鸡生长激素的原核表达、纯化及活性研究

鸡生长激素(cGH)是由脑垂体前叶合成并分泌的一种重要的多肽类激素,对于鸡的生长发育具有至关重要的调控作用。为实现cGH的原核表达,将其序列插入原核表达载体pET-30a(+)中,构建重组表达质粒pET-30a-cGH,并转化大肠杆菌BL21(DE3),挑选阳性菌落液体培养IPTG诱导表达。SDS-PAGE检测显示,诱导产物在25 ku处含有与预期大小一致的蛋白条带;通过镍柱纯化,得到了较高纯度的cGH重组蛋白;用纯化得到的cGH重组蛋白处理鸡肝癌LMH细胞,检测其IGF-Ⅰ基因mRNA水平上调,证明所得到cGH蛋白具有生物学活性。研究结果为进一步研究cGH的结构、功能和生产应用奠定了基础。     

鸡生长激素受体研究的新进展

禽类生长的调控机制与哺乳动物相比有许多方面的差异。在哺乳动物,如猪、羔羊和肉牛,外源性生长激素（ＧＨ）可通过上调肝脏ＧＨ受体,提高血液中ＩＧＦ－Ⅰ（胰岛素样生长因子）的水平,促进动物生长。而在禽类,慢性注射ＧＨ并不提高血浆ＩＧＦ－Ⅰ水平和动物的生长速...     

生长激素与生长激素受体基因的表达

在动物生长轴中，GH是调控动物生长发育的核心激素，它具有促生长作用。但GH发挥生理作用的第一步是与靶细胞膜表面的GH受体(GHR)结合，由GHR介导将信号传入细胞内从而产生一系列生理效应。在生理激素浓度下，GH 与GHR 以1／2相结合。在超生理激素浓度下，激素饱和了所有的受体分子形成1／1的复合物，阻止了受体二聚化和信息传递。当GH水平提高而GHR基因表达没改善时，不仅GH的作用不能完全发挥，而且可能因为GH过剩而产生负反馈调节，影响其他生理功能。这可能是某些促生长激素轴功能的添加剂在使用一段时间后效果减弱的原因之一。因此，在直接或间接提高GH水平的同时，应该提高GHR基因表达水平，才能最大限度发挥GH的作用。促进GHR基因表达有促进动物生长发育和发展的趋势，可使畜禽生产性能在较高水平的情况下再上新台阶。     

银狐生长激素cDNA克隆和原核表达

为了获得重组的银狐生长激素,本试验用Trizol的方法从银狐脑垂体组织中提取总RNA,以mRNA为模板,用RT-PCR方法扩增出生长激素成熟cDNA片段并克隆到载体质粒pMD18-T中;通过含有BamHⅠ酶切位点的特异引物从pMD18-T-fGH中亚克隆出cDNA片段,并将其重组到pPROEX^TMHta质粒中,构建了银狐生长激素原核表达质粒pPROEX^TMHta-fGH。将pPROEX^TMHta-fGH原核表达质粒转化DH5α大肠杆菌,用终浓度1 mmol/L IPTG进行诱导,通过SDS PAGE进行检测。结果表明在转化的大肠杆菌中检测到分子量为26 kD的fGH蛋白的存在,表达量占菌体蛋白总量的35%,并且表达产物以包涵体的形式存在。     

鸡α干扰素的原核表达及纯化

根据大肠杆菌密码子的偏好性对Gen Bank中发表的鸡α干扰素基因序列进行了密码子优化,全基因合成了鸡α干扰素基因片段486 bp。构建原核表达质粒p ET-23b-Ch IFN-α。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG进行诱导表达,表达产物主要以包涵体形式存在,包涵体进行变性、复性和镍柱亲和纯化。表达产物经SDS-PAGE、WesternBlot分析表明,Ch IFN-α蛋白得到了高效表达,其蛋白分子质量约19 k D,经镍柱亲和纯化后获得了高纯度的重组鸡α干扰素蛋白,其含量为0.82 mg/m L。本研究为鸡α干扰素的生物学活性分析和临床产品研发奠定了基础。     

