷冻程序,优化犬精液冷冻保存方法,比较了不同甘油、乙二醇浓度、不同平衡时间对犬精子冷冻复苏率及精子顶体完整率的影响。结果发现,甘油作为冷冻保护剂时,其对精液冷冻保存后的效果明显优于乙二醇,当甘油浓度为4%时,平均冷冻复苏率最高;冷冻平衡时间为1 h最佳。因此,犬精液在冷冻保存时,甘油浓度为4%,平衡60 min,可获得平均39.21%±0.013%的冷冻复苏率,且比较稳定。     

不同冷冻方法对牛体外受精胚胎冷冻效果的影响

通过采用程序降温法(试验1:分步法10%甘油;试验2:直接法1.8mol/L乙二醇+0.1mol/L蔗糖)和玻璃化法(试验3:20%甘油+0.3M蔗糖+0.3M木糖+3%聚乙二醇+20%乙二醇)对牛体外受精胚胎进行冷冻保存及解冻后进行孵化培养试验,用囊胚孵化率对各方法进行了比较。结果表明,10%甘油组、1.8mol/L乙二醇+0.1mol/L蔗糖组及玻璃化组胚胎存活率分别为85%、82.5%、90%;囊胚孵化率分别为50%、55%和80%(P<0.05)。体外受精胚用玻璃化法保存显著优于程序降温法,可获得较高的胚胎存活率(90%)和囊胚孵化率(80%)。     

不同冷冻保护剂对犊牛睾丸组织冷冻效果的研究

通过探讨不同冷冻保护剂对犊牛睾丸组织冷冻保存的效果以及睾丸组织低损伤冷冻保存的机理,为保护珍稀濒危物种、恢复人类未成年男性生育能力等提供依据。研究将二甲基亚砜(DMSO)、甘油、丙二醇、蔗糖和葡萄籽原花青素(GSP)五种冷冻保护剂设置八个浓度梯度,用以进行犊牛睾丸组织的冷冻保存,7d后解冻,解冻后检测睾丸组织内的一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)和细胞活率。结果表明,经10%DMSO、丙二醇、蔗糖和GSP冷冻犊牛睾丸组织7d解冻后,组织细胞活率分别达到77%、62%、34%和24%,DMSO组优于其他组(P0.05);NO水平分别为0.52、0.51、0.64和0.49μmol/mgprot,NOS活性分别为1.03、0.98、1.04和0.96U/mgprot,GSP组优于其他组(P0.05)。7.5%甘油冷冻犊牛睾丸7d解冻后,细胞活率、NO和NOS分别为41%、0.54μmol/mgprot和1.07U/mgprot,优于组内其他浓度(P0.05)。表明10%DMSO能有效地冷冻保存犊牛睾丸组织。     

影响玻璃化冷冻兔胚胎效果的一些因素

试验对影响玻璃化冷冻兔胚胎效果的一些因素进行探讨，以找出理想的玻璃化冷冻方法。在测试的５种玻璃化溶液中，含３５％乙二醇（ＥＧ）和１．０ｍｏｌ／Ｌ蔗糖的溶液（ＶＳ１）对胚胎的毒性最小。用ＶＳ１冷冻桑椹胚和囊胚的理想程序是：在室温下使胚胎分别在２０％ＥＧ和３５％ＥＧ中平衡２、３分钟后，移入ＶＳ１中，０．５分钟内（囊胚也可在２分钟后）投入液氮中冷冻。桑椹胚的存活率为９１．７％（３３／３６），囊胚的存活率为９７．１％（３３／３４）～９７．３％（３６／３７）。８～１６细胞胚胎的理想冷冻程序为：在室温下使胚胎在２０％ＥＧ、３５％ＥＧ中平衡２、３分钟，移入４℃的３７％ＥＧ＋１．０ｍｏｌ／Ｌ蔗糖溶液中平衡２分或１０分钟后冷冻，胚胎存活率分别为１００％（３７／３７）、８６．１％（３１／３６）。     

