核桃Q型C2H2锌指蛋白基因家族全基因组鉴定及表达分析

【目的】Q型C2H2锌指蛋白在植物抵抗非生物胁迫中起重要作用。为深入了解核桃Q型C2H2锌指蛋白基因家族在核桃全基因组中的特征,对核桃Q型C2H2锌指蛋白(JrZFP)基因家族进行全基因组鉴定与分析,并研究其在核桃干旱和盐胁迫应答过程中的表达模式。【方法】利用生物信息学方法鉴定了核桃全基因组中的Q型C2H2锌指蛋白基因家族成员,并对其理化性质、染色体定位、进化关系和基因结构进行分析;根据JrZFP基因家族进化树随机挑选15个JrZFP基因,并通过实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,qRT-PCR)方法检测15个基因在干旱和盐胁迫下的响应特性。【结果】在核桃中共鉴定出82个Q型C2H2锌指蛋白基因,其蛋白质序列长度介于59～636个氨基酸之间,亚细胞定位主要位于细胞核中;该基因家族成员不均匀分布在15条染色体上,其中有11对JrZFPs基因为串联重复基因,63个JrZFP基因参与片段重复事件;基因结构分析表明,75个JrZFP基因无内含子,其余成员含有1～10个外显子;上游启动子区分析发现,该基因家族成员含有参与逆境胁迫和激素响应相关的顺式作用元件。...     

柑橘抗逆基因NAC83的克隆与表达分析

以柚[Citrus maxima（Burm.）Merr.]、枳[Poncirus trifoliata（L.）Raf.]和柠檬[C. limon（L.）Burm. f.]实生苗为试材,使用电子克隆和RT-PCR的方法从中克隆到3个新的NAC蛋白基因,分别命名为CmNAC83、PtNAC83和ClNAC83;并用qRT-PCR技术检测了该基因在ABA、干旱、低温和高盐胁迫处理下的时空表达。结果显示：CmNAC83、PtNAC83和ClNAC83 的cDNA序列全长均为841 bp,都含有750 bp的开放阅读框（ORF）,编码249个氨基酸;推测其蛋白分子质量分别为24.18、28.00和28.15 kD,等电点分别是9.02、9.31和9.30,且均含有NAC家族的N端保守结构域;系统进化树分析表明,该3个蛋白均属于SENU5亚族,与苹果NAC22亲缘关系较近。实时定量qRT-PCR分析显示,NAC83基因能被ABA、干旱、低温和高盐胁迫诱导表达,且在不同的柑橘种类中存在表达差异。可见柚CmNAC83、枳PtNAC83和柠檬ClNAC83是NAC基因家族的成员,可能在柑橘响应非生物胁迫的过程中起了重要作用。     

菠萝锌指蛋白基因AcRCHYI的克隆与表达分析

根据植物C3HCA型兼CHY型锌指蛋白的功能保守区设计简并引物,通过RT-PCR结合RACE方法从菠萝(Ananas comosus L.Merr)幼苗中克隆获得了一个新的菠萝锌指蛋白基因cDNA全长,将其命名为AcRCHY1.该基因cDNA全长1 261 bp,开放阅读框ORF为918 bp,推测其编码一个含有306个氨基酸残基的多肽.AcRCHY1蛋白具有保守的C3HC4(RING finger)和CHY两个锌指结构域,与其它植物锌指蛋白的同源性高达81%-91%.半定量RT-PCR分析表明,AcRCHY1在菠萝中呈组成性表达,在子房、花瓣和小花中的表达量明显高于根和叶;低温、高盐、干旱和ABA等非生物胁迫处理后,AcRCHY1在叶片中的表达明显增强.因此,AcRCHY1蛋白可能与花器官生长发育的调控有关,而且可能作为一个转录调控因子在菠萝响应低温、高盐和渗透胁迫过程中参与了依赖ABA的信号转导途径.     