猪生长激素基因的原核表达及其抗体制备

通过构建pGH基因的原核表达质粒，转化大肠埃希氏菌TOP10，经IPTG诱导，成功表达了重组猪生长激素的融合蛋白。经SDSPAGE分析，在分子质量50．4ku处有1条新的特异蛋白质条带。对以包涵体形式表达的融合蛋白进行SDSPAGE分离，并经透析得到了重组融合蛋白，以此融合蛋白免疫家兔，制备并纯化了抗pGH多克隆抗体，经酶联免疫吸附测定、蛋白质印迹分析和免疫组织化学方法检测，此抗体具有较高效价和特异性。成功地表达了pGH基因并获得了多克隆抗体。     

鸡毒支原体黏附蛋白PvpA的原核表达与纯化

利用基因重组技术将PvpA基因的PCR扩增产物与原核表达栽体pET-41a(+)连接,转化入DH5a感受态细胞,通过PCR、双酶切及测序鉴定后,将阳性重组质粒转化入大肠杆菌BL21(D3)受体菌,用IPTG诱导蛋白表达.用纯化后的融合蛋白免疫新西兰大白兔,制备PvpA蛋白多克隆抗血清,并用Western blotting检验抗体特异性.结果表明,本研究成功获得PvpA纯化蛋白,在免疫印迹试验中,兔抗PvpA高免血清能与目的蛋白发生阳性反应,证实表达产物为特异性蛋白.     

性连锁矮小鸡生长激素受体基因位点多态性分析

本研究通过构建鸡基因文库克隆了鸡生长激素受体基因，用克隆的基因片段作探针，分析正常鸡和性连锁矮小鸡在生长激素受体基因位点的多态性，证实了矮小鸡在该基因位点存在突变     

鸡Mx基因的原核表达及表达蛋白抗病毒活性初步研究

将鸡Mx基因克隆入pET一32a载体,筛选鉴定后将重组阳性质粒转化到大肠埃希菌株BL21进行诱导表达,表达产物用west,ern blot鉴定,并经镍亲和层析法纯化及透析复性,得到的蛋白用微量细胞病变抑制法检测其抗病毒活性.结果显示,构建的载体经PCR扩增得到长度为2 118 bp的特异片段,测序结果证实与鸡Mx基因同...     

生长激素受体基因表达的研究进展

生长激素(growth hormone,GH)在促进动物生长、发育等代谢过程中起着重要作用。长期以来人们在研究动物生长发育机制及其调控时,主要着眼于提高生长激素水平。然而GH必须与靶器官上生长激素受体(growth hormone receptor,GHR)结合,由GHR介导将信号传入细胞内才能发挥作用。大量研究结果显示,动物生长速度与GH水平并不完全平行,但与肝脏GHR呈明显正相关。生长快的肉鸡血液中GH和垂体GH mRNA水平比生长慢的蛋鸡低,而肝脏GHR水平比蛋鸡高;患侏儒症动物血液中GH浓度却比正常动物高,而GHR胞外部分缺失或功能不全。可见GHR基因表达对动物生长发育调控起着至关重要的作用。     

鸡血管生成素样蛋白4重组蛋白的原核表达及其对肉鸡血清生化指标和激素水平的影响

本试验旨在实现鸡血管生成素样蛋白4(ANGPTL4)重组蛋白的原核表达,并探讨其对肉鸡血清生化指标和激素水平的影响。将带有His-SUMO标签的鸡ANGPTL4基因亚克隆到大肠杆菌原核表达载体pET21a(+)的NdeⅠ和XhoⅠ双酶切位点上,构建重组原核表达质粒pET21a-His-SUMO-ANGPTL4,将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)对其菌液进行诱导表达,经包涵体复性和复性蛋白的Ni柱纯化,得到预期大小的融合蛋白His-SUMO-ANGPTL4。将得到的鸡ANGPTL4重组蛋白按照0(对照)、20、100、500、2500和12500 ng/kg BW的剂量静脉注射给35日龄的健康爱拔益加肉公鸡,每个剂量注射6只,并于注射后30 min采集肉鸡的空腹血液。结果显示:1)与对照组相比,2500和12500 ng/kg BW鸡ANGPTL4重组蛋白组其血清葡萄糖(GLU)和极低密度脂蛋白(VLDL)含量均显著提高(P<0.05);同时,随着鸡ANGPTL4重组蛋白注射剂量从0增加到12500 ng/kg BW,血清GLU和VLDL含量均呈现一次线性和二次曲线增加的效应(P<0.05)。2)与对照组相比,20、2500和12500 ng/kg BW鸡ANGPTL4重组蛋白组血清生长激素水平显著降低(P<0.05);同时,随着鸡ANGPTL4重组蛋白注射剂量从0增加到12500 ng/kg BW,血清生长激素水平呈现一次线性和二次曲线降低的效应(P<0.05)。3)与对照组相比,20、100、500、2500和12500 ng/kg BW鸡ANGPTL4重组蛋白组血清瘦素水平显著降低(P<0.05)。由此可见,本试验实现了鸡ANGPTL4重组蛋白的原核表达,静脉注射2500和12500 ng/kg BW该重组蛋白均可显著提高肉鸡血清中GLU和VLDL含量,显著降低肉鸡血清中生长激素和瘦素水平。     

