梨韧皮部特异表达启动子AtSUC2驱动下的GUS基因的转化和表达

 以 ‘Old Home’ 梨无菌苗叶片为外植体, 利用根癌农杆菌介导将专一在韧皮部表达启动子AtSUC2 驱动下的GUS 基因转入 ‘Old Home’中。筛选出了‘Old Home’ 梨叶片高效遗传转化的最佳条件：农杆菌和外植体在液体培养基上共培比在固体培养基上共培转化率提高5倍。 PCR分析和Southern 杂交鉴定表明GUS 基因已整合到转基因植株的基因组中,组织化学检测和Western 杂交鉴定证明了GUS 基因在转基因植株韧皮部中的表达。     

韧皮部特异启动子驱动密码子优化的抗菌肽D基因的植物表达载体构建

根据177个GenBank中登录的柑橘编码蛋白密码子用法的分析结果,优化并重新设计和合成了含柑橘偏爱密码子、对柑橘黄龙病有杀灭作用的柞蚕抗菌肽D基因(命名为CAPD),克隆入pUC19克隆载体并经测序验证后,获得了含新抗病基因的重组质粒pUC19-CAPD。用限制性内切酶BamHI和SacI双酶切pUC19-CAPD克隆载体和pBI121植物表达载体的质粒DNA,回收pUC19-CAPD克隆载体中的CAPD基因小片段和pBI121植物表达载体中去掉GUS报告基因的大片段,经连接、转化和鉴定后,构建了由CaMV35S组成型启动子(35SP)驱动CAPD目的基因的新植物表达载体(命名为pHZ05);用限制性内切酶BamHI和HindIII双酶切含笋瓜韧皮部特异启动子(PSP)的pUCm-PSP克隆载体和pHZ05植物表达载体的质粒DNA,分别回收pUCm-PSP克隆载体中的PSP小片段和pHZ05植物表达载体中去掉CAPD目的基因上游35SP的大片段,经连接、转化和鉴定后,构建了由PSP驱动CAPD目的基因的新植物表达载体(命名为pHZ06)。利用细胞感受态法直接将2个由不同启动子驱动的含CAPD目的基因的新重组植物表达载体分别导入根癌农杆菌LBA4404、GV3101、EHA105和发根农杆菌Ri15834等4个农杆菌菌株中,为利用农杆菌介导的遗传转化技术培育抵抗由韧皮部传导的毁灭性和检疫性病害柑橘黄龙病的新种质奠定了基础。     

甜瓜CmACOⅠ启动子组织特异性表达研究

 为进一步明确甜瓜果实软化的分子机理,构建了ACC氧化酶Ⅰ基因（CmACOⅠ）启动子与GUS基因融合的植物表达载体,采用根癌农杆菌介导法转化甜瓜‘甘甜一号’。通过卡那霉素抗性和 PCR检测筛选呈阳性的转化植株,取不同组织进行X-Gluc染色。结果表明,转化植株的根、茎、叶、花、果实等器官组织经X-Gluc染色后,只在花药组织和成熟果果皮中出现蓝色斑点,其余组织均未检出,表明甜瓜CmACOⅠ启动子能够驱动GUS基因在转基因甜瓜花药和成熟果果皮中特异表达。     

月季花瓣特异表达启动子的筛选和鉴定

以月季品种‘萨曼莎’(Rosa hybrida‘Samantha’)为试验材料,选取了13个花色、花香相关的基因,研究其在根、茎、叶和花等器官中的表达规律及其启动子活性。结果表明,RhOOMT2(Rosa hybrida orcinol o-methyltransferase 2)和RhCCD4(Rosa hybrida carotenoid cleavage dioxygenase 4)在花瓣中具有相对较高的表达量,RhNUDX1(Rosa hybrida nudix hydrolase 1)在根部表达量最高,花瓣中其次,在茎和叶中几乎没有表达,另外10个类黄酮代谢途径相关基因在各器官中表达差异较小。使用FPNI-PCR的方法克隆到ATG上游1 601 bp的RhOOMT2启动子、1 539 bp的RhCCD4启动子和1 433 bp的RhNUDX1启动子。将携带RhOOMT2、RhCCD4和RhNUDX1启动子的PBI121载体通过农杆菌的介导,在月季‘Samantha’、洋桔梗(Eustoma grandiflorum‘Green Pelleted’)和百合(Lillium Or...     