基于EST库的枳APETALA2基因cDNA克隆及其表达分析

 根据物种间同源基因相对保守的特点,利用生物信息学方法以拟南芥APETALA2 cDNA序列作为模板,对柑橘EST数据库进行同源检索筛选,克隆了柑橘APETALA2基因的cDNA序列,并以枳[Poncirus trifoliata (L.) Raf.]花cDNA为模板,根据以上cDNA序列设计特异引物,利用RACE技术分别获得该基因的5'和3'末端,序列拼接后获得枳的APETALA2 cDNA全长。该cDNA全长为1 980 bp,命名为Pt-AP2。Pt-AP2核苷酸序列有一个1 539 bp完整的开放读码框(ORF),5'末端起始密码子ATG其始于290 bp,3'末端非翻译区为152 bp,其中含有27 bp的Ploy⁺(A)。该基因已在GenBank基因数据库注册,注册号为EU883665。推导该cDNA编码512个氨基酸,与苹果、矮牵牛和拟南芥中相应序列同源性分别为59.1%,59.7%和63.8%。序列分析表明, Pt-AP2除了具备完全保守的核定位信号序列（KKSR）外,还具有两个高度保守的重复序列即AP2结构域。分别采用半定量RT-PCR和SYBR Green I实时定量RT-PCR方法分析Pt-AP2在枳叶、茎、根、花和果等不同器官中的表达水平,结果一致表明Pt-AP2在各个器官中的表达水平不同, 花中的表达量最高,果实中的表达量最低。     

菠萝锌指蛋白基因AcRCHY1的克隆与表达分析

 根据植物C3HC4型兼CHY型锌指蛋白的功能保守区设计简并引物, 通过RT2PCR结合RACE 方法从菠萝(Ananas comosus L. Merr) 幼苗中克隆获得了一个新的菠萝锌指蛋白基因cDNA全长, 将其命名为AcRCHY1。该基因cDNA全长1 261 bp, 开放阅读框ORF为918 bp, 推测其编码一个含有306个氨基酸残基的多肽。AcRCHY1蛋白具有保守的C3HC4 (RING finger) 和CHY两个锌指结构域, 与其它植物锌指蛋白的同源性高达81%～91%。半定量RT-PCR分析表明, AcRCHY1 在菠萝中呈组成性表达, 在子房、花瓣和小花中的表达量明显高于根和叶; 低温、高盐、干旱和ABA等非生物胁迫处理后, AcRCHY1在叶片中的表达明显增强。因此, AcRCHY1蛋白可能与花器官生长发育的调控有关, 而且可能作为一个转录调控因子在菠萝响应低温、高盐和渗透胁迫过程中参与了依赖ABA的信号转导途径。     

矮牵牛B-box型锌指蛋白基因PhBBX8的克隆与表达分析

利用矮牵牛（Petunia hybrida）基因表达谱芯片筛选出应答低温胁迫的相关基因,从中发现1个B-box型锌指蛋白基因PhBBX8。通过RT-PCR克隆得到该基因的编码区序列（CDS）,为1 242 bp,预测其编码氨基酸413 aa,N端含有2个B-box盒,C端含有1个CCT结构域。系统进化树分析发现,PhBBX8与拟南芥AtBBX8等聚类为一支。利用半定量RT-PCR检测其在根、茎、叶和花中的表达特性,结果表明该基因在花中表达量较高,其次为根,而在茎和叶中表达较弱;利用实时定量PCR检测了在低温、干旱、ABA、MeJA、高盐和高渗胁迫处理下矮牵牛叶片中PhBBX8的诱导表达情况,结果表明,PhBBX8表现出不同程度的上调,其中除干旱胁迫外,其他胁迫下上调倍数都较高,初步推测该基因与矮牵牛应答低温等非生物逆境相关。     

