农杆菌介导法获得转可溶性淀粉合成酶基因籼稻

采用农杆菌介导法将胚乳特异性表达谷蛋白1(Glutelinl，Gtl)基因控制下的可溶性淀粉合成酶基因sss导入籼稻恢复系明恢86，共获得53个独立转化再生植株。PCR检测表明，sss基因已整合进水稻的基因组中。直链淀粉含量测定结果表明，转基因植株后代直链淀粉含量较对照有较大幅度的下降。     

用根癌农杆菌介导获得籼稻转基因植株

用携带p13W4质粒的根癌农杆菌EHA105感染籼稻龙特甫品种的幼胚愈伤组织，经共培养并在潮霉素25－50mg/L浓度条件下筛选2－3次，获得了对潮霉素表现抗性的愈伤组织，其愈伤组织转化频率为25.3%,将抗性愈伤组织转入分3化培养基培养形成植株，经GUS活性测定和PCR检测，结果证明外源基因确已导入这些转基因植株之中。     

农杆菌介导籼稻Xa21基因的转化及其遗传研究

应用农杆菌介导转化体系，成功地将Xa21基因导入籼稻幼胚来源的愈伤组织，获得籼稻优良恢复系T461、优良常规品种粤香占和中1063个品种共33个独立的转基因株系。PCR和Southern分析结果表明，Xa21基因已整合到转基因植株基因组中。接种分析表明，T0代转基因植株的白叶枯病抗性得到不同程度的提高，转基因植株自交T1代白叶枯病抗性表现出分离，且大多为1-2个整合位点的孟德尔方式遗传，与Southern分析结果一致。     

以农杆菌为介导的GUS基因在籼稻中的转移

用籼稻品种澳青占，早丝占，七山占的幼胚和幼穗为外植体，探索以农杆菌为介导的ＧＵＳ基因灿稻中的转移，结果培养后的愈伤组织比未经共培养的愈伤组织生长缓慢，再生植株的诱导条件亦有变化，共培养时间以４０分钟至２小时为佳。     

农杆菌介导遗传转化获得转CP4基因籼稻的研究

  目的  建立籼稻‘中恢161’Oryza sativa subsp. indica ‘Zhonghui 161’农杆菌Agrobacterium tumefaciens介导的转化体系。  方法  以籼稻‘中恢161’的成熟胚为材料,设置了5个草甘膦质量浓度(100、200、300、400和500 mg·L?1)进行胚性愈伤组织的草甘膦敏感性试验。利用农杆菌介导法,将草甘膦抗性基因CP4-EPSPS导入‘中恢161’的胚性愈伤组织中,转化后的胚性愈伤组织分别在含有300、350和400 mg·L?1草甘膦的选择培养基上进行抗性筛选。抗性愈伤组织进一步分化、成苗。  结果  草甘膦质量浓度为300~400 mg·L?1时,愈伤组织褐化率约50%,具有很好的选择效果。经统计,300、350和400 mg·L?1草甘膦抗性筛选后,愈伤组织阳性率分别为40.16%、61.72%和84.04%,抗性愈伤组织的分化率为46.43%,成苗率为32.84%。共获得67株再生小苗,经PCR检测,43株成功转入CP4基因,再生植株阳性率为64.18%。  结论  建立了‘中恢161’农杆菌介导的转化体系。图5参20     

应用农杆菌介导法将淀粉分支酶基因反义表达载体转入玉米自交系的研究

以玉米自交系“综31”和“P12”的胚性愈伤组织为材料，通过愈伤组织对潮霉素的敏感性试验，确定了潮霉素50～70mg／L为愈伤组织适宜选择压。利用农杆菌介导法将玉米淀粉分支酶基因的反义表达栽体导入玉米自交系中，并对农杆菌转化系统的条件进行了研究。结果表明：采用EHA105的菌株振荡20h后，菌液OD值为0．5～0．6时侵染25min为农杆菌转化的最适条件。对转化的愈伤组织进行分化诱导出苗后进行PCR检测，证明外源目的基因已整合到玉米基因组中，转化率最高达到5．3％，并得到了转化植株的种子。     

根癌农杆菌介导籼稻高效遗传转化体系的构建

系统分析影响根癌农杆菌介导籼稻遗传转化的主要因素,比较不同培养基、培养条件、继代次数、菌液浓度、侵染时间等因素对籼稻遗传转化的影响,并组建一个高效的籼稻遗传转化技术体系。结果表明,成熟胚或幼胚经过NMB培养基诱导,NB培养基继代培养这样的培养基组合比较适合籼稻胚性愈伤组织的培养。在农杆菌介导转化时控制好菌液浓度、侵染时间以及分化培养基中KT和NAA的浓度配比,并进行预分化处理,可显著提高抗性植株的分化效率,减少白化苗的产生,最终使转化率提高到8%。     

