巢式PCR和SYBR Green Ⅰ实时PCR检测转基因大豆方法的研究

为了建立转基因大豆检测技术,采用巢式PCR和SYBR Green Ⅰ实时PCR技术,检测转基因大豆外源基因(CaMV35S、CP4EPSPS)。结果表明,利用巢式PCR可检测出1 ng/μL转基因含量1%的大豆中的CaMV35S基因,而第一轮PCR的检测限为100 ng/μL;利用SYBR Green Ⅰ染料能结合双链DNA的特点,应用实时PCR技术可检测到CaMV35S、CP4EPSPS基因扩增所产生的信号,通过扩增产物的熔解曲线能有效地区分特异性产物,CaMV35S基因的检测限为0.1 ng/μL。同时利用该方法对黄豆、炒黄豆、豆干等样品进行检测,样品中未检出CaMV35S基因成分。巢式PCR方法明显提高了PCR的检测限,SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR方法能有效、快速检测CaMV35S转基因成分。     

多重PCR结合DHPLC方法检测番茄中转基因成分

应用多重PCR结合变性高效液相色谱(DHPLC)技术,检测转基因番茄华番1号中的转基因成分。对番茄中特异的PG内源基因、华番1号中含有的CAMV35S、NOS和NPTII外源基因进行多重PCR扩增,将扩增产物测序验证。利用DH-PLC分离多重PCR产物,建立了多重PCR-DHPLC技术检测转基因番茄的方法;将样品进行稀释,确定了该方法的检测灵敏度。试验结果表明,所建立的多重PCR-DHPLC方法操作简便,快速准确,能够同时检测转基因番茄4个内、外源基因,检测限达0.5ng/μL,可用于番茄中转基因成分的检测。     

转基因大豆种子、豆粕定性PCR检测方法的研究与应用

利用定性PCR检测方法,以大豆凝集素基因(Lectin)为内标基因,检测了转基因大豆种子、豆粕中的四个外源基因:35S-CTP基因、Cp4-epsps基因、nos终止子基因、CaMV35S启动子基因,并通过酶切(XmnI)验证试验验证了定性PCR检测结果的准确性,建立了定性PCR检测转基因大豆种子、豆粕的方法,利用市场上抽检到的大豆种子、豆粕样品,进行了实际检测工作.     

SYBR Green Ⅰ实时PCR技术鉴定鸭源性成分的研究

为建立灵敏、可靠的食品中鸭源性成分鉴定方法,确定了一对可特异地检测出牛肉中所掺杂鸭肉成分的引物,建立了SYBR Green Ⅰ实时PCR技术检测鸭肉的方法.结果表明:利用SYBR Green Ⅰ实时PCR技术可检测到鸭肉DNA,通过熔解曲线能有效地区分特异性产物,检测灵敏度可达到1 pgDNA.同时利用该方法可检测出熟牛肉、鸭肉混合样品中的鸭肉成分.SYBR Green Ⅰ实时PCR方法能快速、特异、灵敏的检测鸭肉成分.     

木薯内参照基因LAM2定性PCR和定量PCR分析

在转基因植物及其产品的成分检测中,内参照基因(endogenous reference gene)起着重要的作用,木薯内参照基因的研究是转基因木薯成分定性PCR和定量PCR检测的基础。本研究选择木薯的亚麻苦苷酶(linamarase,LAM)和Polyubiquitin(PUBQ)基因为研究对象,运用定性PCR的方法在22种木薯的不同品种中进行稳定性分析,在12种大戟科其它植物、20种非大戟科植物及五类主要转基因作物的混合样品(玉米,大豆,水稻,棉花和油菜)中对LAM2和PUBQ1定性PCR引物进行特异性检测分析及灵敏度检测分析。结果显示:LAM2和PUBQ1引物在木薯的不同品种中均能得到稳定性扩增;在12种大戟科其它植物、20种非大戟科植物能够进行特异性扩增,没有发现非特异性扩增产物出现;LAM2在五类主要转基因作物的混合样品(玉米,大豆,水稻,棉花和油菜)中也没有非特异性扩增产物出现,而PUBQ1在五类主要转基因作物的混合样品(玉米,大豆,水稻,棉花和油菜)中却有很多的非特异性扩增产物出现。灵敏度检测发现定性PCR LAM2检测方法的灵敏度达到质量百分含量0.01%,SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测结果表明LAM2的灵敏度可达到0.001~0.000 1 ng/μL。选择部分品种的PCR扩增产物进行测序,序列分析表明LAM2在不同品种的木薯的基因组DNA均可以扩增到293 bp的核苷酸片段,比对分析表明所获得的木薯不同品种中LAM2 PCR扩增片段的核苷酸序列一致没有发现变异位点。研究结果表明LAM2引物扩增系统初步符合内参照基因的种内一致性,稳定性,种间特异性的特点,灵敏度检测的要求可应用于转基因木薯成分定性和定量PCR检测。     

