苹果茎痘病毒外壳蛋白的原核表达及抗血清制备

利用基因重组技术将苹果茎痘病毒Applestempittingvirus(ASPV)完整cp基因在大肠杆菌中表达,以纯化蛋白为抗原免疫新西兰兔制备其抗血清,并采用ACP-ELISA法测定其效价和应用PAS-ELISA法对其抗血清的有效性进行初步鉴定。结果显示,cp基因获得了高效表达,表达产物与Anti-His抗体产生特异性免疫反应。制备的抗血清具有较强的特异性,效价为1:800。PAS-ELISA检测结果显示,9个苹果样品中有8个样品与RT-PCR检测结果一致,仅1个样品RT-PCR检测为阳性,而PAS-ELISA检测为阴性。表明所制备的抗血清具有一定的应用潜力。     

香蕉苞片花叶病毒CP基因的原核表达及抗血清制备

本试验成功构建了香蕉苞片花叶病毒(Banana bract mosaic virus,BBrMV)外壳蛋白(coat pro-tein,CP)基因的原核表达载体,并诱导表达了34 kDa的融合蛋白His.CP。对该原核表达蛋白的可溶性分析表明,该融合蛋白以包涵体形式存在。利用组氨酸标签纯化试剂盒对目的蛋白进行了纯化,获得了高纯度的融合蛋白。以纯化的蛋白为抗原免疫健康家兔,成功制备了抗BBrMV CP基因编码蛋白的兔抗血清。Western-blotting结果表明这种抗血清有很强的特异性。血清效价测定的效价在51 200倍以上,对植物材料的合适检测浓度为1:800～1:3 200。     

玉米矮花叶病毒HC-Pro的纯化及抗血清制备

 本实验提纯了玉米矮花叶病毒(MDMV)的辅助成份-蛋白酶(HC-Pro),并制备了其抗血清。MDMV HC-Pro的分子量约为57kD,提纯产量为0.3mg/100 g病叶。琼脂免疫双扩散测定证明MDMV HC-Pro抗血清的效价为1:16;微量免疫沉淀法测定时其效价为1:1024。该抗血清只与MDMV HC-Pro有明显的反应,与健康玉米汁液和MDMV无反应。MDMV HC-Pro抗血清可以专化性地抑制HC-Pro的蚜传活性。     

辣椒轻斑驳病毒cp基因的原核表达及抗血清制备

辣椒轻斑驳病毒(Pepper mild mottle virus,PMMoV)属于烟草花叶病毒属,是辣椒的重要病毒种类之一。将PMMoV的外壳蛋白(cp)基因克隆至原核表达载体pET32a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,重组PMMoV CP蛋白以可溶形式表达,纯化后获得分子量约35 kDa的融合CP蛋白。以该重组蛋白为抗原免疫新西兰兔制备了PMMoV CP特异性抗血清。Western blot检测结果表明该抗血清与重组CP蛋白发生强烈的免疫反应,间接酶联免疫吸附测定(ID-ELISA)结果显示该抗血清针对重组CP蛋白的效价达1∶25 600,针对PMMoV病汁液的效价达1∶4 000,检测灵敏度为1∶3 200,且该抗血清不与PMMoV同属或不同属的其它6种病毒汁液发生免疫反应,具有较好的特异性。利用该抗血清对42份田间辣椒病样进行检测,阳性率达38%,与进口商品化试剂盒检测结果一致,说明该抗血清可用于PMMoV的ELISA诊断。     

樱桃病毒A北京分离物外壳蛋白的原核表达及抗血清制备

根据前期研究获得的樱桃病毒A北京分离物(Cherry virus Aisolate Beijing,CVA-BJ)外壳蛋白基因序列设计引物,将此基因克隆到原核表达载体pET-28a后转化大肠杆菌BL21(DE3),以终浓度为1 mmol/L的IPTG进行诱导表达。Ni珠吸附法纯化表达产物后免疫家兔制备抗血清。间接ELISA测得抗血清效价为1∶2048。以纯化后的蛋白和樱桃叶片总蛋白为检测材料,Western blot分析表明抗血清具有高度特异性。间接ELISA方法检测樱桃病叶,结果呈阳性,与RT-PCR检测结果一致。表明制备的抗血清可用于感病樱桃样品中CVA的检测。     