农杆菌介导转mgfp4基因水稻的获得

通过农杆菌介导法将携带mgfp4基因的植物表达载体pCAGFPHyg导入水稻明恢86中,获得101个独立克隆的转基因植株。PCR检测和Southern blot分析证明外源基因已整合进水稻基因组中,T0代种子的分离分析结果表明大部分转基因植株为单T-DNA插入。荧光检测及RT-PCR分析结果显示mgfp4基因能在水稻中表达,但其发出的绿色荧光检测效果不甚理想。     

农杆菌介导籼稻遗传转化研究的进展及策略

近年来,农杆菌介导法转化技术已广泛应用于粳稻遗传转化中。但是对籼稻遗传转化相对困难,由于水稻两个亚种遗传差异大,籼稻对转化反应的基因型依赖性强,愈伤组织诱导及分化率低。本文扼要回顾了农杆菌介导籼稻转化研究的历程,系统介绍了影响籼稻转化的主要因素,分析了农杆菌介导籼稻遗传转化研究中存在的问题,并提出了提高农杆菌介导籼稻遗转化效率的对策。高效籼稻转化体系的建立可以加速水稻转基因品种改良育种进程,推进水稻功能基因组研究的开展。     

利用农杆菌介导法获得转ipt基因半夏植株

以贵州珍珠半夏Pinellia ternate(Thunb.)Breit为材料,采用根癌农杆菌介导法,探索了影响半夏遗传转化效率的主要因子.结果表明,卡那霉素的最佳筛选浓度是100 mg/L,侵染时间、共培养时间、乙酰丁香酮浓度对转化频率都有一定的影响.其中侵染时间为20 min,共培养时间为3 d,乙酰丁香酮的浓度控制在60～100 mg/L时可以有效提高遗传转化效率.在此基础上辅以超声波处理5 min,可以有效提高叶柄转化的瞬时表达率.对抗性转化植株进行Gus染色和PCR检测,结果表明外源基因ipt已经整合到半夏基因组中.     

籼粳稻对农杆菌遗传转化反应的差异及提高转化率的研究

通过对粳稻品种日本晴及5个籼稻品种的研究,发现籼稻、粳稻在成熟胚愈伤组织培养、农杆菌遗传转化的最适条件方面存在差异.在MS,CC,NB培养基上,日本晴的愈伤组织诱导率达86.37%以上,远高于各籼稻品种;与农杆菌液的共培养时间,籼、粳稻均以3 d为宜;转化后的籼稻抗性愈伤组织用40 mg/L的潮霉素筛选效果较好,日本晴则需用50 mg/L的潮霉素筛选;幼苗生根阶段,籼稻的潮霉素适宜质量浓度为20～30 mg/L,日本晴的潮霉素适宜质量浓度为50 mg/L;日本晴的gus基因瞬时表达率强于各籼稻品种,hpt基因转化率也高于各籼稻品种.     

浙恢7954农杆菌介导法遗传转化培养基的优化

以综合性状优良的籼稻品种浙恢7954的成熟胚为材料,比较了在遗传转化不同阶段培养基成分对愈伤组织生长及植株再生的影响,进行遗传转化体系的优化。结果表明,最优的愈伤组织诱导培养基为Y1、愈伤组织抗性选择培养基为J3、愈伤组织分化培养基为D6,在此条件下,GFP转化率达26.8%。     

rbe1正、反义基因改变籼稻直链淀粉含量的研究

用农杆菌介导法将水稻淀粉分支酶1正、反义基因rbe1分别导入籼稻恢复系明恢81中。PCR和Southern杂交检测表明：rbe1已整合进水稻基因组中。T_0代种子直链淀粉含量测定结果表明：转rbe1正向表达结构的明恢81直链淀粉含量总体上明显下降,转rbe1反向表达结构的明恢81直链淀粉含量总体上明显上升。     

农杆菌转化花粉愈伤组织获取纯合的转基因水稻植株

应用农杆菌介导法成功地将玉米转座子Ds导入粳稻(OryzasattvaI.subsp.japontca)中花11的花粉愈伤组织中,基因转化以对除草剂PPT有抗性的Bar基因和潮霉素抗性基因Hpt为选择标记.共获得了18个独立的转基因绿苗,其中单倍体11株,二倍体7株.转基因植株均抗除草剂BASTA.考查了二倍体植株种子后代(T1)对BASTA的抗性,7个株系的所有植株均抗BASTA,而未发生感抗分离,表明外源基因在转基因植株中是纯合的.PCR和Southernblotting的研究支持上述结果.对获得纯合转基因株系的各种方法做作了比较和讨论.     