鸡生长激素在毕赤酵母中的表达、纯化和活性鉴定

生长激素（growth hormone,GH）与受体结合调节靶细胞的功能在机体的生长发育及代谢过程中起着极其重要的作用。为获得高纯度具有生物学活性的鸡生长激素（chicken growth hormone,cGH）,试验将C端融合了6个组氨酸的cGH成熟片段基因序列克隆入毕赤酵母表达载体pPIC9K中,使用电转法将重组质粒导入毕赤酵母GS115,以1%的甲醇诱导重组菌（GS115-pPIC9K-cGH）96 h,表达大小约为25 ku的目的蛋白cGH,经Ni离子亲和层析和聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶层析获得95%以上的cGH重组蛋白。实时荧光定量检测结果表明,纯化的cGH重组蛋白可刺激鸡肝癌细胞LMH内的胰岛素样生长因子Ⅰ（insulin-like growth factor Ⅰ,IGF-Ⅰ）基因的mRNA表达上调,表明所发酵纯化的重组蛋白cGH具有生物学活性,这为其结构和功能的研究及生产应用奠定了基础。     

Expression,Purification and Biological Activity Identification of Chicken Growth Hormone in Pichia pastoris

The growth hormone（GH）regulated diverse functions of the target cells through binding its receptor and played important roles in the process of metabolism of the body's growth and development.In order to obtain high purity chicken growth hormone（cGH）with biological activity,the gene segment of the mature cGH with six histidine at the C terminus was cloned into the expression vector pPIC9K.The recombinant plasmid（pPIC9K-cGH）was transformed to Pichia pastoris（GS115）by electroporation to construct the recombinant Pichia pastoris（GS115-pPIC9K-cGH).The GS115-pPIC9K-cGH secreted the recombinant protein（cGH）whose molecular weight was about 25 ku induced by 1% methanol induction for 96 h.The purity of cGH attained at least 95% through using Ni affinity chromatography and polyacrylamide glucan gel chromatography to purify the recombinant protein.The results of Real-time quantitative-PCR showed that the purified cGH recombinant proteins could up-regulate its target gene insulin-like growth factor Ⅰ（IGF-Ⅰ）mRNA in chicken liver cancer cell（LMH).It certified that the recombinant cGH protein had biological activity.This study laid a foundation for research of the structure,function and application of cGH.     

免疫生长激素受体胞外域N端片段对鸡生长的影响研究

为了探讨通过与生长激素受体（growth hormone receptor,GHR）胞外域（extracellular domain,ECD）特异结合的抗体能否激活或抑制GHR的信号传导,从而调节动物的生长,本试验首先通过基因工程途径制备了鸡GHR N端120个氨基酸残基的GHR ECD重组蛋白,并以此蛋白作为抗原免疫生长鸡,观察对鸡采食、生长和胴体组成的影响。高、低剂量组血液中抗GHR抗体水平在免疫后极显著上升（P<0.01）,并在试验期间处于极显著高于对照组的非特异水平（P<0.01）。免疫GHR ECD显著抑制了鸡的生长（P<0.05）,使高、低剂量组鸡在首免后第30天体重就已经显著低于对照组鸡并持续至试验结束（P<0.05）。在增重受抑制后,免疫GHR鸡在后期的采食量也显著降低（P<0.05）。屠宰时对照组的体重、屠宰率、半净膛率、全净膛率和腹脂率都高于2免疫组。以上数据说明,对生长鸡免疫GHR ECD所产生的抗GHR抗体将显著抑制鸡的生长,这一方法并不能促进鸡或其他动物的生长性能,但有可能被应用于其他需要限制动物生长如后备种鸡的培育方面。     