羽衣甘蓝中一个突变型肉桂酸- 4 - 羟化酶基因的克隆及分析

 以羽衣甘蓝为材料, 克隆了全长2 431 bp的肉桂酸- 4 - 羟化酶基因BoC4H。它有两个内含子, mRNA为1 715 bp, 编码一个481个氨基酸的推导蛋白, 与其它植物C4H有广泛同源性。它含有细胞色素P450保守域和特征基序, 如血红素结合域、E - R - R三联体、含T的结合槽基序、酶正确定向必需的铰链基序。BoC4H具有C4H /CYP73A5的大部分特征性底物结合位点基序( SRSs) 和酶活性位点残基,但与拟南芥等植物C4H相比其编码区3′发生了C₂₂₄₂单碱基缺失和相应移码, 导致其蛋白C - 末端缺失/变异了36个残基, SRS6基序和其上的活性位点残基也相应缺失, 因此BoC4H可能无功能或活性低。BoC4H为膜蛋白, 可能定位于内质网, 其二级结构主要为α - 螺旋和随机卷曲。Swiss-Model不能预测出其三级结构。甘蓝中存在一个至少由5个成员构成的C4H基因家族。     

枳橙CPMAX2基因的克隆、载体构建及其表达研究

转rolABC基因枳橙莲座状分枝、矮化性状突出。为探索其侧枝生长的植物激素调控机制,通过RT-PCR法从枳橙中克隆到独脚金内酯信号转导关键元件CPMAX2基因,分析了该基因在转rolABC基因枳橙腋生嫩叶中的转录表达,构建了CPMAX2植物过表达载体。研究表明：CPMAX2与甜橙中同源基因一致性为99.66%,编码694个氨基酸,具有一个典型的F-box蛋白结构域和两个LRR重复区,与甜橙MAX2氨基酸序列一致性为99.14%。CPMAX2在转rolABC基因枳橙3个株系腋生嫩叶中的转录表达均比野生型显著下调。试验表明CPMAX2在转rolABC基因枳橙莲座型分枝生长中扮演重要角色。     

香蕉抗逆相关基因MaERF的克隆与表达分析

 根据已获得的AP2/ERF基因片段,通过RACE方法获得一个香蕉ERF基因完整编码区序列,命名为MaERF。该基因cDNA全长1 611 bp,其中开放阅读框1 128 bp,编码376个氨基酸,包含一个保守的AP2/ERF结构域,基因组序列全长2 881 bp,含有一个内含子,剪切位点符合“GT-AG”规则;系统进化树表明该基因属于植物ERF转录因子家族的B2亚群。半定量RT-PCR分析表明,该基因在香蕉各个器官中均有表达,其中在根和叶中的表达量较低,而在果实和花中的表达较高;实时荧光定量Real-time PCR检测表明,受尖孢镰刀菌侵染及低温胁迫后,香蕉中该基因表达明显上调,推测其在香蕉胁迫反应中可能发挥重要作用。     

CjFRO2在转基因枳中的整合与表达

三价铁螯合物还原酶（Ferric-chelator reductase,FCR）在植物对三价铁的吸收过程中起着关键作用,导入外源三价铁螯合物还原酶基因是改良植物耐缺铁能力的有效途径。香橙（Citrus junos Sieb.ex Tanaka）是目前表现最好的柑橘耐缺铁砧木之一,在铁胁迫时,香橙三价铁螯合物还原酶基因（...     

芹菜衔接蛋白基因AgMu2的克隆与表达分析

为研究芹菜（Apium graveolens）衔接蛋白（Adaptor protein）复合体AP-2 中的μ2 亚基的功能,以‘六合黄心芹’和‘美国西芹’为试验材料,采用RT-PCR 方法获得AgMu2 基因。序列分析表明：AP-2 复合体AgMu2 基因全长1 317 个核苷酸,编码438 个氨基酸。推测其蛋白质分子量为49.30 kD,pI为9.28。进化分析表明,来自‘美国西芹’的AgMu2 亚基在植物间进化具有高度保守性,与葡萄Mu2进化关系最为接近。空间结构分析表明,从芹菜中分离的AgMu2 亚基由5 个螺旋和26 个延伸主链构成,两个平行的β 延伸主链构成的平面区域可能含有识别YXXΦ 结构的位点。实时定量荧光PCR 显示,芹菜中AgMu2 基因主要在叶中表达,具有明显的组织特异性,同时该基因可响应低温、高温、干旱和盐胁迫等多种逆境信号,2 个品种间该基因响应的时间和强度也具有显著的差异,显示了该基因功能的多样性。     