不同保护剂对藏羊冷冻精液品质影响的研究

本实验研究了不同保护剂对藏羊细管冷冻精液的品质影响。结果表明:含T ris的柠檬酸盐缓冲液可以提高冷冻-解冻后的精子活率(0.41±3.23)和精子顶体完整率(74.45±1.45),以等体积乙二醇替代甘油作防冻剂制作的细管冷冻精液,解冻后的精子活率(0.41±2.87)和顶体完整率(81.23±1.45)。稀释液中添加维生素B12对提高冷冻后精子活率(0.44±3.26)与保护顶体完整率(83.33±1.93)具有良好的作用。     

不同冷冻保护剂和冷冻方法对小鼠耳皮肤成纤维细胞冻存效果的影响

通过比较不同冷冻保存方法和冷冻保护剂对小鼠耳皮肤成纤维细胞冷冻-解冻复苏后细胞存活率、48h贴壁率和细胞生长曲线的影响,筛选适宜的小鼠耳皮肤成纤维细胞冷冻保存方法和冷冻保护剂。结果表明,以100mL/L二甲基亚砜(DMSO)作为冷冻保护剂进行小鼠耳皮肤成纤维细胞冷冻保存时,方法3处理组解冻复苏后细胞存活率和培养48h细胞贴壁率均高于方法2处理组(P>0.05),并分别极显著高于方法1和方法4。采用方法3进行冷冻保存时,以100mL/L DMSO作为冷冻剂的细胞贴壁率显著高于100mL/L甘油(GL)组(P<0.05),且冷冻解冻后的细胞呈现正常的分裂增殖生长模式。因此,宜选择100mL/L胎牛血清(FBS)+100mL/L DMSO+DMEM作为冷冻保护液,采用方法3进行小鼠耳皮肤成纤维细胞的冷冻保存。     

不同稀释液配方和冷冻保护剂对贵州黑山羊精液品质的影响

为探究适合贵州黑山羊冷冻精液的稀释液和冷冻保护剂,通过精液质量分析系统比较4种常用的山羊冷冻精液稀释液配方和2种冷冻保护剂对贵州黑山羊精液品质的影响。结果:不同配方中以甘油作为冷冻保护剂对贵州黑山羊精液的保护效果均优于乙二醇,且配方1的精子前进式活力最高(22.73±6.25),配方3次之(20.14±5.25)。结论:经综合评价,在贵州黑山羊冻精生产过程中可选择配方1或配方3作为冷冻精液稀释液,以甘油作为冷冻保护剂。     

冷冻保护剂和胎牛血清对牛成纤维细胞冷冻效果的影响

以甘油与DMSO为冷冻保护剂,添加5%-20%胎牛血清的DMEM为基础冻存液,对鲁西黄牛皮肤成纤维细胞进行冷冻保存,结果表明:①同浓度DMSO为冷冻保护剂效果优于同浓度的甘油(P<0.05),但添加50%血清时并不明显(P>0.05),可能与较高血清浓度有关,血清对冻存细胞的影响高于冷冻保护剂的作用。②血清浓度一定时,DMSO和甘油浓度在10%-15%时,冻存效果较好。③当甘油与DMSO浓度一定时,血清浓度越高冷冻保存效果越好。④甘油与DMSO浓度一定时(DMSO浓度5%除外),添加10%和20%血清效果无差异(P>0.05)。因此,在实际应用中,考虑成本等因素,血清浓度达到10%时就已经能达到一般试验要求。     