猪生长激素促分泌素受体基因真核表达载体的构建及鉴定简

本试验旨在构建猪生长激素促分泌素受体（pGHS-R）真核表达系统,并瞬时转染人源胚胎肾细胞（HEK293T）观察其表达情况。以猪基因组为模板,通过剪接重叠延伸聚合酶链式反应（SOE-PCR）克隆出pGHS-R的编码区序列,插入真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)/pGHS-R,酶切鉴定并测序,加myc标签,瞬时转染HEK293T细胞,用Western blotting鉴定该重组质粒是否能在真核细胞中表达相应的目的蛋白。结果显示,本试验成功扩增出pGHS-R编码序列,酶切和测序结果表明pcDNA3.1(+)-myc/pGHS-R构建正确,Western blotting方法证实转染的该质粒能在HEK293T细胞中正确表达目的蛋白。结果表明,本试验成功构建了pGHS-R真核表达载体,并正确表达蛋白,为进一步研究GHS-R的功能奠定了基础。     

鸡促卵泡素及其受体基因在多个非繁殖组织中的表达研究

本研究利用PCR和免疫组化等方法,对FSHR和FSH基因在鸡多个非繁殖系统的组织器官中的mRNA和蛋白水平的表达以及相关性进行了分析.结果显示:在心脏、肝脏、肾脏、肺和十二指肠中FSHR mRNA和蛋白以及FSH蛋白水平具有相同的表达趋势,表达丰度从大到小依次为肝脏、心脏、肾脏、肺和十二指肠.而在脾脏、胃、腿肌和胸肌中未检测到FSHR mRNA和蛋白以及FSH蛋白水平的表达;在检测的9个组织中,均无FSHmRNA的表达.相关性分析结果表明,在肝脏、心脏、肾脏、肺和十二指肠中各组织器官质量与组织中的FSH蛋白水平具有显著或极显著的正相关(P＜0.05或P＜0.01);各组织中的FSHR mRNA和蛋白水平均与FSH蛋白水平存在显著或极显著正相关(P＜0.05或P＜0.01).本研究初步证明,机体其他部位表达分泌的促卵泡素,在多个非繁殖组织器官(肝脏、心脏、肾脏、肺和十二指肠)中通过调控促卵泡素受体基因的表达来影响北京油鸡不同组织的发育.     

京海黄鸡G蛋白偶联受体1基因生物信息学及组织表达分析

试验旨在研究参与激素调节并调控卵巢功能的可能基因,挑选候选基因G蛋白偶联受体1（G protein-coupled receptor 1）,深入研究其是否参与激素调节。根据转录组测序获得的京海黄鸡GPR1基因的CDS序列设计一对引物,利用实时荧光定量RT-PCR方法,检测GPR1基因在高、低产京海黄鸡卵巢组织中的表达情况,并与生物信息学进行关联,使用多种生物软件和在线工具对目的序列进行生物信息学分析,分析GPR1基因与其他物种的同源性、蛋白质的理化性质、蛋白质序列的跨膜区、亚细胞定位、亲水性、潜在的磷酸化位点、保守结构域及该基因所编码蛋白质的二、三级结构。结果显示,京海黄鸡与GenBank中原鸡、人、牛、野猪、黑猩猩、家兔、马、绵羊、藏羚羊、大鼠、小鼠、斑马鱼的同源性分别为100.0%、69.0%、69.1%、69.3%、68.9%、69.6%、69.2%、68.8%、68.9%、67.5%、69.0%和50.3%;氨基酸分析发现GPR1蛋白为疏水性蛋白,分子质量为40.41 ku,理论等电点为6.91,为7次跨膜蛋白;亚细胞定位显示,该蛋白属于非分泌蛋白;预测该蛋白含有25个潜在的磷酸化位点,1糖基化位点;二级结构以无规则卷曲为主,三级结构为7次跨膜螺旋结构;组织表达分析显示,GPR1基因在低产组的表达情况极显著高于高产组（P<0.01）。本试验结果将有利于GPR1基因功能的进一步分析,为研究该基因对京海黄鸡产蛋性状的调控机理提供理论依据。