脱氧雪腐镰刀菌烯醇降解菌的分离和鉴定

【目的】分离筛选能够降解脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)的细菌,以期能在该毒素的生物解毒处理中得到应用。【方法】用高产毒禾谷镰刀菌F-25接种灭菌的小麦籽粒,培养后获得DON毒素;然后以DON毒素为唯一碳源进行DON毒素降解菌的驯化富集培养,得到能够降解DON毒素的混合菌群,逐一对分离到的细菌进行DON毒素降解能力检测,得到能够降解DON毒素的菌株。【结果】筛选得到的菌株DDS-1对液体培养基中的DON毒素的降解能力达95%以上,显著高于其它菌株;从形态、生理生化特性以及16S rDNA序列进行分析,DDS-1菌株初步鉴定为徳沃斯氏菌Devosia sp.;把DDS-1添加到小麦饲料中后,饲料中的DON毒素降解率达到75.47%。【结论】选出的DON高效降解菌株徳沃斯氏菌,不但对液体培养基中的DON毒素具有很好的降解作用,对饲料中DON毒素也有很好的降解效果。这为真菌毒素的生物脱毒处理提供了可行的方法。     

浅析脱氧雪腐镰刀菌烯醇含量随玉米生霉粒的变化关系

为了了解玉米脱氧雪腐镰刀菌烯醇含量与生霉粒含量之间的关系,本文通过对新收获玉米在特定的温湿度条件下保存,并产生生霉,通过对不同生霉含量的玉米的脱氧雪腐镰刀菌烯醇进行测定,并对测定结果进行分析,总结出在特定温度下,玉米脱氧雪腐镰刀菌烯醇随玉米生霉粒含量的增加而增加,为粮食企业仓储环节安全储存建言献策。     

浅析脱氧雪腐镰刀菌烯醇含量随玉米生霉粒的变化关系

为了了解玉米脱氧雪腐镰刀菌烯醇含量与生霉粒含量之间的关系,本文通过对新收获玉米在特定的温湿度条件下保存,并产生生霉,通过对不同生霉含量的玉米的脱氧雪腐镰刀菌烯醇进行测定,并对测定结果进行分析,总结出在特定温度下,玉米脱氧雪腐镰刀菌烯醇随玉米生霉粒含量的增加而增加,为粮食企业仓储环节安全储存建言献策。     

小麦中镰刀菌毒素脱氧雪腐镰刀菌烯醇污染现状与防控研究进展

脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）,又称呕吐毒素,是由小麦赤霉病菌禾谷镰刀菌复合群（Fusarium graminearum species complex）产生的单端孢霉烯族毒素,毒素在小麦籽粒中累积。作为B型单端孢霉烯族毒素,DON可以引起呕吐、拒食、腹泻、出血甚至死亡, 对猪的危害尤其严重。近年来,小麦赤霉病在世界各地高频率流行,尤其在中国长江中下游小麦生产区以及黄淮部分小麦产区、美国中西部小麦主产区,导致小麦中DON毒素严重超标,并引发了严重的食品安全问题。本文对国内外小麦中DON毒素的污染现状、产毒镰刀菌种类及其化学型的分布及其趋势、毒素产生的调控机制以及小麦中DON毒素的防控途径进行了论述,希望有助于镰刀菌毒素污染小麦质量安全的风险评估、监管以及科学处置。     

玉米粉中脱氧雪腐镰刀菌烯醇含量的测定能力验证

[目的]通过实验室能力验证活动分析了影响玉米粉中脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)检测结果的主要因素。[方法]依据GB 5009.111—2016第二法:免疫亲和层析净化HPLC法检验并优化前处理条件。[结果]采用5倍稀释浓度提取1 h和3 mL/min的净化速度,能力验证样品中DON含量为571μg/kg, RSD为0.25%。[结论]通过了中国食品药品检定研究院组织实施的NIFDC-PT-228《玉米粉中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定》能力验证,与中国食品药品检定研究院统计Z比分值为0.70,能力验证结果为满意,细化完善了国标测定脱氧雪腐镰刀菌烯醇的操作,为广大检验检测人员提供参考。     