不同冷冻保护液和解冻温度对猪精液冷冻效果的影响

在BF5稀释液中分别添加不同水平的牛血清白蛋白(BSA)(0.5,1,1.5 g/L)、二甲基乙酰胺(DMA)(0.5%,1%,1.5%)、甲基-β-环糊精载胆固醇(CLC)(1,2.5,5 g/L),对成年健康猪精液进行冷冻保存,于不同温度(37,50,70℃)解冻后分别检测冷冻后精子的活率、活力、质膜完整性、项体完整率、线粒体活性.结果显示,0.5 g/L BSA组冷冻后精子活力、质膜完整率、顶体完整率和线粒体活性均高于其他组,但差异不显著(P0.05).1% DMA组冷冻后精子活率和活力显著优于1.5%DMA组(P＜0.05),同时也高于对照组(3%甘油)冻后精子活率和活力,但差异不显著.不同质量浓度CLC组冷冻后精子的活率、活力、质膜完整性和线粒体活性与对照组相比差异不显著.50℃和70℃解冻组精子的活率和线粒体活性显著高于37℃解冻组的精子;50℃解冻组精子的活力和质膜完整率显著高于其他2组.因此,在猪精液冷冻稀释液中,用DMA可以代替甘油作为渗透性保护剂,且以1%DMA,50℃解冻最佳.     

蔗糖一步法冷冻牛胚胎的存活性和非手术移植

材料和方法供卵牛为饲养于福岛种畜牧场的经产牛(3～10岁)12头,未经产牛(2岁)11头,共23头黑色和牛。超排处理按已报告过的FSH减量注射法,注射开始48小时后将PGF2α30～35mg分1～3次注射之后,第2天午后发现发情者,第3天早晨进行授精。供用卵是发情第7～8天非手术回收的桑椹胚～囊胚。冲卵液用Whittingnam的改进杜氏PBS。左右子宫角分别灌注250～300ml。培养液用     

不同冷冻温度对野牦牛精液品质的影响

试验目的是了解在不同冷冻温度条件下生产的细管冻精在相同的解冻温度、相同的解冻时间条件下,对野牦牛细管冷冻精液品质的影响,以便根据实际情况来确定较为理想的生产操作规程,从而生产优质细管冻精服务于我国畜牧业发展.     

混合防冻剂、投液氮温度及解冻温度对牛体外受精胚胎活力的影响

试验一按正交设计比较了三种浓度（０．５Ｍ，０．７５Ｍ和１．０Ｍ）的甘油和丙二醇、三种投液氮温度（－２５℃，－３５℃，－４５℃）、三种解冻温度（１０℃，２０℃，３７℃）对第７、第８天囊胚存活率的影响。结果甘油浓度以１．０Ｍ和０．７５Ｍ的效果较好，胚胎成１６率分别为５４．０％和５３．１％；而丙二醇以０．５Ｍ水平的成活率最高，为６１．６％；投液氮温度以－２５℃的效果最好；（成活率为５６．１％）；解冻温度则以２０℃、３７℃优于１０℃，成活率分别为５７．６％，５８．９％及３７．１％。试验二用０．７５Ｍ甘油十０．５Ｍ雨二醇及１．０Ｍ甘油＋０．５Ｍ丙二醇作为防冻剂，将胚胎降温至－２５℃后投入液氮，在２０℃水浴中解冻。结果两组胚胎的成活率均较高，分别为７９．０％和８０．０％（Ｐ＞０．０５）。     

低温和冷冻保护剂(DMSO)对卵细胞的影响

实验以小鼠为动物模型 ,研究延长小鼠卵母细胞在含有冷冻保护剂的液体中的平衡时间、并且降低平衡时的温度是否能影响卵母细胞完成减数分裂时染色体的倍性。结果表明 :①在含有DMSO的液体中平衡卵母细胞的非整倍体率同对照组没有明显差异 ,但是卵母细胞在没有DMSO的液体中平衡 ,非整倍体率明显增加 ;②有DMSO时 0℃平衡15和 6 0min后卵母细胞非整倍体率没有发生明显变化 ;③卵母细胞在 1.5mol/L的DMSO液体中 2 4℃平衡 ,卵母细胞的非整倍体率明显增加。这些结果表明 :1.5mol/L的DMSO 0℃平衡对卵母细胞的染色体倍性有保护作用