花椰菜BoPGIP2基因的克隆与表达水平分析

以3个品系花椰菜为试材,采用同源克隆的方法,克隆了花椰菜BoPGIP2基因,并对表达水平进行分析。结果表明:该基因与油菜的PGIP2基因序列有较高的相似性;ExPASy分析发现BoPGIP2理论分子量为37.02kDa,等电点为8.51,分子式为C_(1672)H_(2604)N_(436O487)S_(13),不稳定系数为34.95,为稳定蛋白,脂肪族指数为92.48,GRAVY值为-0.096,表明其在一级结构上的亲水性、疏水性差异不显著。亚细胞定位预测分析表明,此蛋白属于分泌途径信号肽蛋白;qRTPCR分析发现BoPGIP2基因在花椰菜高抗菌核病品系、中抗菌核病品系中均是茎和叶中相对表达量较高,而在易感菌核病品系中则是根中相对表达量最高,叶和茎中相对表达量较低,这与抗菌核病强弱具有一致性,推测此基因很可能在调节花椰菜的抗菌核病中起着重要作用。     

大白菜渗透压应激活化蛋白激酶基因SRK2F的克隆与表达

以不耐盐、不耐旱的大白菜自交系SY-14-06为试材,提取根部总RNA,反转录为c DNA。根据大白菜SRK2F基因设计引物,PCR扩增SRK2F基因CDS序列1044bp。SRK2F编码347个氨基酸,预测分子量为39.3k D,理论等电点为4.88。利用p EASY-E1原核表达载体构建原核表达质粒p EASY-E1-SRK2F,转化表达菌株Transetta(DE3),通过SDS-PAGE检测该蛋白的表达。经Smart-embl预测其具有丝/苏氨酸激酶特有结构域,位于第4~260位氨基酸处。经Clustal X2比对,其与拟南芥同源性最高。最后利用镍离子金属螯合亲和层析介质对该蛋白进行纯化,得到了纯化的融合蛋白。     

苹果AFS基因的克隆与原核表达

 通过RT-PCR扩增到苹果α - 法尼烯合成酶(α-Farnesene Synthase, AFS) 基因的编码区全长,将其克隆到pET-30a ( + ) 上, 构建了该基因的原核表达载体pET-AFS, 转化大肠杆菌BL21。SDS2PAGE检测结果表明, 此基因表达了1个约66 kD的蛋白, 1 mmol/L异丙基-β - D - 硫代半乳糖苷( IPTG) 诱导该基因高效表达, 6 h表达量最高, 诱导产物以包涵体形式存在。     

牡丹隐花色素基因PsCRY2的克隆与表达分析

以‘秋发1号'和‘洛阳红'牡丹(Paeonia suffruticosa)为试验材料,采用RT-PCR的方法从花芽中克隆得到1个隐花色素基因Cryptochrome 2,其ORF全长为1902 bp,编码633个氨基酸,基因登录号为KP982893。序列比对和结构域分析表明,此蛋白包含1个PHR和1个CCT结构域,与拟南芥中AtCRY2最为相似,将其命名为PsCRY2。系统进化树分析表明,PsCRY2与甜橙(Citrus sinensis)CsCRY2亲缘关系最近。实时荧光定量PCR表明,PsCRY2在牡丹的不同组织器官中均有表达。其中,成年植株的花芽以及种子胚的表达量最高,幼苗根、茎、叶次之。在整个花芽分化不同时期,PsCRY2的表达呈现较高的表达水平;在花蕾发育不同时期,PsCRY2的表达呈现先降低再升高而后有降低的趋势,大风铃期表达量最高,推测PsCRY2在花芽分化和花蕾发育的过程中均起到重要作用。在‘洛阳红'和‘秋发1号'牡丹春季花芽发育过程中,PsCRY2的表达均呈升高的趋势,‘秋发1号'显著高于‘洛阳红'。不同光周期条件下,PsCRY2表达稍有不同。与长日照条件相比,短日照条件下PsCRY2在现蕾期和小风铃期的表达量均下降。     

