孕酮对奶牛子宫内膜上皮细胞MAPK信号通路的影响

本试验旨在探究孕酮对奶牛子宫内膜上皮细胞MAPK信号通路的影响。选取与奶牛产后体内相似浓度的孕酮作用于奶牛子宫内膜上皮细胞,模拟产后子宫内分泌环境,检测MAPK通路关键蛋白表达的变化。结果发现,不同浓度孕酮均未对细胞活性产生影响,且20 ng/m L浓度范围内的孕酮对奶牛子宫内膜上皮细胞无毒性作用。用0、1、3、5 ng/m L孕酮处理30 min后,并未对子宫内膜上皮细胞ERK、JNK和P38的磷酸化产生显著作用,且不同浓度孕酮之间也没有显著差异。由此得出结论,外源性孕酮不能通过直接抑制奶牛子宫内膜上皮细胞MAPK的活化起抗炎效应。     

NF-κB信号通路调控奶牛乳腺炎的分子作用机制

乳腺炎通常是由微生物感染引起的乳腺炎症反应,是奶牛最常见的疾病之一,可导致牛奶产量及品质下降,奶牛利用年限减少,严重地影响着牧场的经济效益。近年来,学者们在奶牛乳腺炎分子调节机制方面开展了大量研究,发现NF-κB及其信号通路可参与调控多个免疫相关基因的表达,在细胞炎症反应和免疫应答等过程起关键性作用,也是奶牛乳腺炎研究的热点。本文阐述了奶牛乳腺炎的病因和病理变化,以及NF-κB信号通路与机体免疫的关系,并重点综述了mRNA、非编码RNA（miRNA、lncRNA和circRNA）及生物活性物质通过NF-κB信号通路调控奶牛乳腺炎的最新研究进展,为奶牛乳腺炎的分子调控网络解析、抗乳腺炎分子育种与生物活性药物研发提供参考。     

大肠杆菌对奶牛子宫内膜上皮细胞炎性损伤的研究

试验旨在研究大肠杆菌（E.coli）对奶牛子宫内膜上皮细胞（bovine endometrial epithelial cells,BEECs）的体外炎性损伤,探究大肠杆菌引发炎性反应的最佳浓度、作用时间及机制。首先,用不同浓度的大肠杆菌（5×10⁴、5×10⁵、1×10⁶、2.5×10⁶、5×10⁶ CFU/mL）诱导刺激细胞3、6和9 h,通过倒置显微镜观察细胞形态、CCK-8法测D_{450 nm}值,检测大肠杆菌对细胞活性的影响;其次,用不同浓度的大肠杆菌（5×10⁴、5×10⁵ CFU/mL）处理细胞3、6和9 h,用ELISA方法检测细胞上清液中白介素-1β（IL-1β）、IL-6、IL-8和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的分泌量;最后,用不同浓度的大肠杆菌（5×10⁴、5×10⁵ CFU/mL）处理细胞6和9 h,用Western blotting检测核因子κB抑制蛋白α（IκBα）和p65蛋白的磷酸化水平。结果显示,与对照组相比,大肠杆菌感染细胞9 h后,1×10⁶、2.5×10⁶和5×10⁶ CFU/mL大肠杆菌组细胞活性均极显著降低（P<0.01）,5×10⁵ CFU/mL大肠杆菌组显著降低（P<0.05）;大肠杆菌感染细胞9 h后,5×10⁵ CFU/mL大肠杆菌组IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α极显著升高（P<0.01）;大肠杆菌感染细胞6 h后,5×10⁵ CFU/mL大肠杆菌组IκBα、p65蛋白磷酸化水平和IL-6均极显著升高（P<0.01）,5×10⁴ CFU/mL大肠杆菌组IκBα和p65蛋白磷酸化水平显著升高（P<0.05）。结果表明,大肠杆菌可以刺激奶牛子宫内膜上皮细胞产生炎性反应,且当细胞与5×10⁵ CFU/mL大肠杆菌作用6 h或与5×10⁴ CFU/mL大肠杆菌作用9 h为最佳。     