百合斑驳病毒外壳蛋白基因原核表达、抗血清制备及其应用

为了建立百合斑驳病毒(Lily mottle virus,LMoV)的快速检测方法,采用RT-PCR方法从感染LMoV的百合叶片中克隆该病毒的外壳蛋白(coat protein,CP)基因,然后连接到原核表达载体pET28a(+)上,导入大肠杆菌Escherichia coliBL21(DE3)并诱导表达,以表达的重组蛋白为抗原制备该病毒的抗血清。结果显示:LMoVCP全长为822 bp,编码274个氨基酸;SDS-PAGE及Western blot检测结果表明,经IPTG诱导得到了分子量约为34 kD带有HIS标签的目的蛋白;用该蛋白制备的抗血清经间接ELISA和Western blot检测结果显示,其效价为1∶51 200,具有较高的特异性,可用于感染LMoV百合的检测,其检测结果与RT-PCR检测结果一致。     

马铃薯X病毒运动蛋白基因的原核表达、抗血清制备及应用

构建马铃薯X病毒运动蛋白(P25)原核表达载体,并在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中诱导表达融合蛋白,所表达的P25蛋白经SDS-PAGE电泳纯化后免疫小鼠,抗血清效价为1∶4000,抗血清与PVX有特异性反应(P/N>2),且具有较强的反应特异性,而与PVY、TMV均不发生反应.该方法制备的抗血清可用于ELISA检测PVX感病植株及Western blot检测转基因植株.     

甘薯潜隐病毒莲藕分离物辅助成分-蛋白酶基因原核表达及抗血清制备

根据已报道的甘薯潜隐病毒莲藕分离物sweet potato latent virus-lotus(SPLV-lotus)核苷酸序列设计引物,采用RT-PCR从感病莲藕样品中扩增获得SPLV-lotus辅助成分-蛋白酶基因(HC-Pro),大小为1 375 bp。通过序列测定和分析后,将其克隆到原核表达载体pGEX4T-1,转化大肠杆菌Rosetta(DE3),经IPTG诱导并纯化获得大小为74 kD的融合蛋白pGEX4T-1-HC-ProSPLV-lotus。SDS-PAGE结果显示,融合蛋白获得过量表达。以纯化蛋白为抗原免疫新西兰大白兔制备抗血清,采用ELISA和Western blot对抗血清效价和特异性进行检测,当HC-Pro抗血清稀释比为1∶256 000时,ELISA显色后OD450读数仍高于0.6,表明所制备抗血清合格;Western blot结果显示,在感染SPLV-lotus植株样品中仍能检测到单一目的条带。这些结果表明,制备的抗血清效价合格且可用于SPLV-lotus的特异性检测。     

稻瘟菌侵染诱导的水稻过氧羟基脂肪酸羟化环氧化酶的抗血清制备

 通过选择性抽提、盐析、阴阳离子交换柱层析等步骤从非亲和性稻瘟菌侵染的120g稻叶中获得了诱导性过氧羟基脂肪酸羟化环氧化酶(POG)的电泳纯蛋白250μg。利用这些纯化蛋白,制备了POG的抗血清。点免疫杂交结果表明,该抗血清效价大于1:5000,其抗原检测灵敏度可达0.05ng,并具有较好的特异性。蛋白印迹结果显示,稻瘟菌侵染可诱导POG在水稻细胞膜上的累积。     

草莓镶脉病毒ORF Ⅵ基因的原核表达与抗血清制备

为了分析草莓镶脉病毒（Strawberry vein banding virus,SVBV）ORF Ⅵ基因的功能,采用原核表达技术获得该基因表达的重组蛋白并制备其抗血清。利用PCR技术扩增得到SVBV中国分离物的ORF Ⅵ基因,将此基因克隆到原核表达载体pET-SUMO上,获得重组质粒pET-SUMO-ORF Ⅵ。转化大肠杆菌BL21（DE3）后,经IPTG诱导与Ni²⁺-NTA亲和柱纯化,获得分子质量约为90 kD的重组蛋白。以纯化的重组蛋白为抗原免疫家兔制备抗血清,采用间接ELISA和Western blot方法测定抗血清的效价、反应灵敏度以及ORF Ⅵ基因在本氏烟中的瞬时表达。结果显示,间接ELISA法测定抗血清对重组蛋白的效价达1：256 000,Western blot法能够检测到稀释64 000倍的重组蛋白。利用稀释2 000倍的抗血清,仍能够检测出SVBV中国分离物和美国分离物ORF Ⅵ基因在本氏烟中瞬时表达的蛋白。     

