鉴别MS-H疫苗株和MS野毒株的MAMA-PCR检测方法的建立与初步应用

根据Kreizinger Z等~([1])已发表的研究,依据obg基因第367位和629位的核苷酸转换,我们建立了依托琼脂糖凝胶电泳(常规PCR)的错配扩增突变分析(MAMA)方法以区分ts+MS-H疫苗株、ts-MS-H再分离株以及MS野毒株。本研究对本实验室保存的客户送检的MS分离株的阳性病料,以及日常场区送检咽喉拭子MS通用引物检测的阳性样品进行MAMA-PCR扩增,用以比对各分离株目的片段的差别,建立MS-H疫苗株与MS野毒株的鉴别方法,这将为临床鸡群MS感染状态的评估提供参考依据,也为MS的净化和防控提供技术指导。     

鸡源血清4型禽腺病毒的分离鉴定

山东、河北等华北地区12个肉鸡养殖场出现了以心包积液、出血性肝炎为特征的疾病,从采集的病料中进行病毒分离鉴定。本研究对分离的毒株进行PCR扩增、血凝试验、ELD_(50)测定、Hexon基因序列测定与分析以及人工感染试验进行组织病理学观察、抗体水平检测等一系列试验。结果显示,分离的毒株不能凝集鸡和鸭的红细胞,但能够凝集大鼠的红细胞,ELD_(50)为10-3.17/0.2mL。组织学变化显示肝细胞纤维化和脂肪变性,肾小管上皮细胞肿胀、变性,心肌纤维水肿、颗粒变性。对临床采集的血清检测结果显示发病鸡群抗体水平为阳性,发病鸡群中的健康鸡阳性率为40%(40/100),表明鸡群中存在隐性感染。将分离株的Hexon基因组与已发表的血清4型禽腺病毒基因进行同源性比较,发现该分离株与印度株在同一个分支上,同源性在99.6%以上,而与韩国、欧洲、美洲株同源性较远。用分离的毒株感染15日龄的雏鸡能引起心包积液、肝脏出血、肾脏肿大等病变。上述结果表明该分离株为血清4型禽腺病毒。     

鸡粪便来源大肠杆菌的质谱法快速鉴定及聚类分析

为了比较PCR和基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)方法鉴定大肠杆菌的一致性,研究分别利用这两种方法对从浙江省12个不同地区养鸡场初步分离得到的大肠杆菌进行鉴定。结果显示:利用MALDI-TOF MS鉴定大肠杆菌的准确率为99.1%,PCR鉴定准确率为100%,但MALDI-TOF MS较PCR能够进行更快速的鉴定。利用MALDI-TOF MS对大肠杆菌分离株进行的聚类分析可以将分离株分为两种类型。研究表明,MALDI-TOF MS法能够快速、高效地完成对大肠杆菌的鉴定,并且能够进行聚类分析。     

川西地区鸡滑液囊支原体分离株的部分生物学特性及其VlhA基因遗传进化分析

为了解鸡滑液囊支原体(MS)在川西地区的感染情况,本研究采集15个肉鸡场疑似MS感染的病鸡咽拭子、跗关节和胸部滑液囊样本共75份,对经PCR检测为阳性的样本进行MS分离,并对分离株的主要生物学特性进行研究,以及对分离株的VlhA基因进行遗传进化分析。结果显示,75份样本MS PCR阳性检出率为41.33%(31/75),11个鸡场感染该病,场阳性率为73.33%(11/15);但仅从其中3个鸡场分离到9株MS,分离株菌落与菌体形态与已知MS培养特性相符,各分离株培养浓度为10~4CCU/mL^10~6CCU/mL,分离株以5×10~5CCU接种7日龄SPF鸡胚,鸡胚于接种后7 d^9 d死亡,且分离回收到接种菌株;9株MS分离株VlhA基因的同源性为86.1%~99.9%,与参考株同源性为86.2%~95.4%,其中分离自同一鸡场的7株MS VlhA基因同源性为96.4%~99.9%;分离株VlhA基因遗传进化分析显示,其中分离自两个不同鸡场的两株MS与国内流行株的亲缘关系最近,而分离自另一鸡场的7株MS与中东地区分离的3株MS亲缘关系较近,表明MS在川西地区肉鸡场呈高感染率,MS VlhA基因变异较大。本研究为川西地区MS的进一步研究提供了基础材料和科学依据。     