SYBR GreenⅡ黄芩18S rRNA基因实时荧光定量PCR方法的建立

利用SYBR GreenⅡ染料法,建立黄芩实时荧光定量PCR的反应体系。根据18S rRNA基因序列保守性,在18S rRNA基因保守区设计一对特异性引物,以常规PCR产物为标准品,浓度梯度稀释后制定标准曲线,对溶解曲线进行分析,对PCR退火温度,引物浓度,模板浓度等反应条件进行优化。结果表明:在20μL反应体系中,加入10μL SYBR Premix Ex Taq TM时,引物和cDNA最佳加入量分别为0.8μL和1.0μL;最佳反应程序:进行40次循环,95℃预变性30 s,95℃变性5 s,55℃退火30 s,72℃延伸30 s。标准曲线Ct的检测范围在14～29,扩增效率为97.8%;溶解曲线显示为单峰,其Tm为(85±1.0)℃。本研究建立的黄芩18S rRNA基因实时荧光定量PCR法,具有检测范围广,扩增效率高,特异性高等优点,对从分子水平阐明黄芩药效成分合成机制,筛选高产优质的黄芩种质资源具有重要的意义。     

SYBR Green I荧光定量PCR检测类猪圆环病毒因子P1

该研究旨在建立快速、敏感和特异的检测类猪圆环病毒因子 P1的 SYBR Green I 荧光定量 PCR 法,用于 P1 的早期诊断.以感染 P1 的猪血清DNA提取物为模板,采用 PCR 扩增 P1 101 bp 的基因片段,将其克隆至 pMD18-T 载体,重组质粒测序并进行同源性分析;以阳性质粒为模板,建立 SYBR Green I 荧光定量PCR检测方法,并进行敏感性和特异性检测.经测序证实扩增片段属于 P1,所建立的 SYBR Green I 荧光定量 PCR 检测 P1 的反应在 101 ～108拷贝/μL 之间具有良好的线性关系,反应的检出下限为10拷贝/μL,而对猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等的检测为阴性,表明该方法敏感、特异.成功建立了 SYBR Green I 荧光定量 PCR 检测 P1 载量的方法,为 P1 致病机制和机体免疫保护机制的研究提供了技术平台.     

转基因甜菜H7-1实时荧光PCR检测方法

运用实时荧光PCR方法对转基因甜菜H7-1外源基因FMV 35 S启动子、E93’终止子、CP 4-EPSPS外源基因和品系特异性进行了检测.建立了快速、准确的转基因甜菜H7-1转基因成分的PCR检测方法.本研究采用的FMV 35 S启动子、E93’终止子、CP 4-EPSPS和品系特异性检测引物探针能有效检测转基因甜菜H7-1中转基因成分,具有特异性,且灵敏度达到0.01％.     

黑龙江省大豆产区疑似转基因大豆的分子检测

利用表型鉴定和PCR分子检测相结合的方法,对黑龙江省国储库拒收的疑似转基因大豆进行了转基因成分检测.表型鉴定方法为草甘膦叶片涂抹,PCR分子检测对象为CaMV35S启动子、NOS终止子及目的基因CP4-EPSPS.利用大豆自身的凝集素基因作为PCR检测的内标基因,以有效排除DNA质量、实验操作等因素对检测结果的影响.结果表明,所测材料不抗草甘膦除草剂,也不合所检测的外源基因,由此判断该批次材料不是转基因大豆.     

转基因抗虫保铃棉(Bollgard(R))检测方法研究

运用常规PCR方法和实时荧光PCR方法对转基因抗虫保铃棉外源基因CaMV 35S启动子、NOS终止子、标记基因NPTⅡ和目的基因CryIA(c)进行了检测。建立了快速、准确的抗虫保铃棉籽转基因成分的PCR检测方法。     

电子PCR

电子PCR(Electronic PCR,e-PCR)现已是一种常用的核苷酸序列电子分析工具,它在DNA片段的染色体定位、基因组测序、基因组辅助作图、PCR引物辅助设计和基因的克隆等方面发挥着重要作用。本文介绍了电子PCR技术的原理、方法和功能及其相关的数据库和应用发展趋势。     

PCR技术及实用方法

本文系统介绍了PCR技术的原理，反应组分、反应程序及PCR产物的电泳检测方法。这些实用的：PCR方法大都来源于国内外一些著名的实验室并经海南省农作物分子育种重点实验室改进而成。这些方法作为分子植物育种实验室的技术平台具有非常好的实用性，能满足常规的分子生物学及生物工程技术研究的要求。     

Inter-Alu PCR like genomic profiling in banana

Alu sequences are a major repetitive element of the primate genome. To date Alu sequences have seldom been reported in plant genomes. We report here an inter-Alu PCR like genomic profiling in banana using a single primer designed from a human Alu sequence. The different Musa species involved in the complex genome of banana cultivars can thus be discriminated. The use of this technique for monitoring germplasm or genotyping cultivars is discussed. This revised version was published online in July 2006 with corrections to the Cover Date.     