孕酮对奶牛子宫内膜上皮细胞Wnt/β-catenin信号通路关键蛋白表达的影响

为研究孕酮对奶牛子宫内膜上皮细胞Wnt/β-catenin信号通路关键蛋白表达的影响,本试验以原代奶牛子宫内膜上皮细胞为材料,添加不同浓度孕酮(0、1、3、5 ng/mL)对其培养,采用CCK-8法检测孕酮对细胞增殖的影响;免疫印迹法检测孕酮对Wnt/β-catenin信号通路关键蛋白表达的影响。结果表明:与对照组相比,添加1、3 ng/mL孕酮组奶牛子宫内膜上皮细胞增殖率提高(P>0.05),5 ng/mL孕酮组细胞增殖率降低(P>0.05);与对照组相比,1 ng/mL和3 ng/mL孕酮组Wnt/β-catenin信号通路关键蛋白β-catenin、cyclin D1和c-Myc的表达水平均升高(P<0.01),而5 ng/mL孕酮则抑制了β-catenin的表达(P<0.05),且cyclin D1和c-Myc蛋白表达较3ng/mL孕酮组有下降趋势(P>0.05)。综上,高浓度孕酮抑制了体外培养的原代奶牛子宫内膜上皮细胞Wnt/β-catenin信号通路的激活和表达,提示该信号通路参与了奶牛产后子宫复旧延迟进程,为进一步研究奶牛子宫内膜的发病机制提供思路。     

NF-κB信号通路对布鲁氏菌介导的细胞凋亡的影响

<正>布鲁氏菌是一种革兰氏阴性、兼性胞内寄生致病菌,它的侵染力和传染性很强,传播途径和传播范围广泛,严重危害畜牧兽医业的发展,易感动物为反刍动物和人。布鲁氏菌病现已波及全球近90%的国家和地区,每年造成数以亿计的经济损失~([1])。布鲁氏菌有自己特有的生物学活性,具有独特的生物学功能,与宿主之间存在相互联系,有复杂的信号调控网络。LPS是布鲁氏菌重要的毒力因子,主要由3个成分组成,即核心低聚糖、脂质A和O-链多糖。根据     

茶多酚通过NF-κB通路缓解LPS诱导的奶牛乳腺上皮细胞炎性反应

为了探讨茶多酚对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的奶牛乳腺上皮细胞炎性反应的影响,本试验使用LPS(1 mg/L)和或茶多酚(50,100,200 mg/L)处理奶牛乳腺上皮细胞(MAC-T),随后采用ELISA试剂盒、Western blot方法和实时荧光定量PCR方法检测NF-κB信号通路...     

腐蹄病奶牛NF-κB和p38MAPK信号通路的表达变化研究

为了明确腐蹄病奶牛核因子κB(NF-κB)和p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)信号通路的表达及变化情况,探讨奶牛腐蹄病炎性信号通路的作用,试验采用酶联免疫吸附试验检测腐蹄病奶牛(试验组)和健康奶牛(对照组)血清中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素4(IL-4)、p38MAPK和NF-κB的表达情况。结果表明:与对照组比,试验组奶牛血清中NF-κB和IL-1β含量显著升高(P0.05); IL-4含量极显著升高(P0.01);TNF-α含量显著降低(P0.05);p38MAPK含量升高,但差异不显著(P0.05)。说明NF-κB信号通路在奶牛腐蹄病促炎因子表达调控中可能起着重要作用, p38MAPK信号通路并不是腐蹄病发生期间诱导炎症反应的主要信号通路。     

重组RTB蛋白对巨噬细胞活化及对NF-κB信号通路的影响

采用重组RTB蛋白刺激RAW264.7细胞,对iNOS、IL-6和TNF-αmRNA表达及IκB-α和NF-κBp65磷酸化蛋白表达进行分析,探讨重组RTB蛋白对巨噬细胞活化及对NF-κB信号通路的影响。结果显示,重组RTB蛋白组RAW264.7细胞iNOS、IL-6和TNF-αmRNA的表达显著高于对照组(P<0.01),并呈现时间和计量依赖性;加入NF-κB抑制剂BAY后,iNOS、IL-6和TNF-αmRNA表达降低(P<0.05或P<0.01)。随RTB刺激RAW264.7时间的延长,IκB-α蛋白的磷酸化程度增强,NF-κBp65磷酸化蛋白表达逐渐增高,表明重组RTB蛋白具有促进巨噬细胞活化及活化NF-κB信号通路的功能。     