黄羽父母代种鸡混合感染禽白血病病毒与马立克病病毒的鉴定

广西某养殖场130日龄父母代种鸡发生临床肿瘤样病变和死亡,对病鸡采用病理解剖、组织病理学观察、PCR检测、病毒分离以及分离株重要基因的序列测定和病原鉴定。结果显示:病鸡的心脏、肝脏、脾脏等部位表现有肿瘤样病变; PCR检测及病毒分离培养有J亚群禽白血病病毒(avian leukosis virus subgroup J,ALV-J)和马立克病病毒(Marek's disease virus,MDV)的感染; ALV-J分离株env基因的序列与10株ALV-J参考株的核苷酸相似性为87. 2%～97. 7%,与ALV A-E亚型参考株的相似性为53. 5%～54. 7%;与ALV-J英国原型株HPRS-103的env基因糖基化位点进行分析比较,部分糖基化位点发生了改变; MDV分离株meq基因序列与8株MDV参考株的核苷酸相似性为98. 7%～99. 4%,分离株在第71～80位氨基酸发生突变,符合国内强毒分离株的特征。结果说明:该鸡群为ALV-J和MDV的混合感染。     

中国部分地区鸡传染性贫血流行病学调查及病原分离鉴定

为了调查近年来鸡传染性贫血病(CIA)在我国发病鸡群中的流行特点、分布及其危害,本研究于2016年1月～2019年9月,从黑龙江、北京、山东等13个省市的381个疑似CIA发病鸡群中采集肝脏样品1 677份,PCR检出鸡传染性贫血病毒(CAV)阳性样品共242份,分布于85个鸡群,阳性样品检出率为14.43%(242/1 677),阳性鸡群率为22.31%(85/381)。CAV与鸡马立克氏病病毒、鸡白血病病毒等免疫抑制病病毒混合感染在检测鸡群中普遍存在,占CAV感染总量的52.94%(45/85)。将来自山东临沂某CAV阳性鸡场的病鸡肝脏样品处理后接种MDCC-MSB 1细胞,连续传代6次,经PCR及间接免疫荧光鉴定,确定分离到一株CAV细胞适应病毒株,命名为CAV-SD19/4604。对分离株VP1基因测序并与GenBank中19株CAV参考株VP1基因序列比对,显示同源性为95.00%～98.80%,遗传进化树表明CAV-SD19/4604与多数亚洲病毒株位于同一分支。本研究为CAV感染的研究和疾病防控提供了数据支持。     

地方特色蛋鸡配套系亲本群中不同亚群禽白血病病毒的混合感染

采用ELISA、病毒分离和多聚酶链式反应(PCR)方法对江苏某地方特色蛋鸡亲本群的禽白血病病毒(ALV)p27抗原、ALV-A/B和ALV-J抗体以及病原核酸进行了检测,结果显示该配套系母本群泄殖腔拭子p27抗原阳性率为40.6%,ALV-A/B抗体阳性率为3.8%;父本群泄殖腔p27抗原阳性率为24.4%,ALV-J抗体阳性率为19.4%;细胞培养物IFA检测显示父本分离株JS12JD03能与J亚群特异单克隆抗体Je-9反应,在荧光显微镜下产生绿色荧光,而母本分离株JS12JD01和JS12JD02则无;gp85氨基酸序列同源性分析显示母本鸡群分离株JS12JD01属于A亚群、JS12JD02属于B亚群,父本鸡群分离株JS12JD03属于J亚群ALV,提示了该地方特色蛋鸡亲本群存在A、B、J亚群ALV的混合感染。     