甘蔗花叶病毒VPg蛋白的原核表达及其在玉米中的免疫定位

 利用RT-PCR方法从感染甘蔗花叶病毒北京分离株(SCMV-BJ)的玉米叶片中扩增得到VPg基因,将VPg基因连接到原核表达载体pET-28a上。获得的重组子转化大肠杆菌BL21(DE3)后,用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE分析表明,VPg在大肠杆菌中获得了高效表达,产生的融合蛋白分子量为30 kD。将融合蛋白纯化后免疫兔子获得了特异性较高的抗血清。ACP-ELISA测定抗血清的效价为1/4096。利用该抗血清对健康玉米和病毒侵染的玉米茎、叶脉和叶片进行免疫金标记,结果表明在茎和叶脉的韧皮部筛管的细胞壁处有金颗粒。     

草莓镶脉病毒ORF I基因的克隆、原核表达及抗血清制备

The total DNA was extracted from strawberry leaves infected with Strawberry vein banding virus (SVBV) by CTAB method. Specific primer pairs were designed to amplify the gene ORF I of SVBV-Shenyang isolate by PCR, gene ORF I was cloned into modified prokaryotic expression vector pET-32a (+)-GST, the recombinant plasmid pET-ORF I was transformed into E. coli DH5α, then the positive clones were screened and sequenced. The recombinant plasmid was extracted and transformed into Escherichia coli BL2l (DE3), the fusion protein with an approximate molecular weight of 56 kDa was obtained with IPTG induction and Ni²⁺-NTA affinity column purification. The purified fusion protein was used to immunize the rabbits to prepare the specific antiserum. The result of ELISA showed that the titer of the prepared antiserum is up to 1:520 000, Western blot analysis indicated that the prepared antiserum could reacted specifically with purified recombinant fusion protein. Not only the expression of P1 protein in SVBV infected-strawberry leaves, but also the expression of P1 protein in P1-infiltrated Nicotiana benthamiana leaves could be detected, using 2 000 times diluted antiserum.     

草莓镶脉病毒ORF I基因的克隆、原核表达及抗血清制备

<正>草莓镶脉病毒(Strawberry vein banding virus, SVBV)是一种世界范围内广泛分布的草莓病毒,SVBV侵染栽培草莓(Fragaria ananassa)可造成植株生长衰弱,匍匐茎数量减少、果实偏小,产量和品质大幅度降低[1]。SVBV属于花椰菜花叶病毒科(Caulimovidae)花椰菜花叶病毒属(Caulimo-virus)。花椰菜花叶病毒(Cauliflower mosaic virus, CaMV)是C     

甜瓜黄斑病毒外壳蛋白的原核表达、多克隆抗体制备及其应用

本研究将甜瓜黄斑病毒(Melon yellow spot virus,MYSV)外壳蛋白基因克隆到原核表达载体pET32a(+)中,利用大肠杆菌系统表达该蛋白,免疫家兔制备其多克隆抗体。本文通过多克隆抗体,建立了间接ELISA(ID-ELISA)、免疫捕获PCR(IC-RT-PCR)、Western blot及dot-ELISA的MYSV检测方法,以上各种方法均能特异的检测MYSV。检测结果表明:ID-ELISA方法检测效价大于1∶6 400;Western blot检测灵敏度达到1∶320(W/V,g·mL-1);Dot-ELISA检测灵敏度达到1∶80(W/V,g·mL-1),且用牙签等非实验室工具便能检测该病毒,能高效地应用于田间样品的检测。     

甘蔗黄叶病毒运动蛋白的原核表达和抗血清制备

甘蔗黄叶病毒(Sugarcane yellow leaf virus,ScYLV)属于黄症病毒科(Luteoviridae)、马铃薯卷叶病毒属(Polerovirus),主要由蚜虫传播,能够侵染甘蔗、玉米等多种作物,引发严重的植物病害。本研究将编码ScYLV运动蛋白(Movement protein,MP)的基因连接到pDB-His-MBP原核表达载体上,转化到大肠杆菌菌株Rosetta中,经IPTG诱导,表达分子量大小约为70 kDa的融合蛋白,将纯化后的融合蛋白制备多克隆抗血清。利用western blot检测抗血清的效价为1∶128 000,灵敏度为1∶256,抗血清不与马铃薯卷叶病毒属(Polerovirus)的其它病毒以及黄症病毒属(Luteovirus)病毒发生交叉反应,具有很好的特异性。本文制备的ScYLV MP抗血清可以用于ScYLV的检测,并为深入研究ScYLV与寄主的相互作用等问题提供材料基础。     