反义Waxy基因转化籼稻9311的初步研究

以籼稻品种9311为材料,研究了不同诱导培养基对籼稻9311的诱导率,以及农杆菌浓度、浸染时间和干燥处理时间对抗性愈伤率的影响,进而采用农杆菌介导的共转化方法将含有反义Waxy基因的p13W8质粒和含有潮霉素抗性标记基因的p1300质粒同时转化受体材料.结果表明:籼稻9311成熟胚在含质量浓度为3.0 mg/L的2,4-D的N6基本培养基上具有较高的愈伤组织诱导率,且愈伤的胚性性状良好;愈伤组织在OD600值为0.6的农杆菌菌液中浸染10 min、干燥1.5～2.0 h处理后能够获得较多的抗性愈伤组织;对转化水稻的再生植株进行PCR检测表明,反义Waxy基因已整合进T0代水稻基因组中.     

籼稻1701转Pi9基因株系的遗传分析及抗瘟性鉴定

利用农杆菌介导法将广谱抗稻瘟病基因Pi9导入籼稻品种1701中,得到了大量的T1代和T2代转基因植株.对T2代植株进行遗传分析和稻瘟病抗性鉴定,结果表明,外源基因Pi9已转入到受体基因组中,并在T2代植株中得到表达.     

OsVIP1 RNAi转基因水稻植株的构建

为进一步阐明农杆菌介导的遗传转化分子机制,进而利用分子生物学方法提高农杆菌转化水稻效率,以水稻品种中花11为遗传转化受体材料,利用RNAi技术对水稻中拟南芥AtVIP1蛋白的同源蛋白进行了功能研究。通过同源性比对得到水稻中拟南芥AtVIP1蛋白的同源蛋白序列,命名为OsVIP1,构建了该蛋白基因2个片段(R1和R2)的RNAi表达载体pDS1301-2-R1和pDS1301-2-R2,通过农杆菌介导的方法分别转化水稻中花11。对转基因抗性愈伤进行统计,结果表明,由携带pDS1301-2-R1和pDS1301-2-R2载体转化的抗性愈伤的形成受到一定程度抑制。经PCR检测,证明2个片段R1和R2均成功整合到再生水稻植株基因组中;半定量RT-PCR分析显示部分RNAi转基因植株中OsVIP1基因表达被成功抑制。     

籼稻品种93-11遗传转化中抗生素适宜剂量的筛选

为优化农杆菌介导转化体系,研究了两种常用抑菌剂头孢霉素(cef)和羧苄青霉素(cb)的抑菌效果和对籼稻品种93-11成熟胚培养的影响,并进一步研究选择剂潮霉素(hyg)对愈伤诱导、分化和种子萌发生根的影响,确定其作为选择剂的有效浓度.对cb和cef共设置12种质量浓度处理,各处理都能完全抑制农杆菌的生长,同时对愈伤的诱导和生长没有不良影响,但是有些处理使愈伤的分化率下降.150、250 mg.L-1cb的单独作用,400、500 mg.L-1cef的单独作用,以及cb为100mg.L-1时,300、400、500 mg.L-1cef的3种互作处理都不影响愈伤的分化率;但cef高达600 mg.L-1时明显降低愈伤的分化率,达极显著水平,使分化率降到7%;cb为50 mg.L-1时,350、450、550 mg.L-1cef的3种互作处理都极显著地降低愈伤的分化率,表明高浓度的cef以及添加小量cb的处理与cef之间的互作对分化率的影响十分显著.两种抑菌剂单独使用(400-500 mg.L-1cef,150-250 mg.L-1cb)即有效抑制转化和培养过程中农杆菌的繁殖,同时不影响愈伤的生长和分化.对hyg的研究表明,愈伤诱导和分化对hyg最为敏感,5 mg.L-1的剂量足以使出愈率为0,使愈伤的分化率为0;hyg对愈伤的致死剂量为40 mg.L-1;hyg对种子萌发生根的致死剂量为25 mg.L-1.因此,在愈伤分化阶段不宜加入选择剂;在抗性愈伤组织筛选阶段加入hyg的适宜质量浓度要大于40 mg.L-1;利用愈伤诱导和种子萌发生根对hyg的敏感性,可用于转基因种子的筛选,筛选质量浓度分别要大于5和25 mg.L-1.     

籼米淀粉与芳樟醇、庚内酯包合物的制备及其贮藏稳定性比较

为研究籼米淀粉包合芳樟醇、庚内酯的制备及两种风味物质对贮藏稳定性的影响,采用热熔法分别制备籼米淀粉-芳樟醇与籼米淀粉-庚内酯包合物。参数优化实验表明,制备籼米淀粉-芳樟醇包合物的最佳条件为主客比为10:0.2g/μL,包合温度为40℃,包合时间为50min,最大包合率为59.91%;籼米淀粉-庚内酯的最佳条件为主客比为10:0.5g/μL,包合温度为50℃,包合时间为70min,最大包合率为50.15%。通过FT-IR、13C-NMR及SEM证明了包合物的形成,利用Avrami方程对两种包合物在不同条件下的释放进行比较,籼米淀粉-庚内酯包合物比籼米淀粉-芳樟醇包合物稳定。综合结果显示,庚内酯更适合籼米淀粉包合。