地方特色蛋鸡母本群禽白血病病毒感染的鉴定

研究采用ELISA、病毒分离和PCR方法对地方特色蛋鸡配套系母本鸡群的ALV抗体、抗原和核酸等进行了检测,结果显示受检种鸡群泄殖腔棉拭p27抗原阳性率为47.8％,A/B抗体阳性率为4.3％,未检测到J亚群抗体阳性个体,表明鸡群感染ALV-A/B,同时分离出两株外源性禽白血病病毒并命名为JS12JD01和JS12JD02.PCR扩增其囊膜蛋白基因并测序分析,结果显示JS12JD01株与A亚群参考株的gp85氨基酸序列同源性较高,与B、C、D、E和J亚群参考株同源性仅为32.5％～82.8％;JS12JD02分离株与B亚群参考株的gp85氨基酸序列同源性较高,而与A、C、D、E和J亚群参考株的同源性仅为34.6％～88.7％.表明这两株分离株分属于A、B两个不同亚群,该鸡群存在A、B亚群ALV的混合感染.     

鸡滑液囊支原体贵州株的分离鉴定及VlhA基因序列分析

【目的】 获得鸡滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae,MS)贵州流行株,以进一步开展其病原学及免疫学相关研究。【方法】 从贵州省织金县某肉鸡场共采集107份疑似MS感染病鸡的咽拭子、肿胀关节和脚垫、肿胀组织渗出物进行PCR检测,对PCR筛选的阳性组织样本进行MS分离培养,并进行瑞氏染色、生化试验及VlhA基因序列分析。【结果】 PCR检测筛选到20份阳性样本,从关节和爪垫阳性样本中分离到1株疑似MS,分离株在平板上生长出"煎蛋状"菌落;瑞氏染色可见蓝色细小的球形菌;生化试验中,分离株分解葡萄糖和麦芽糖,但不分解精氨酸、尿素等,与MS标准株生化结果一致;分离培养物经PCR扩增得到821 bp的目的片段;分离株VlhA基因核苷酸相似性分析表明该分离株为MS,与GenBank登录的国内其他地区流行株相似性有地域差异。与安徽、重庆、福建、广东、广西、湖北、湖南、江苏和云南等地区流行株相似性在90.3%~99.7%之间;该分离株与湖南MS流行株相似性最高,达到99.7%;但与国外参考流行株的相似性低;VlhA基因遗传进化树分析显示,该分离株与国内参考株亲缘关系较近,与国外参考株亲缘关系较远。【结论】 本研究成功从引起关节和足垫肿胀的鸡中分离鉴定了1株MS贵州流行株,该分离株存在一定变异,为贵州省MS的分子生物特征及本病的诊断和防控研究提供了基础依据。     

应用PCR快速检测鸡滑液囊支原体的研究

根据鸡滑液囊支原体(MS)16S rRNA设计引物,对1株MS阳性株、5株临床分离鉴定的MS、2株鸡毒支原体、1株多杀性巴氏杆菌、1株沙门菌、1株大肠杆菌和1株金黄色葡萄球菌进行PCR扩增,结果显示所有MS均出现1 077 bp特异性扩增条带,其余非MS则均未扩增出特异性条带。敏感性测定结果表明,优化的PCR反应体系能检出MS的最低DNA量为1 pg。建立的PCR方法用于快速检测临床样品检测,对鸡肿胀跗关节腔内容物直接进行PCR检测,检出率为21.1%(32/152),显著高于病原分离方法的9.2%(14/152),具有良好的实际应用意义。     