奶牛亚急性瘤胃酸中毒对肝脏内组胺代谢及NF-κB炎性信号通路的影响

为研究奶牛亚急性瘤胃酸中毒(SARA)时血液内组胺浓度的变化及对奶牛炎性信号通路的影响,通过对健康奶牛饲喂高精料日粮,诱发亚急性瘤胃酸中毒,手术安装血管瘘管,采集门静脉和肝静脉血液样品,组胺ELISA试剂盒检测血液中组胺含量,并通过RT-PCR对在体肝脏中的NF-κB、环氧合酶-2(COX-2)、IL-6、TNF-α表达水平进行相对定量和绝对定量检测。结果表明,高精料组奶牛门静脉内组胺浓度较对照组均有所增加,高精料组组胺平均浓度(19.99±0.21)μg/L,较低精料组(18.12±0.35)μg/L差异显著(P<0.05);高精料奶牛的组胺平均清除率(57.23%)显著高于低精料组(50.28%),说明高精料组奶牛组胺在肝脏内代谢率高于低精料组;高精料组NF-κB、COX-2、IL-6和TNF-α的表达较低精料组均有升高,且NF-κB、COX-2、IL-6和TNF-α四个基因的表达有显著升高(P<0.05)。本试验证明了奶牛SARA中血液内组胺浓度的升高可诱导肝脏对其转化和降解的效率增加,且组胺含量的增高可诱导奶牛肝脏中NF-ΚB信号通路的打开,进而导致COX-2等炎性基因表达。     

痘病毒编码的蛋白对NF-κB信号通路调控作用研究进展

NF-κB是一种对免疫系统调节起关键性作用的核转录因子,且NF-κB信号通路是痘病毒家族抑制和逃避宿主免疫应答的主要靶点。目前已证实,痘病毒具有独特的调节宿主免疫应答过程的能力,特别是痘病毒科编码的蛋白通过影响与宿主天然免疫密切相关的NF-κB信号通路,有利于病毒在宿主细胞内的复制,导致病毒不断地逃逸免疫保护而出现病毒的反复感染。因此探索痘病毒科编码的蛋白调节NF-κB信号通路的机制已成为目前研究的热点。文章主要综述了近些年痘病毒编码的蛋白通过不同的途径调节NF-κB信号通路的调控作用,为进一步对宿主细胞早期抗病毒的免疫应答方面的研究奠定基础。     

NF-κB信号通路在金黄色葡萄球菌诱导奶牛乳腺成纤维细胞转分化中的作用

用热灭活金黄色葡萄球菌(0,104,105,106,107和108 CFU/mL)刺激奶牛乳腺成纤维细胞,24h后采用Real time-PCR方法检测TNF-α、IL-1β、IL-6和TGF-β1mRNA的表达量,Western blot方法检测α-SMA、collagen-I及pNF-κB p65蛋白的表达量。使用NF-κB通路抑制剂PDTC预处理细胞,再用105 CFU/mL热灭活金黄色葡萄球菌刺激细胞,24h后采用Real time-PCR方法检测TNF-α、IL-1β、IL-6和TGF-β1 mRNA的表达量,Western blot方法检测α-SMA、collagen-I及p-NF-κB p65蛋白的表达量,免疫荧光法检测α-SMA及collagen-I蛋白的表达量。结果显示,不同浓度热灭活金黄色葡萄球菌处理细胞的TGF-β1mRNA的表达量显著升高(P<0.05),其中以105 CFU/mL刺激组的TGF-β1mRNA的表达量最高。随着热灭活金黄色葡萄球菌浓度的升高,p-NF-κB p65蛋白的表达量逐渐升高(P<0.01),TNF-α、IL-1β、IL-6mRNA的表达量也逐渐升高(P<0.01)。不同浓度灭活的金黄色葡萄球菌处理细胞的α-SMA及collagen-I蛋白的表达量均能显著升高(P<0.05),其中以105 CFU/mL刺激组的α-SMA及collagen-I蛋白的表达量最高。抑制剂PDTC能够显著抑制TNF-α、IL-1β、IL-6和TGF-β1 mRNA的表达量(P<0.05),PDTC能够显著抑制α-SMA、collagen-I及p-NF-κB p65蛋白的表达量(P<0.05)。结果提示,NF-κB信号通路在金黄色葡萄球菌诱导奶牛乳腺成纤维细胞转分化为肌成纤维细胞过程中发挥重要作用,本研究为揭示金黄色葡萄球菌性乳腺炎发生硬化的机制奠定基础。     