玉米黄花叶病毒运动蛋白的原核表达纯化与抗血清制备

为实现对玉米黄花叶病毒（maize yellow mosaic virus,MaYMV）的血清学检测,丰富该病毒的检测方法,将编码MaYMV运动蛋白（movement protein,MP）的基因连接到原核表达载体pDBHis-MBP上,将构建成功的原核表达质粒转化到大肠杆菌Escherichia coli中诱导表达融合蛋白,将纯化后的融合蛋白对新西兰大白兔Oryctolagus cuniculus进行免疫并制备MaYMV MP多克隆抗血清,并采用Western blot对抗血清的效价、灵敏度和特异性进行检测。结果显示,利用成功构建的原核表达载体经诱导表达获得分子量大小约为62 kD的融合蛋白,纯化后对新西兰大白兔进行免疫获得MaYMV MP抗血清,该抗血清的效价为1∶128 000,灵敏度为1∶32,且该抗血清能够特异性地检测到本氏烟Nicotiana benthamiana中瞬时表达的MaYMV MP,而不与马铃薯卷叶病毒属Polerovirus及黄症病毒属Luteovirus的其他病毒发生血清学交叉反应,证明该抗血清具有良好的特异性。表明本研究制备的MaYMV MP抗血清能特异性...     

建兰花叶病毒RdRp基因的原核表达及多克隆抗体制备

采用RT-PCR技术扩增出建兰花叶病毒贵州分离物(CyMV-GZ)的依赖RNA的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRp)基因保守序列。测序结果表明:该RdRp基因序列长735 bp,编码245个氨基酸残基。构建原核表达载体pET32a(+)-RdRp,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),在37℃以0.3 mmol·L~(-1) IPTG诱导表达分子量约49 kDa重组蛋白。以该重组蛋白为抗原免疫小鼠,制备的抗体效价达1∶204 800。间接ELISA检测显示该多抗与CyMV病叶汁发生特异性免疫反应,而与其他6种同属或不同属病毒叶汁无血清学交叉反应。本实验为进一步研究RdRp的功能以及从分子水平上探讨该病毒的致病机制奠定了基础。     

大麦黄矮病毒PAV青海分离物运动蛋白抗血清制备及其与同属BYDVs的血清学关系

 大麦黄矮病毒(Barley yellow dwarf viruses, BYDVs)属于黄症病毒科,主要以蚜虫为介体进行传播,引发多种作物减产或绝收。本文将BYDV-PAV青海分离物的运动蛋白(MP)克隆到原核表达载体pDB-MBP-His上,转化大肠杆菌Rosetta(DE3),在IPTG诱导下表达蛋白分子量约为61 kDa的融合蛋白。将纯化后的蛋白作为抗原免疫‘新西兰’大白兔制备抗血清,Western blot检测本生烟瞬时表达带标签的MP蛋白,结果显示该抗血清效价为1∶32 000,灵敏度达1∶256,且该抗血清可与相差34个氨基酸的PAV015株系以及隶属于黄症病毒属其他的BYDVs(PAS、MAV、KerⅡ和KerⅢ)MP均能发生强烈的血清学反应,具有血清学相关性。本研究制备的大麦黄矮病毒PAV青海分离物运动蛋白多克隆抗体为探索BYDV-PAV运动蛋白的功能以及作用机制打下了基础。     

香蕉线条病毒ORFⅡ基因的原核表达及抗体制备

 ORFⅡ gene of Banana streak virus GuangDong isolate (BSV-GD) was amplified from a BSV-GD recombinant plasmid by PCR, and the gene was expressed by being cloned into prokaryote expression vector pET-28b (+). The fusion protein was about 16.5 kDa in size and was soluble with SDS-PAGE analysis. The purified protein was obtained by using the histidine labeling kit of N-terminus of protein. The antiserum was obtained by immunizing healthy rabbits with the purified protein. Western blot and ELISA analysis showed that the special antiserum of BSV possessed high titer, which was tested as 1:51 200. The study was a base for further research on BSV including ORFⅡ gene function and virus detection.