柑橘CsTBL1启动子的克隆及其在转基因拟南芥中的活性分析

以奥林达夏橙[Citrus sinensis(L.)‘Olinda’]为材料,克隆了CsTBL1基因编码起始位点上游长度为2 361 bp的启动子序列。生物信息学预测表明,该启动子中含有多个与逆境应答相关的顺式作用元件。为进一步分析CsTBL1启动子的功能,构建了该基因启动子与GUS基因融合的植物表达载体,并用浸花法转化拟南芥,对T3代转基因拟南芥进行GUS活性染色。结果显示,CsTBL1启动子在1～3 d龄幼苗所有组织中的活性都非常强,在7～20 d龄幼苗的子叶和根中的活性仍然较强,但在下胚轴中基本检测不到活性。在50 d龄幼苗中,只在叶、茎的毛状体以及还在生长的根中检测到GUS活性。转基因植株的GUS表达受到1–氨基环丙烷–1–羧酸(乙烯合成前体,ACC)、脱落酸(ABA)、甲基茉莉酸(MeJA)和水杨酸(SA)诱导。上述结果表明CsTBL1可能在植物发育和抗外界逆境胁迫中起到非常重要的作用。     

CjFRO2在转基因枳中的整合与表达

三价铁螯合物还原酶（Ferric-chelator reductase,FCR）在植物对三价铁的吸收过程中起着关键作用,导入外源三价铁螯合物还原酶基因是改良植物耐缺铁能力的有效途径。香橙（Citrus junos Sieb.ex Tanaka）是目前表现最好的柑橘耐缺铁砧木之一,在铁胁迫时,香橙三价铁螯合物还原酶基因（...     

柑橘响应黄龙病侵染的韧皮部蛋白2基因CsPP2B15的克隆与表达分析

黄龙病病原菌诱导柑橘筛孔胼胝体过度积累是其致病的一个重要因素。柑橘韧皮部蛋白（Phloem Protein,PP）在筛孔胼胝体积累中起着重要作用。为研究柑橘韧皮部蛋白响应黄龙病亚洲种（Candidatus Liberibacter asiaticus,CLas）侵染的功能,克隆获得了一个响应黄龙病侵染差异表达的PP基因CsPP2B15的编码区和长1.5 kb的启动子序列,并以高感品种锦橙和耐病品种酸柚老叶和嫩叶为材料,进行基因表达分析。结果发现,CsPP2B15在高感品种锦橙嫩叶中受CLas诱导显著上调表达,而在耐病品种酸柚嫩叶中受CLas诱导显著下调表达,且在叶肉中的表达量显著高于叶脉。嫩叶和嫩梢被认为是柑橘响应黄龙病侵染的早期原初侵染部位。因此,CsPP2B15可能在CLas侵染柑橘早期中起重要作用。CsPP2B15启动子的顺式作用元件预测分析发现,CsPP2B15启动子含有许多与逆境和激素有关的顺式作用元件。进一步构建了CsPP2B15启动子控制GUS报告基因的植物表达载体,转化枳[Poncirus trifoliata（L.）Raf.]上胚轴。GUS组织化学染色和GUS酶活性测定均表明,CsPP2B15启动子具有较强的韧皮部组织特异性。     

林业生产中维管束特异表达启动子的研究

本文在综述启动子研究方法的基础上,对维管束特异表达启动子的核心序列、顺式作用元件、反式作用因子的特点及其相关研究中存在的问题进行了综述,并以grp1.8启动子为重点进行相关论述.最后指出维管束特异表达启动子在抗细菌、真菌性维管束病害及其定向改良林木材质的基因工程中具有广阔的应用前景.     

油菜种子特异启动子Napin控制外源EGFP基因在芥菜中的表达

为研究油菜种子特异启动子Napin在芥菜中的表达特性,以增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因为报告基因,将其置于来自油菜的Napin启动子下游,并经根癌农杆菌介导转入芥菜。对转基因芥菜种子及其T1代幼苗的EGFP检测表明：随着转基因植株的种子逐渐发育成熟,EGFP基因在种皮、子叶、胚根中的表达强度逐渐增强|在转基因种子发芽过程中,幼苗根、子叶、下胚轴中EGFP的表达逐渐降低,直至不能检出绿色荧光。结果表明Napin启动子驱动的外源基因表达在芥菜中表现出较为严格的种子表达特异性。     