鸡毒支原体(MG)疫苗株和野毒株的PCR鉴定

针对由于鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum, MG)不同毒株(针对TS-11、6/85、F株疫苗株和S6、R株野毒株)的特定序列,设计出特异性检测引物,对临床免疫MG疫苗株TS-11的鸡群以及父母代(A～H场)鸡群和祖代(I场)鸡群采集毛蛋气囊拭子,A场父母代种鸡群和I场祖代鸡群同时采集咽喉拭子进行MG的PCR鉴别诊断,对临床送检免疫6/85的客户鸡群(J场)采集病料,F株疫苗株进行MG的鉴别诊断,同时采集SPF鸡群咽喉拭子作为阴性对照群,验证该鉴别引物的特异性。结果显示:鉴别引物具有非常好的特异性,SPF鸡群MG的检测均为阴性,不存在假阳性的弊端;临床免疫MG疫苗株6/85的鸡群(J场)存在MG野毒株S6的感染,在免疫后1个月左右采集病料中仍能检出MG 6/85疫苗株。对免疫TS-11的父母代种鸡群(A～H场)和祖代种鸡群(I场)死亡的毛蛋气囊拭子,用PCR检测MG阳性率,结果显示:祖代鸡群(I场)后代死亡的毛蛋气囊评估结果为优,毛蛋气囊拭子MG的PCR鉴别引物检测均为阴性;而父母代鸡群后代死亡的毛蛋气囊从50周龄开始出现浑浊,MG的PCR鉴别引物可同时检出TS-11疫苗毒和野毒株,部分鸡群同时存在R株和S6株两种野毒感染;采集A场父母代种鸡群的咽喉拭子和后代啄壳死亡毛蛋气囊拭子,PCR检测结果显示种鸡群和后代可同时检出野毒株S6和疫苗株TS-11。这表明种鸡群MG的感染,可通过垂直传播感染其后代。本研究设计的MG鉴别引物,可将不同MG疫苗株(TS-11、F株、6/85)与野毒株(S6株、R株)区分,为临床MG的鉴别诊断和种鸡群的MG感染状态评估提供积极的指导意义。     

新疆部分地区羊泰勒虫病的流行情况调查

为了解新疆地区羊泰勒虫的感染情况,本研究在新疆阿勒泰地区、巴州地区和哈密地区随机采集山羊和绵羊血样(679份),对其进行18S rRNA PCR检测及其基因序列比对分析。结果显示,新疆阿勒泰地区、巴州地区和哈密地区羊泰勒虫病阳性率分别为23.3%(63/270)、7.63%(12/163)和5%(12/246),且均为绵羊泰勒虫病;基于18S rRNA基因序列比对分析,显示分离的虫株与新疆喀什、土耳其分离的虫株同源性为99.8%;系统发育进化树分析显示,分离株同喀什株、土耳其株、伊拉克株进化关系一致,与坦桑尼亚株、苏丹株、法国株、西班牙株进化关系相差较远。本试验结果表明,新疆阿勒泰地区、巴州地区及哈密地区均存在绵羊泰勒虫的感染情况,本研究结果为新疆羊泰勒虫病综合防控奠定基础。     

江苏地区副猪嗜血杆菌病流行现状调查

为了分析副猪嗜血杆菌病在江苏区域流行现状,选取江苏省不同地区疑似发病猪场,进行临床症状分析、病理学变化观察、病原分离鉴定、血清学检测等试验。结果显示:317份病料中副猪嗜血杆菌(Haemophlius parasuis, HPs)阳性率为11.54%～27.55%,平均感染率为20.50%;从发病猪场共分离到HPs 43株,其中优势血清型为12型(37.21%)、4型(16.28%)和5型(13.95%),未定型菌株9株(20.93%),分型菌株占所有菌株的79.07%;PCR检测显示,HPs与猪圆环病毒(PCV2)、猪伪狂犬病毒(PRV)存在混合感染现象,感染率达30.77%。研究结果为江苏地区副猪嗜血杆菌病的防制提供了参考。     

