水稻白叶枯病菌的血清学研究

 用戊二醛固定的5个水稻白叶枯菌株制备了5个抗血清,利用琼脂双扩散、试管凝集、免疫电泳和酶联免疫吸附试验研究了107个水稻白叶枯菌株血清学反应的差异,将它们分为三个血清型。属于Ⅰ型的菌株(OS-225、F₄等)占供试菌株的95%,分布于全国各稻区;归属于Ⅱ型的菌株(OS 209、OS-109等)占5.6%,主要来自南方边远地区;Ⅱ型仅1个菌株(G₈),占0.9%,来自广西东部;其中还有两个菌株和上述抗血清均不能反应,暂不能归型,来自福建。血清型和致病型之间的相关性不用戊二醛固定、热处理等5种不同方法处理菌体后制备的抗血清之间,表现出一致的反应特异性和相似的"型"专化性。免疫电泳结果表明,不同血清型的免疫源组成是不同的,Ⅰ型仅具中性免疫源,Ⅱ型具中性及偏碱性免疫源,而Ⅱ型则具中性及偏酸性两种免疫源。
比较了反向间接血凝、酶联免疫吸附和免疫荧光反应等方法检测病菌的灵敏度,以免疫荧光试验(IF)为最灵敏,可检测到每毫升10³细胞,ELISA其次(10^4-5cell/ml),反向间接血凝法为10^6-7cells/ml,双扩散法最差,只有在高达10⁸ cells/ml时才有阳性反应。     

水稻白叶枯病菌抗药性现象的室内研究

水稻白叶枯病是水稻的主要病害,目前我国防治该病的药剂主要是噻枯唑(川化—018),在含药含菌培养基上,筛选出了叶枯净(5—氧酚嗪)抗性菌,其突变率为2×10~(-6),抗性指数为333。未发现噻枯唑和渝—7802抗性菌。而在活体上直接喷药筛选时既发现了叶枯净抗性菌(抗性指数大于108),又发现了噻枯唑抗性菌(抗性指数大于196),仍然未发现渝—7802抗性菌,进一步的试验证明,噻枯唑活体抗性菌,离体测定时无抗药性,说明噻枯唑活体抗性和离体抗性不一致,而叶枯净的活体抗性和离体抗性一致。交互抗性测定证明,噻枯唑、叶枯净、渝—7802三者之间无交互抗性现象,而噻枯唑与敌枯双之间存在着强烈的正交互抗性。     

含hrp基因的克隆片段在水稻白叶枯病菌不同小种中的功能和同源性

 将从水稻白叶枯病菌(Xanthomonas campestris pv.oryzae Dye,简称Xco)小种3菌株JXOⅢ中克隆的hrp基因片段(pNAX3103),用三亲交配法向病菌其它小种及其毒性基因突变体转移,结果表明pNAX3103可以进入其它小种,但对不同小种毒性基因突变体的转移能力则不同。功能互补分析表明;该hrp基因片段在不同小种中对病菌的生长,以及蛋白酶、果胶酶和纤维素酶的产生和分泌无明显影响;在野生型菌株中能增加亲本菌株对水稻品种IR26的致病力(JXO I)或亲和性(JXO V),对于毒性基因突变体,pNAX3103虽能进入JXO I经Tn5诱变的毒性基因突变体XcoM1107,但不能恢复其致病性和淀粉酶阴性反应。用hrp基因片段作为探针,对10个来源不同的小种或菌系群进行DNA同源性分析,结果与所有Xco菌株都有明显的同源性杂交带,但杂交带型不同,与甘蓝黑腐病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌、大白菜。软腐病菌的DNA有同源杂交带,但与水稻基腐病菌DNA无同源性。     

中国水稻白叶枯病菌致病型的研究

 在1975-1980年初步测定的基础上,近4年来,先后从国内各病区又采集了835个菌株,分别在北京、南京、扬州和广州等地,在30个鉴别品种上接种测试其致病性差异,根据在5个最基本的鉴别品种上的反应特征,可将供试的菌株区分为7个致病型。它们在IR26,Java14,南粳15,Tetep和金刚30上成株期的反应模式分别为(Ⅰ):RRRRS;(Ⅱ):RRRSS;(Ⅲ):RRSSS;(Ⅳ):RSSSS;(Ⅴ):SRRSS;(Ⅵ):RRSRS;(Ⅶ):RSSRS。在北方粳稻区的菌株,多属Ⅱ型和Ⅰ型,在南方籼稻区的菌株以Ⅳ型为最多,还有少量Ⅴ型菌存在,在长江流域籼粳混栽稻区的菌株,则以Ⅱ、Ⅳ型为多。     