CsWRKY22启动子的克隆及响应柑橘溃疡病菌侵染的表达特征

由柑橘黄单胞杆菌致病变种(Xanthomonas citri subsp. citri,Xcc)引起的柑橘溃疡病严重危害着柑橘产业的健康可持续发展。前期研究表明,CsWRKY22可能是溃疡病感病基因。从‘晚锦橙’(Citrus sinensis Osbeck)中克隆了CsWRKY22的两个等位启动子pCsWRKY22-1和pCsWRKY22-2,长度分别为1 428和1406bp。序列分析表明两个等位启动子序列一致性为91.76%。两个等位启动子含有多种参与植物防御反应和生长发育的顺式作用元件,相同元件的数量和位置基本一致,不同的是,在TATA-box下游,pCsWRKY22-1含有2个22 bp长的TA-rich转录增强序列,而pCsWRKY22-2只含有1个。构建CsWRKY22启动子控制GUS报告基因的植物表达载体pC sW RKY22::GUS,并用农杆菌介导法转化‘晚锦橙’,经GFP活性检测和PCR鉴定获得pCsWRKY22-1::GUS和pCsWRKY22-2::GUS转基因植株各8株和4株。GUS组织化学染色、GUS酶活性及定量PCR分析表明,CsWRKY22启动子具有较强的机械伤诱导活性和柑橘溃疡病病原菌诱导活性,同时具有一定水平的基础表达特性。pCsWRKY22-1机械伤诱导活性高于pCsWRKY22-2,而pCsWRKY22-2溃疡病菌诱导活性高于pCsWRKY22-1。     

基于EST库的枳APETALA2基因cDNA克隆及其表达分析

 根据物种间同源基因相对保守的特点,利用生物信息学方法以拟南芥APETALA2 cDNA序列作为模板,对柑橘EST数据库进行同源检索筛选,克隆了柑橘APETALA2基因的cDNA序列,并以枳[Poncirus trifoliata (L.) Raf.]花cDNA为模板,根据以上cDNA序列设计特异引物,利用RACE技术分别获得该基因的5'和3'末端,序列拼接后获得枳的APETALA2 cDNA全长。该cDNA全长为1 980 bp,命名为Pt-AP2。Pt-AP2核苷酸序列有一个1 539 bp完整的开放读码框(ORF),5'末端起始密码子ATG其始于290 bp,3'末端非翻译区为152 bp,其中含有27 bp的Ploy⁺(A)。该基因已在GenBank基因数据库注册,注册号为EU883665。推导该cDNA编码512个氨基酸,与苹果、矮牵牛和拟南芥中相应序列同源性分别为59.1%,59.7%和63.8%。序列分析表明, Pt-AP2除了具备完全保守的核定位信号序列（KKSR）外,还具有两个高度保守的重复序列即AP2结构域。分别采用半定量RT-PCR和SYBR Green I实时定量RT-PCR方法分析Pt-AP2在枳叶、茎、根、花和果等不同器官中的表达水平,结果一致表明Pt-AP2在各个器官中的表达水平不同, 花中的表达量最高,果实中的表达量最低。     

Genome-wide identification and analysis of CKX genes in Poncirus trifoliata

Cytokinin oxidase/dehydrogenases (CKXs) in plants are coded by a small multigene family and play important roles in maintaining cytokinin homeostasis. In this study, four CKX genes (i.e. PsCKX1, PsCKX2, PsCKX5, and PsCKX7) were cloned from Poncirus trifoliata. All PsCKXs contained a highly conserved flavin adenine dinucleotide (FAD) binding domain and a cytokinin dehydrogenase 1, FAD/cytokinin binding domain. PsCKX1 and PsCKX2 shared 66.2% and 65.4% identity with AtCKX6 and AtCKX1, respectively, while PsCKX5 and PsCKX7 exhibited less than 45% identity with AtCKXs. The expression analysis under abiotic conditions (NaCl, ABA, 6-BA and drought) revealed that the four PsCKX genes could respond to at least one treatment, and the expression patterns were diverse in root and leaf. Overexpressing four PsCKX genes in tobacco led to diverse phenotypic variations in transgenic plant, including leaf shape, root architecture, and plant height. In addition, the data showed that PsCKX2 and PsCKX5 hold promise to obtain citrus dwarf rootstock with a stronger root system, since the overexpression of them resulted in dwarf plants with more lateral roots. Taken together, the work lays the basis for applications of PsCKX genes in future.     