山东不同品系蛋鸡禽白血病流行病学调查

为了解山东不同品系蛋鸡白血病流行情况,作者采集了山东各地区主要引进品系及地方品种鸡的血清3882份、棉拭子2428份和疑似病例41例,对采集样品分别进行了血清学、病理学及病原学检测.结果表明:包括祖代鸡在内的各品系蛋鸡群P27抗原阳性率为19.36%;ALV-A/B亚型抗体阳性率9.29%、ALV-J亚型抗体阳性率5.18%、REV抗体阳性率13.77%;发病鸡群主要是商品鸡群和父母代鸡群,海兰褐祖代鸡群也有发病;病理学诊断证明肿瘤类型主要为髓细胞瘤(27/41)、血管瘤或血管内皮细胞瘤(7/41)、纤维肉瘤(2/41)、平滑肌肉瘤(2/41)及马立克氏病(5/41);PCR检测结果显示,41份病料中有33份为ALV-J阳性(80.49%);22份为MDV阳性(53.66%);两者共感染率高达43.9%;从疑似病例分离到的17株ALV-J病毒gp85基因的同源性为94.0%～100%,与ALV-J原型株HPRS-103 gp85基因同源性为94.3%～98.7%;与其它已发表的分离毒株ALV-J gp85基因的同源性较低(84.4%～96.8%).调查结果表明,目前山东各品系蛋鸡群均存在ALV感染,其中以ALV-J为主,ALV-A和ALV-B同时存在,且存在与MDV、REV的混合感染,病鸡主要表现髓细胞瘤和血管瘤.     

三种血清学方法和qPCR方法在鸡滑液囊支原体检测中的综合应用研究

为评价不同方法对鸡滑液囊支原体（MS）活疫苗免疫和非免疫状态鸡群的监测效果,研究分别采用HI、SPA与ELISA三种抗体检测方法和qPCR方法同步对某养殖场A、B和C三组鸡群进行MS感染和抗体水平监测,其中A鸡群23日龄免疫MS活疫苗（MS-H株）,B、C鸡群不免疫MS疫苗。结果显示：三种血清学检测方法所测MS抗体阳性率趋势基本一致,HI抗体效价变化规律和ELISA抗体效价变化规律相似,但血清学方法相对于qPCR方法具有一定的滞后性,qPCR可以最早发现MS野毒感染,且在使用活疫苗免疫的情况下对疫苗和野毒进行鉴别检测。研究提示：在条件允许的情况下,qPCR可以作为MS首选的监测方法;当检测条件受限时,上述三种血清学方法同样也可以用于评估MS野毒感染状况,但对结果的判断受母源抗体水平、疫苗免疫状况、野毒感染时间等多重因素的影响,在结果判断时应进行综合分析。     

一起蛋鸡滑液囊支原体病的诊疗、跟踪监测及体会

本文对青岛市某蛋鸡场发生的一例鸡滑液囊支原体病进行了诊疗分析,并跟踪监测阳性率变化情况。分析结果显示,该鸡群感染滑液囊支原体后抗生素治疗效果甚微,免疫鸡滑液囊支原体活疫苗(MS-H株)后1周未出现临床症状,实验室跟踪监测检测病原,阳性率逐渐降为0。鸡滑液囊支原体病是由鸡滑液囊支原体(Mycoplasma Synoviae,MS)引起的一种以关节渗出性的滑液囊膜炎及腱鞘滑膜炎为特征的急性或慢性传染性疾病,既可以垂直传播又可以水平传播,3~14周龄蛋鸡易感。感染后的鸡关节肿大、腿瘫、生长发育迟缓,死淘率高达10%~30%,产蛋鸡产蛋率下降,给蛋鸡养殖带来较大的经济损失。     