猪瘟病毒对ST细胞NF-κB信号通路炎性因子表达量的影响

探讨猪瘟病毒(CSFV)感染猪睾丸上皮细胞系(ST)对核因子-κB(NF-κB)信号通路相关炎性因子的表达。分别收集CSFV感染4、8、12、16、24、48 h的ST细胞,建立正常对照组和CSFV感染各试验组。荧光定量PCR(qPCR)法检测NF-кB通路相关炎性因子CHUK、IKBKB、NFKBIA、RelA基因mRNA表达量的变化,Western blot检测p65蛋白在核中的表达。NFKBIA、IKBKB基因的转录水平差异显著(P0.05);RelA基因的表达差异不显著(P0.05);CHUK基因在ST细胞感染CSFV后,转录水平差异显著(P0.05),Western blot试验显示,p65入核。CSFV感染ST细胞后,NF-κB的经典信号通路和非经典信号通路的均被激活,初步探索了机体感染CSFV对NF-κB通路上、下游的影响,为猪瘟的有效防控提供理论依据。     

脂多糖对奶牛子宫内膜上皮细胞毒性作用研究

本试验通过传代培养奶牛子宫内膜上皮细胞,以0.1μg/mL、1μg/mL、10μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、500μg/mL、1000μg/mL 7个LPS浓度梯度刺激细胞,分别于刺激后12h、24h、36h 3个时间段做MTT细胞毒检测,同时进行细胞形态学观察,研究LPS对子宫内膜上皮细胞的毒性作用。结果发现：0.1μg/mL、1μg/mLLPS组细胞形态学无明显改变;10μg/mL、50μg/mL、100g/mL LPS组细胞形态学与对照组相比有明显改变,500μg/mL、1000μg/mL LPS组细胞发生裂解、死亡。MTT试验结果表明LPS对细胞的抑制作用呈浓度与时间依赖关系,随着LPS浓度的增加和刺激时间的延长,细胞抑制率明显增加,细胞活力明显降低。     

β-羟基丁酸通过激活TLR4/NF-κB通路诱导奶牛乳腺上皮细胞炎性反应

旨在探究Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)/核转录因子kappaB(nuclear factor-kappaB,NF-κB)通路在β-羟基丁酸(β-hydroxybutyrate, BHBA)诱导奶牛乳腺上皮细胞炎性反应的分子作用机制。通过添加不同浓度的BHBA诱导奶牛乳腺上皮细胞MAC-T以模拟奶牛高酮血症中乳腺上皮细胞的炎性反应,并利用RNAi技术将TLR4-siRNA转染细胞42 h后加入3.6 mmol/L BHBA再处理24 h;通过RT-qPCR检测肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha, TNF-α)、白介素-1β(interleukin-1beta, IL-1β)和IL-6等炎性因子的表达变化,并采用Western blot法测定TLR4/NF-κB通路关键蛋白的相对表达水平。结果表明,与对照组相比,不同浓度BHBA处理后,乳腺上皮细胞中TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA水平升高,当BHBA浓度为1.2 mmol/L或以上时,p-NF-κB p65/NF-κB p65比值和TRAF6蛋白水平显...     