枳属种质遗传多样性及其与近缘属植物亲缘关系的SSR和cpSSR标记分析

 应用核基因组SSR和叶绿体基因组SSR,分析了枳属28份枳及枳杂种种质的遗传多样性及其与近缘属植物的亲缘关系。核基因组SSR分析表明普通枳的遗传差异明显,22个SSR位点的平均多态性信息含量（PIC）为0.51,平均期望杂合度为0.52,表明中国枳种质资源具有较丰富的遗传多样性。在遗传距离约0.16时,22份普通枳可以分成4个类型。叶绿体基因组SSR分析则发现普通枳间基本无差异,表明以母系遗传为特征的枳叶绿体基因组相对保守。富民枳与普通枳无论是在核基因组还是在叶绿体基因组上均存在较大差异,支持富民枳种的地位。SSR和cpSSR结合使用可比较准确地鉴定枳杂种。     

缺铁和过量重碳酸盐胁迫下丛枝菌根真菌对枳生长的影响

 采用盆栽沙培试验,研究了缺铁及重碳酸盐胁迫下丛枝菌根(arbuscular mycorrhiza, AM)真菌地表球囊霉（Glomus versiforme）对枳[Poncirus trifoliata (L.) Raf.]实生苗生长及植株铁营养的影响。结果表明,在pH 7.0和pH 8.0的重碳酸盐胁迫下,与未接种处理相比,接种AM真菌显著增加了枳实生苗的株高、茎粗、地上部和地下部干样质量,并且明显促进了叶片叶绿素和活性铁的积累,显著提高了叶片Fe/P的比值,降低了叶片50(10P+K)/Fe的比值,减轻了枳因缺铁引起的黄化现象。     

杂草发酵物对枳生长和VA菌根形成的影响

 在具有高密度VAM 真菌生长的枳( Poncirus trif oliata Raf. ) 苗的培养土中分别加入1%的4 种杂草的发酵物, 70 d 后测量结果表明: 枳菌根感染率普遍较高, 但与对照相比,杂草发酵物在显著促进枳苗生长的同时降低了枳菌根感染率, 其中发酵杂草处理对生长的促进作用更大, 降低菌根感染率更低; 高氮也降低菌根感染水平; 过高的菌根感染率导致寄生,抑制宿主的生长。     

枳根cDNA全长文库的构建与分析

为了解柑橘优良砧木枳（Poncirus trifoliata）根部的基因表达信息,利用SMART技术构建了枳的根组织全长cDNA文库。检测结果显示所建枳根原始文库的容量为1.08 × 106 cfu ? mL-1,扩增后文库容量为1.30 × 109 cfu ? mL-1,重组率为95%。通过文库随机测序获得182个长度大于100 bp的ESTs序列（GenBank登录号为JK316116 ~ JK316297）,序列拼接后得到96个Unigenes,包括12个Contigs和84个singletons。其中,68个Unigenes可与GenBank中登录的基因相匹配,56个与已知的柑橘基因相匹配,36个为全长基因。对24个全长基因完成了功能注释,并进一步开展了生物信息学分析,发现有6个应激反应基因和3个根发育相关基因。     

香菇ras和gpd启动子的克隆与功能鉴定

以香菇基因组DNA为模板,利用PCR技术克隆了香菇1个ras启动子Lras,2个gpd启动子Lgpd1和Lgpd2.这3个启动子的大小分别为715bp、1056bp和611bp,与已报道的ras和gpd启动子的同源性很强.对这3个启动子的分析结果表明,它们都含有丰富的启动子顺式作用元件.将这些启动子片段分别与GUS基因连接构建了表达载体,并将这些表达载体导入草菇菌丝体中,检测其活性,最终显示3个片段都有启动GUS基因表达的能力,其中Lgpd1启动子活性最强,Lras启动子次之,Lgpd2最弱.     

应用抑制性消减杂交技术从枳中筛选根特异表达基因

为筛选分离植物根组织特异表达基因,以枳根RNA为试验组,叶RNA为驱动组,构建了枳根消减文库。从该消减文库中共获得有效序列1 177个,其片段长度主要分布在200 ~ 500 bp;序列拼接后得到455个非重复序列,其中245个与已知基因匹配,具有结合功能、催化活性和转运活性等生物学功能,可参与植物的代谢、细胞生长、个体发育、应激反应等生物学过程。实时定量PCR检测结果显示这些基因中的主要乳液蛋白、早期结瘤素样蛋白和贝壳杉烯酸氧化酶等基因在根中高表达。