猪等孢球虫PCR诊断方法的建立

参照GenBank收录的Isospora suis 18SrRNA基因全序列（U97523）,利用引物分析软件Oligo 6.57和Primer Premier 5.0设计了一对引物（上游引物：5'-tcctgcgagtactcatatgc-3';下游引物：5'-gttcagctacgcataccttg-3'）,首次扩增出猪等孢球虫分离株的18SrRNA基因序列,结合GenBank上登录的相关原虫序列,用DNAstar4.0软件比较其同源性,经Clustalx1.81序列比对,Paup4.0、Treeview3.0、Phylip种系发育关系软件分析后,证实该分离株为猪等孢球虫,并且河南不同地区之间的猪等孢球虫没有明显遗传差异     

锦鲤疱疹病毒ORF1基因的克隆、表达及多克隆抗体的制备

为了进行锦鲤疱疹病毒(Koi Herpesvirus Virus,KHV)诊断方法、疫苗研制和蛋白功能研究。通过选择基因保守性极强的ORF1基因作为研究对象,设计1对特异性引物进行PCR克隆。目的基因与表达载体PET构建重组质粒。将重组质粒转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)后诱导表达。再将成功表达的目的蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体。PCR产物经电泳显示,所扩增的基因长度774 bp,与目的基因长度相符。蛋白表达产物经SDS-PAGE和Western-bolt检测,重组表达质粒K1-PET成功诱导表达,表达蛋白为37.3 KD为包涵体。免疫小鼠获得多克隆抗体,经酶联免疫检测发现其效价达到1:27000,表明表达出的目的蛋白具有免疫原性,实验获得的表达蛋白和多抗血清为KHV的疫苗研制和免疫学检测方法的建立奠定了基础。     

一种快速低廉的PCR探针标记方法

【研究目的】探针标记技术是分子生物学和基因工程研究中常用实验技术,需要发展高效、快速、低成本、安全、简捷的DNA探针标记方法;【方法】利用普通的Taq酶进行PCR探针标记,电泳和Southern杂交检测探针标记结果;【结果】电泳检测发现标记产物在电泳时相对非标记的对照表现明显滞后,表明探针标记成功;电泳条带清晰明亮,表明探针标记效率高;Southern杂交条带清晰,说明该方法标记的探针可用于Southern等分子杂交实验;【结论】利用普通的Taq酶进行PCR探针标记,是一种低成本、高效、快速的DNA探针标记方法。     

实时定量PCR检测技术研究进展

传统定量PCR检测方法如内参照法和竞争PCR法,因为在达到平台期后才能对其进行检测,由于PCR扩增已经过了对数期,其检测重复性相对较差.而实时荧光定量PCR技术可直接监测PCR过程中荧光信号的变化,以获得目的区段扩增产物定量的结果,直接可以进行定性分析和定量分析,操作简便无污染.本文通过对实时荧光定量PCR检测技术的原理、分类、方法和应用4个方面阐述实时定量PCR检测技术研究进展.     

甘薯线虫病品种抗性的PCR检测

根据甜菜抗线虫病基因序列,人工合成了三条上游引物和三条下游引物,从中筛选出一对引物,对11份经抗线虫病常规鉴定的甘薯品种(包括6份高抗,2份抗病,3份感病)进行了PCR检测.结果表明:6份高抗品种和1份抗病品种出现了一条630 bp左右大小的特异片段,而3份感病品种未出现任何条带.这与常规鉴定的结果基本吻合,证明分子检测的可行     

PCR技术基本原理教学方法

分析了PCR第1至第6反应周期"长产物片段"与"短产物片段"类型、数量的变化,再用数学归纳法推导出第n个反应周期各种分子的数量。分析表明,PCR反应体系中的"长产物片段"有P,Q两种类型,"短产物片段"只有R一种类型;当循环数N=n时,Pn=2,Qn=Qn=2(n-2),Rn=2n-2n。将本分析方法用在教学中,有利于学生理解PCR的基本原理,教学效果理想。     

Optimizaiton of IMP PCR System Applied in Tobacco

为满足烟草遗传分析的需求,建立稳定的IMP标记扩增方法,对IMP分子标记体系进行了优化。本研究以烟草DNA为模板,利用Li-cor 4300凝胶分离系统,优化了模板、Mg2+、dNTP、聚合酶浓度等IRD荧光引物扩增反应体系主要参数,建立分析IMP标记的平台。结果显示,影响烟草荧光引物扩增反应最大的因素是dNTPs和引物浓度,反应体系对Mg2+浓度的要求较宽泛,同时,不同的引物对各因素的浓度要求也有差异。最终确定20 μL反应体系中,模板DNA 70 ng,Mg2+浓度2.0 mmol/L,dNTPs为0.2 mmol/L,rTaq DNA聚合酶1.5 U,引物浓度均为1 μmol/L。该体系扩增条带稳定,重复性好,适合烟草遗传多样性分析。