水稻白叶枯病菌抗菌物质产生的研究

对水稻白叶枯病菌抗菌物质的产生进行了研究。通过氯仿熏蒸、热处理、紫外线照射等灭活处理，在６２个菌株中发现了３２个菌株可产生抗菌物质，其中１２个菌株３种灭活处理均形成了抑菌圈，抑菌范围较广的ＹＺ－１３对水稻白叶枯病菌的６２个菌株中的４８个具有作用；ＹＺ－３２菌株３种灭活处理均产生了对自身菌株具有活性的抗菌物质。     

水稻白叶枯病菌hrpG调控基因的鉴定

水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)引起的白叶枯病(bacterial leaf blight,BLB)是水稻上最严重的细菌病害之一。Xoo与寄主水稻的互作依赖由hrp基因编码的Ⅲ型分泌系统(Type Ⅲ secretion system,T3SS),将效应蛋白(T3SS effectors,T3SEs)注射入水稻细胞,引起BLB症状的扩展。HrpG是hrp基因转录表达的主要调控因子。为了鉴定未知的hrpG调控子,本研究在以hrpG∷gusA为报道基因构建的转座子突变体库中,筛选获得4个候选的hrpG负调控子突变体G24-46、G48-22、G19-14和G57-41。GUS活性测定、荧光定量PCR以及烟草组织的GUS染色试验均显示,在这些突变体中hrpG的表达显著增加。Southern杂交结果显示,突变体中转座子均为单一位点的插入。插入位点分析结果显示,在G24-46、G48-22、G57-41和G19-14中转座子分别插入在minD、pilA、metB和wxoB基因中。毒性测定结果显示,这4个突变体在水稻上的毒性显著降低。这些hrpG调控子基因的鉴定为进一步解析稻黄单胞菌hrpG上游调控网络提供了新的科学线索。     

国外水稻品种（系）对我国白叶枯病菌致病型的反应及其利用

1991－1993年，用我国田间流行的7个水稻白叶枯病菌致病型，对由国际水稻所提供的285份水稻品种（系）进行了田间成株期鉴定。筛选出一批具有稳定抗性和综合性状亦优的材料，可供育种和生产部门参考。     

水稻白叶枯病菌毒性基因调控hrp基因表达的分析

水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)侵染寄主水稻,引起水稻白叶枯病(bacterial leaf blight,BLB)。病原菌主要依赖hrp基因簇编码的Ⅲ型分泌系统(Type Ⅲ secretion system,T3SS)将效应蛋白(T3SS effectors,T3SEs)注入水稻细胞中,激发水稻的抗(感)病性。同源性搜索结果显示,植物病原黄单胞菌中已鉴定的一些毒性基因在Xoo的代表菌株PXO99A中保守存在。为了明确这些毒性基因对hrp基因表达调控的影响,本研究利用pK18mob-W介导的定点突变方法,成功获得了14个毒性基因的突变体;在突变体中,利用hrp∶∶gusA融合表达体系,通过GUS活性定量测定检测了hrpG、hrpX和hrpB1的启动子活性;通过荧光定量PCR技术,检测了这3个基因的mRNA水平。结果显示,双组分调控系统ColR/ColS、RpfC/RpfG和转录调控子Clp负调控hrpG和hrpB1的表达;Trh和Xrv A通过HrpG-HrpX途径正调控hrpB1的表达;HpaR1和Fur不依赖于HrpG仅通过HrpX正调控hrpB1的表达。这些调控关系的鉴定为解析水稻黄单胞菌hrp调控网络提供了新的线索。     

水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌的分子标记筛选及检测

 水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae）和细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzicola)是水稻种子产地检疫中最重要的两种检疫对象,且同属于水稻黄单胞杆菌。本研究基于生物信息学技术构建比较基因组学算法对两种病原的全基因组序列比对分析,得到一系列能够区分两种病原的特异性PCR引物。结合简单的PCR技术及全自动DNA分析系统,我们选取了12对引物分别对23株水稻白叶枯病菌和5株水稻细菌性条斑病菌及其它相关菌株进行验证。结果获得了2对显性标记(Xoo-Hpa1和Xoc-ORF2)以及3对共显性分子标记(M568、M897和M1575)可以达到理想的区分检测两种病原的效果。分子标记的检测灵敏度从5×10⁴到5 × 10⁷cfu·mL^-1不等,且从水稻种子浸提液中也能成功地检测水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌。本研究丰富了检测标记的靶位点,并有效的结合了高通量检测的手段对多位点联合分析,增强了检测的可靠性,有望在今后的植物检疫及病原鉴定中发挥着重要的作用。     