脂多糖对体外培养奶牛子宫内膜上皮细胞子宫容受性因子表达的影响

试验旨在通过脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）诱导奶牛子宫内膜上皮细胞构建子宫内膜炎体外感染模型,研究子宫内膜炎对奶牛子宫容受性因子大分子转膜黏蛋白-糖蛋白1（MUC-1）、高度保守的分泌型WNT家族亚型糖蛋白（Wnt-7a）、β受体1（IFNAR1）、IFNAR2、Integrin αvβ3 mRNA及蛋白相对表达量的影响,进而阐明子宫内膜炎引起奶牛屡配不孕和繁殖率低下的机制。采用组织块法分离培养奶牛子宫内膜上皮细胞,免疫荧光方法鉴定细胞纯度,不同浓度LPS刺激子宫内膜上皮细胞,在不同时间点用CCK8测定细胞存活率,ELISA检测炎性因子白细胞介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、IL-6、IL-8的分泌变化,实时荧光定量PCR和Western blotting分别检测子宫内膜感染模型中子宫容受性因子MUC-1、Wnt-7a、IFNAR1、IFNAR2、Integrin αvβ3 mRNA及蛋白的表达变化。结果显示,通过组织块法纯化获得的奶牛子宫上皮细胞数量较多,经免疫荧光角蛋白染色证实纯度较高。采用CCK8测定细胞存活率发现,与对照组相比,浓度为0、5、10、50μg/mL的LPS作用6、12、24、48 h后,细胞活力无显著变化（P>0.05）;浓度为100μg/mL的LPS作用24 h时,细胞存活率显著低于对照组（P<0.05）,细胞培养上清中的IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8含量均显著高于对照组及低浓度组（P<0.05）,引起细胞的炎症反应。与对照组相比,模型组MUC-1 mRNA及蛋白的相对表达量均极显著增加（P<0.01）;Wnt-7a mRNA及蛋白的相对表达量均极显著下降（P<0.01）;Integrin αvβ3、IFNAR1和IFNAR2 mRNA相对表达量均极显著下降（P<0.01）,蛋白相对表达量均显著下降（P<0.05）。结果表明,浓度为100μg/mL的LPS作用24 h可成功构建子宫内膜炎体外感染模型,子宫内膜炎对奶牛子宫容受性因子MUC-1、Wnt-7a、IFNAR1、IFNAR2、Integrin αvβ3 mRNA及蛋白表达的影响可能是引起奶牛屡配不孕和繁殖率低下的重要原因。     

脂多糖对体外培养奶牛子宫内膜上皮细胞子宫容受性因子表达的影响

试验旨在通过脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导奶牛子宫内膜上皮细胞构建子宫内膜炎体外感染模型,研究子宫内膜炎对奶牛子宫容受性因子大分子转膜黏蛋白-糖蛋白1(MUC-1)、高度保守的分泌型WNT家族亚型糖蛋白(Wnt-7a)、β受体1(IFNAR1)、IFNAR2、Integrinαvβ3 mRNA及蛋白相对表达量的影响,进而阐明子宫内膜炎引起奶牛屡配不孕和繁殖率低下的机制。采用组织块法分离培养奶牛子宫内膜上皮细胞,免疫荧光方法鉴定细胞纯度,不同浓度LPS刺激子宫内膜上皮细胞,在不同时间点用CCK8测定细胞存活率,ELISA检测炎性因子白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-6、IL-8的分泌变化,实时荧光定量PCR和Western blotting分别检测子宫内膜感染模型中子宫容受性因子MUC-1、Wnt-7a、IFNAR1、IFNAR2、Integrinαvβ3 mRNA及蛋白的表达变化。结果显示,通过组织块法纯化获得的奶牛子宫上皮细胞数量较多,经免疫荧光角蛋白染色证实纯度较高。采用CCK8测定细胞存活率发现,与对照组相比,浓度为0、5、10、50μg/mL的LPS作用6、12、24、48 h后,细胞活力无显著变化(P0.05);浓度为100μg/mL的LPS作用24 h时,细胞存活率显著低于对照组(P0.05),细胞培养上清中的IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8含量均显著高于对照组及低浓度组(P0.05),引起细胞的炎症反应。与对照组相比,模型组MUC-1 mRNA及蛋白的相对表达量均极显著增加(P0.01);Wnt-7a mRNA及蛋白的相对表达量均极显著下降(P0.01);Integrinαvβ3、IFNAR1和IFNAR2 mRNA相对表达量均极显著下降(P0.01),蛋白相对表达量均显著下降(P0.05)。结果表明,浓度为100μg/mL的LPS作用24 h可成功构建子宫内膜炎体外感染模型,子宫内膜炎对奶牛子宫容受性因子MUC-1、Wnt-7a、IFNAR1、IFNAR2、Integrinαvβ3 mRNA及蛋白表达的影响可能是引起奶牛屡配不孕和繁殖率低下的重要原因。     