冀南地区滑液支原体分离鉴定及耐药性分析

【目的】了解中国冀南地区滑液支原体(Mycoplasma synoviae,MS)的流行和耐药情况,为该地区防控MS感染提供科学依据。【方法】于2019—2022年采集冀南地区疑似MS感染的7个规模化鸡场样品(发病鸡的气囊、腭裂或爪垫渗出液)进行病原分离培养及PCR鉴定,对分离株进行vlhA基因分型序列分析,采用微量肉汤稀释法测定分离株最小抑菌浓度(MIC)。【结果】所采集样品中分离出9株疑似MS菌株,均可使液体培养基颜色变为橘黄,在固体培养基中菌落形态为典型的“煎荷包蛋”样;PCR鉴定及测序结果显示,9株分离株与MS HN01株相似性为100%,表明分离株均为MS;vlhA基因分型序列结果显示,9株MS富含脯氨酸重复序列(PRR)区均为35个氨基酸,属于L型,核苷酸序列相似性为99.7%～100%,与中国其他地区L型菌株亲缘关系较近,与泰国L型菌株亲缘关系较远;MIC测定结果显示,9株MS对泰乐菌素、替米考星、螺旋霉素、林可霉素、沃尼妙林、泰妙菌素、多西环素、土霉素、氟苯尼考、恩诺沙星的MIC_50/90值分别为0.25/0.25、0.5/0.5、0.5/0.5、...     

地方品系蛋鸡感染J亚群禽白血病病毒的诊断

对临床上发生肿瘤病例的地方品系蛋鸡进行剖检,采集病料与血液样品接种DF-1细胞进行病毒分离、禽白血病病毒(ALV)p27抗原检测、间接免疫荧光试验、PCR鉴定及测序分析。结果显示,该鸡群存在ALV-J的感染,分离到的2株ALV-J,分别命名为JS16LK01和JS16LK02。这两个分离株与ALV-J参考株gp85氨基酸同源性为87.0%~93.6%,与其他亚群ALV同源性在42%以下,两分离株同源性为91.4%,等于或低于与ALV-J原型毒HPRS-103株的同源性,变异较大。     

2014年广西地方鸡群病毒性肿瘤病例的检测分析

2014年,广西地区部分鸡群发生了以内脏出现各种肉眼可见肿瘤、生长阻滞、消瘦和采食量下降为特征的病例。通过对病鸡进行肉眼剖检观察,对病料组织分别进行肿瘤病毒PCR检测、DF-1细胞分离培养及其细胞培养上清进行禽白血病病毒(ALV)p27抗原检测,结果显示12批病例中,单独感染ALV的鸡群有5群,单独感染马立克氏病病毒(MDV)的鸡群有1群,ALV与MDV的二重混合感染鸡群有4群,MDV和网状内皮组织增殖病病毒(REV)的二重混合感染的鸡群有1群,ALV、MDV和REV的三重混合感染有1个鸡群。表明ALV的感染及其与其他肿瘤病毒的共感染是当前临床肿瘤病例的主要病因。     

龙胜凤鸡中一株A亚群禽白血病病毒的基因组分析及其对SPF鸡的致病性研究

为了解中国地方品系鸡中禽白血病病毒(ALV)的基因组序列特征及其致病性,本研究通过DF-1细胞接种、间接免疫荧光和PCR等方法,从某龙胜凤鸡保种鸡群的种蛋中分离到一株A亚群ALV(ALV-A),命名为SDAU14A1株,并对其全基因组进行测序。将该序列与不同参考病毒株进行序列对比,结果显示SDAU14A1分离株与日本矮脚鸡分离株Tym S_90全基因组同源性最高,其U3区同源性达到100%,而与其它中国地方品系鸡分离株同源性较低。人工感染试验显示该病毒分离株感染SPF鸡后不仅引起感染鸡的生长迟缓和免疫抑制,还能够诱发淋巴细胞肿瘤,特别是具有较强的水平传播能力。本研究有助于了解我国地方品系鸡群中ALV-A的分子演变及其致病性,为我国地方品系中ALV净化提供参考依据。