水稻与白叶枯病菌互作的功能基因组学研究

水稻白叶枯病是水稻生产上重要的细菌病害之一。随着水稻和白叶枯病菌(Xanthomonas oryzaepv.oryzae,Xoo)全基因组序列的完成,该病害己成为植物-病原物互作研究的模式。水稻-Xoo互作涉及到寄主与病原菌因子的时空表达和严密调控。因此,阐明互作基因的表达调控机理,对于全面解析水稻-Xoo互作机制具有重要的科学意义。本文介绍了近年相关工作的研究进展。1Xoo基因鉴别和功能分析1.1Xoo侵染的基因表达谱和分子量化根据Xoo基因组序列信息,自主研制了载有调控基因、致病基因、特有基因以及保守基因特异片段的基因芯片,成功地用于在离体培养、…     

水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)化学诱变hrp基因突变体及相关性状的研究

 硫酸二乙酯(diethyl sulfate,DES)化学诱变水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)日本系统III号小种(JXOIII),获得16株hrp-突变体,其在感病寄主水稻IR26、汕优63上失去致病性和在非寄主烟草上失去过敏反应。所得的hrp-突变体并无黄色素缺失现象。16株hrp-突变体的淀粉酶、果胶酶、蛋白酶、纤维素酶和脂酶等胞外酶活性基本与野生型一致。JCM2092、JCM2211、JCM2252和JCM2457这4株hrp-突变体为III型泌出通道突变体,JCM0066等另12株hrp-突变体的超声波破碎液、离心上清液中无激发HR的信号物质存在。细胞组分分析表明,激发烟草HR的信号物质不是LPS而是蛋白类物质。来自JXOIII基因文库hrp基因克隆pUHRX245中的1.1kb SacI-KpnI片段,能够互补hrp-突变体JCM0066和JCM2482,使其恢复在烟草上激发HR的能力,但不能恢复其致病性。     

水稻条斑病细菌类Harpin蛋白的纯化与特性研究

 用硫酸铵沉淀、制备等电聚焦电泳、阴离子交换层析等方法从水稻条斑病细菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzicola,Xooc) RS105菌株突变体M51菌体破碎液中纯化出可激发烟草产生过敏性反应(hypersensitive response,HR)的蛋白类物质,分子量约为25.5 kDa。该物质与梨火疫病菌(Erwinia amylovora))的HarpinEa和水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae,Xoo)的Harpin_Xoo具有相似的生物活性和理化特性:可激发烟草产生典型的HR反应;对热稳定,对蛋白酶K敏感;RNA转录抑制剂放线菌素D、蛋白质合成抑制剂环己酰亚铵和钙离子通道阻断剂氯化镧能够抑制该物质激发烟草产生HR;该物质具有诱导烟草抗TMV的功能。据此,将该物质命名为类Harpin蛋白(Harpin-like protein,HLP_Xooc)。     

利用多重PCR诊断水稻白叶枯病和细菌性条斑病的复合发生

为准确检测水稻白叶枯病菌、细菌性条斑病菌及这两种病菌的复合发生,利用软件DNAStar分析比较这两种菌的部分核酸序列,设计了检测这两种病菌的特异性引物。引物Xoo F-Xoo R能特异性扩增出水稻白叶枯病菌中一条大小162 bp的条带;引物Xooc F1-Xooc R1和Xooc F2-Xooc R2能够分别特异性扩增出水稻细菌性条斑病菌中690 bp和945 bp的条带。通过优化PCR反应条件,成功建立了多重PCR技术,可以对不同国家的水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌进行准确检测,对由这两种病菌引起的复合侵染实现了准确诊断。     

水稻IR26悬浮细胞与白叶枯病菌互作的过敏反应现象

 当水稻IR26悬浮细胞与白叶枯病菌的不亲和小种(JXOV)互作时,在数小时内,悬浮细胞死亡率可达60%、膜透性增加40%、呼吸升高一倍多,而水稻IR26悬浮细胞与白叶枯病菌的亲和小种(JXOⅢ)互作时,在数小时内,悬浮细胞死亡率只有20%、膜透性只增加20%、呼吸升高不足40%,这些数据表明在水稻悬浮细胞与白叶枯病菌互作系统中可能存在着和水稻植株与白叶枯病菌互作系统中相似的互作机制。     