孕酮对奶牛子宫内膜上皮细胞凋亡和容受性的影响

为研究孕酮对奶牛早期胚胎附植的影响,本试验使用不同质量浓度孕酮处理奶牛子宫内膜上皮细胞,CCK8检测细胞活力,流式细胞术分析细胞凋亡,实时荧光定量RT-PCR和Western blot检测凋亡相关基因(p53、Cyto-c、Bax、Bcl-2、Caspase-9、Caspase-8和Caspase-3)和容受性相关基因(TLR-4、NF-κB、IL-6、VEGF、LIF和EGF)的mRNA和蛋白表达变化。结果显示：10,25,50,100μg/L孕酮对细胞活力未见影响;10,100μg/L孕酮对细胞凋亡未见影响,对细胞p53、Cyto-c、Bax、Bcl-2、Caspase-9、Caspase-8和Caspase-3的mRNA及蛋白的表达未见影响,但显著下调了TLR-4 mRNA和蛋白表达水平,显著上调了LIF和VEGF mRNA和蛋白表达水平。结果表明孕酮不影响奶牛子宫内膜上皮细胞的凋亡,但能提高子宫容受性,降低免疫反应。     

漏芦乙醇提取物对奶牛乳腺上皮细胞泌乳信号通路的影响

为了探讨漏芦乙醇提取物对奶牛乳腺上皮细胞泌乳信号通路的影响,试验以体外培养的奶牛乳腺上皮细胞为模型,先利用CASY细胞活力分析仪检测漏芦乙醇提取物(质量浓度分别为25,50,100,200,400μg/mL)作用于奶牛乳腺上皮细胞后乳腺上皮细胞的活力和增殖能力,选择添加对细胞生长增殖不受抑制即对细胞无毒性的漏芦乙醇提取物浓度来研究其对奶牛乳腺上皮细胞泌乳信号通路信号分子表达的影响。采用确定浓度的漏芦乙醇提取物处理细胞,然后用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测奶牛乳腺上皮细胞泌乳信号通路关键信号分子信号转导与转录激活因子5(STAT5)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、胆固醇调节元件结合蛋白1(SREBP1)、过氧化物酶增殖体激活受体γ(PPARγ)、丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶1(AKT1)和葡萄糖转运蛋白1(GLUT1)基因的mRNA表达水平,以及采用Western-blot技术检测奶牛乳腺上皮细胞泌乳信号通路关键信号分子的蛋白质表达水平。结果表明:较高剂量(200,400μg/mL)的漏芦乙醇提取物显著抑制了奶牛乳腺上皮细胞活力及增殖能力(P0.05),因此选择25,50,100μg/mL的漏芦乙醇提取物来研究其对乳腺上皮细胞泌乳信号通路信号分子表达的影响;25,50,100μg/mL的漏芦乙醇提取物可显著提高细胞泌乳信号通路信号分子STAT5、mTOR、SREBP1、AKT1、GLUT1基因的mRNA表达水平(P0.05)及p-STAT5、p-mTOR、SREBP1、p-AKT1、GLUT1蛋白质表达水平(P0.05),但对PPARγ基因的mRNA表达及蛋白质的表达无显著影响(P0.05)。说明漏芦乙醇提取物能通过调节泌乳信号通路关键信号分子的表达,进而促进奶牛乳腺上皮细胞乳蛋白、乳脂和乳糖的合成。