番茄脱水素基因SlDHN2b 的克隆与表达分析

 利用RT-PCR从番茄叶片中获得脱水素基因（dehydrins）的cDNA序列,命名为SlDHN2b。该基因开放阅读框1 140 bp,编码380个氨基酸。蛋白序列分析表明该蛋白高度亲水。Real-time PCR分析表明该基因受盐、脱水、ABA诱导表达。通过染色体步移技术获得SlDHN2b基因的启动子,PLACE数据库分析预测SlDHN2b启动子序列中含有多种逆境相关的作用元件。Northern杂交表明该基因在叶片中表达量最高,果实、花、茎中次之,根中最少。     

槟子脂氧合酶基因LOX2a的克隆与表达分析

【目的】脂氧合酶LOX是植物香气代谢脂氧合酶途径的起始酶,探究槟子（Malus pumila×M. asiatica）LOX2a基因在果实香气合成中的作用,为LOX2a基因在槟子果实中的功能研究奠定基础。【方法】以槟子转录组和挥发性物质检测数据为基础,筛选并克隆槟子LOX2a基因,利用生物信息学对其功能域、理化性质等进行预测,通过亚细胞定位分析LOX2a在细胞水平的表达位置,利用RT-qPCR检测LOX2a的时空表达水平,结合圆片温育和外源激素处理探究激素对LOX2a基因表达的调控作用。【结果】槟子LOX2a开放阅读框为2721 bp,编码906个氨基酸,含有一个保守的Lipoxygenase功能域,编码蛋白定位于细胞质;系统发育进化分析表明槟子LOX2a与苹果LOX2a同源性最高;槟子LOX2a在根部表达水平最高,种子中最低;在果实发育过程中花后30 d时表达水平最高,随后降低并维持在一定水平,到成熟（花后150 d）时表达水平上升;槟子LOX2a启动子上含有响应脱落酸、茉莉酸甲酯、赤霉素和水杨酸的顺式作用元件,且其表达受到这4种激素及乙烯的诱导。【结论】槟子LOX2a基因可能通过多...     

黄瓜CsaDMR6-2基因的克隆及特征分析

通过系统进化树和黄瓜霜霉病主效QTL分析,确定了与拟南芥抗霜霉病突变基因DMR6同源性较高的Csa DMR6-2基因为黄瓜霜霉病感病候选基因。以15份不同遗传背景的抗病和感病黄瓜自交系为材料克隆了Cs DMR6-2基因,经过与已知功能的拟南芥基因DMR6、DLO1和DLO2的氨基酸进行多序列比对、蛋白质二级和三级结构的预测,结果显示:欧洲温室型的抗病材料K15和K58的Csa DMR6-2的CDS序列在856bp处有1个碱基的突变,引起相应氨基酸由丝氨酸(TCA)变成丙氨酸(GCA),进而引起其部分蛋白质二级和三级结构的变化;Csa DMR6-2与拟南芥的DMR6、DLO1和DLO2基因具有很高的同源性,且同属于一类氧化酶,两者具有相同的结构域,而抗病材料的变异位点均发生在催化区。试验结果为进一步研究Csa DMR6-2的基因功能和利用感病基因获得霜霉病持久广谱抗性打下了良好的基础。     

番茄CCCH型锌指蛋白基因SlC3H64和SlC3H65的特征与表达分析

以番茄品种"中蔬6号"为试材,采用生物信息学方法和实时荧光定量PCR技术,分析研究了番茄SlC3H64和SlC3H65锌指蛋白结构特点,启动子序列内所含胁迫响应元件类别,以及2个基因组织表达模式和非生物胁迫条件下表达量变化差异。结果表明:番茄SlC3H64和SlC3H65的蛋白预测结构差异较大;启动子序列分析发现,2个基因中分别含有11个和7个不同的胁迫响应元件,且二者除了TC-rich repeat元件相同外,其余元件均不同;SlC3H64和SlC3H65在"中蔬6号"根、茎和叶中都有表达,且都在叶中表达量最高,5种不同胁迫处理条件下,SlC3H64响应水杨酸(SA)和高温处理,而SlC3H65则仅响应甘露醇处理。