木质部次生细胞壁增厚参与疣粒野生稻对黄单胞杆菌水稻变种的抗性

 黄单胞杆菌水稻变种（Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo）引起的水稻白叶枯病是一个世界性的严重病害。疣粒野生稻（Oryzae meyeriana）对Xoo具有高度抗性,但其抗性机制仍不清楚。本文以抗病的疣粒野生稻和感病的水稻品种大粒香为材料,研究了Xoo侵染对叶片病斑、叶绿体超微结构、光合系统活性和木质部超微结构的影响。结果表明,多种Xoo生理小种导致的疣粒野生稻叶片病斑长度都明显短于大粒香叶片的病斑长度。Xoo病菌侵染显著破坏了大粒香的叶绿体结构,明显抑制了其光合活性,而疣粒野生稻中的变化要轻得多。通过电镜切片,发现疣粒野生稻叶片导管内存在大量的Xoo病菌,这表明Xoo能够侵染疣粒野生稻且能够在叶片内增殖。病菌的侵染诱导了疣粒野生稻木质部次生细胞壁的增厚,抑制了病菌通过导管纹孔向邻近细胞的进一步侵染,这种反应可能参与了疣粒野生稻对Xoo的抗性。     

水稻白叶枯病菌单细胞系毒力分化研究

 以稀释倒平板法从0型菌086和IV型菌967-4和9620中分离到59个单细胞系;在12个近等基因系品种上,086和其单细胞系表现为弱毒力,2个IV型菌及其单细胞系能克服抗病基因Xa-1、2、3、8、10、11、14的抗性,不能克服Xa-21、4、5、7、13的抗性;带主效抗病基因的品种Asominori、XM5、M41、XM6和丰锦能把3个母株的59个单细胞系区分为12种数量差异或质量差异的不同致病型;将此5品种与近等基因系配合,适合作为病菌致病基因变异频度监测的寄主;采用"段叶沙培,切口取菌胶"法分离病菌,在中国致病型鉴定品种上划分的致病型,是田间病菌群体毒力结构的表型反应。     

云南疣粒野生稻抗白叶枯病鉴定及叶片组织学观察

 本研究采用水稻白叶枯病菌强致病性代表菌株,评价了云南省自然分布的疣粒野生稻代表生态居群18份材料的抗病性,观察叶片组织学结构,初步分析了疣粒野生稻的抗性基因。结果表明,16份材料表现中抗、高抗甚至免疫;9份材料对4个菌株的抗性有一定差异;同时发现云南地方代表菌株X1和CN9404的致病性比C1和BD8438强。叶片组织学结构表明,高抗材料与感病的栽培稻米泉黑芒都无蜡质层,二者的叶肉组织、薄壁细胞和表皮细胞相同,表皮毛、维管束、厚壁组织等的差异也不明显,不足以引起抗病性差异。疣粒野生稻高抗或免疫白叶枯病并非借助其特殊叶片结构的物理作用,而主要是抗病基因的作用。参试疣粒野生稻中没有与Xa1、Xa21同源的基因,加之独立进化,推断其具有新的优异抗白叶枯病基因,值得深入研究和发掘利用。     

水稻白叶枯病菌及其毒素引起烟草叶片组织坏死机制的研究

 水稻白叶枯病菌JXO Ⅲ细胞悬浮液及其分泌的毒素溶液接种到烟草叶片中,都能在烟草叶片上产生快速的坏死反应。引起坏死反应所需的最短时间分别为接种后8 h和0.5 h。低浓度的JXOⅢ(< 107 cfu/ml)接种后36~48 h内形成褪绿斑,而低浓度的毒素(< 2.5 mg/ml)接种后随时间延长在接点无任何可见变化。依文斯蓝(Evans blue)染色发现,毒素和JXOⅢ分别在接种后0.5 h和6 h内细胞大量死亡。叶圆片法测定表明,接种毒素后2 h内烟草细胞膜透性迅速上升,接种JXOⅢ后9 h细胞膜透性开始明显上升。毒素处理的烟草叶片中LOX、POX、SOD、CAT活性水平较对照降低,而JXOⅢ处理中上述酶活性较对照有不同程度的增加。蛋白质合成抑制剂环己酰亚胺,RNA合成抑制剂放线菌素D和钙离子通道阻断剂氯化镧分别以7.1×10^-5 M、1×10^-4 M和1×10^-3 M浓度有效地抑制JXOⅢ在烟草上形成坏死反应,这些抑制剂对毒素在烟草上的坏死反应则没有影响。     

云南水稻白叶枯病菌生理小种初析

从云南省 5个地州14个县市的水稻白叶枯病标本中分离水稻白叶枯病菌菌株 ,选择具有区域代表性的菌株 5 1株 ,利用已知抗病基因的近等基因系 ,在孕穗期应用剪叶法接种明确其生理小种。鉴定结果表明 ,云南省水稻白叶枯病菌小种复杂多样 ,共有 14种类型 ,暂定为YN1～YN14 ,优势生理小种为YN3、YN8、YN11,其中YN3分布在红河、德宏等 4个县市 ;YN8小种分布在大理等地区 ,小种的分布可能受地理区域的影响