免疫组织化学法定位猪肾脏中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的研究

脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)是目前全球污染谷物最严重的真菌毒素之一。在所有的易感动物中,以猪最为敏感。该研究采用DON标准品,通过静脉注射的途径,研究该毒素在猪体内肾脏的分布情况,为毒素的残留提供依据。选用10头健康阉公猪,随机分为2组,一组经乳静脉注射DON,注射剂量为75μg/kg体质量,另一组经乳静脉注射生理盐水。注射完成后开始计时,并观察记录猪的反应情况,待30min后放血宰杀,并迅速取肾脏,采用免疫组化法定位肾脏中DON的分布情况。研究结果显示,染毒剂量75μg/kg体质量组,静注后约5～10min开始出现明显的异常反应。具体表现为:狂躁不安,不停的磨牙,咀嚼,之后大量流涎,随之出现呕吐等症状,这一过程的持续时间对该组猪来说存在个体差异。免疫组化法定位结果显示,在肾小囊的壁层见有DON的分布。     

液相色谱-串联质谱法评估不同脱毒剂对脱氧雪腐镰刀菌烯醇的脱毒效果

评估市场上不同脱毒剂对脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)的脱毒效果,为饲料厂家及养殖户选择优质脱毒剂提供参考依据。从市场上收集了7种不同的脱毒剂(1~7号),对DON进行体外脱毒试验,采用液相色谱-串联质谱法分别测定脱毒前后霉变玉米中DON的含量,并计算其相应毒素的下降率。结果表明,不同厂家生产的脱霉剂脱毒效果差异显著,7种脱毒剂对DON的脱毒效果从好到差依次为7号、5号、6号、4号、1号、3号和2号。属酵母细胞壁类脱毒剂的5~7号对DON的脱毒效果比属铝硅酸盐类脱毒剂的1~4号明显,差异显著。     

免疫组织化学法定位猪脾脏中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的研究

利用免疫组织化学法研究了脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)在猪脾脏分布定位,为DON体内残留及DON对免疫系统影响进一步研究提供依据。选用10头健康阉公猪,随机分为二组,一组经乳静脉注射DON标准品,注射剂量为75μg/kg体重,另一组经乳静脉注射相当体积生理盐水。注射完成后开始计时,并观察记录猪的反应情况,待30min后放血宰杀,并迅速取脾脏,4%多聚甲醛固定,经脱水、包埋及切片后,采用免疫组化法定位脾脏中DON的分布情况。免疫组化法定位结果显示,在75μg/kg体重给药组中,脾组织中的血管壁周围见有DON阳性反应颗粒,而对照组未见阳性反应颗粒。     

脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）的毒素污染分析及防控研究进展

真菌毒素脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)可污染粮食和食品,对人和动物可造成消化和神经系统的中毒,严重时,可损害其造血系统甚至死亡。针对DON的生物特性研究、DON的检测方法,尤其是防控方面的研究进展进行论述,以期为后续研究提供科学依据。     

抗速灭威噬菌体单链抗体库的构建、筛选及鉴定

以速灭威抗原免疫的小鼠为实验对象,取其脾细胞,RT-PCR扩增抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因,重叠延伸PCR拼接单链抗体(ScFv)基因,克隆入噬菌粒表达载体pCANTAB5E并转化大肠杆菌TG1,成功构建了库容约7.6×105的抗速灭威噬菌体ScFv库。对该文库进行了5轮"吸附-洗脱-扩增"的富集筛选,获得了6个特异性较强的抗速灭威噬菌体ScFv阳性克隆。其研究结果为速灭威特异性抗体的大量制备奠定了一定的基础。     

抗堆型艾美耳球虫子孢子单链抗体的构建及表达

应用RT-PCR技术,从稳定分泌抗堆型艾美耳球虫子孢子抗原的单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞Easp-3G3中扩增出抗体VH和VL基因,通过在VH和VL可变区基因之间引入连接肽(Gly4Ser)3,体外构建抗堆型艾美耳球虫的单链抗体基因,并将其克隆至表达载体pET28a( )载体中进行表达,用Ni-NTA的金属亲和层析法进行纯化,通过SDS-PAGE和ELISA测定其纯度和生物学活性.电泳结果分析表明重组蛋白的相对分子量为32kDa,纯度为94%;ELISA反应结果证明该单链抗体保持了单克隆抗体的生物学特性,并能与堆型艾美耳球虫子孢子抗原发生特异性反应.     

牛病毒性腹泻-黏膜病病毒噬菌体单链抗体库的构建和筛选

为筛选牛病毒性腹泻-黏膜病病毒（Bovine viral diarrhea virus,BVDV）gP48蛋白的单链抗体,本研究利用噬菌体展示技术构建了gP48蛋白单链抗体克隆文库,通过微孔筛选法对抗体库进行3轮富集淘筛,利用ELISA技术测定单链抗体的亲和力,对亲和力较高的克隆进行基因测序分析和结合活性测定,旨在获得gP48蛋白的单链抗体。结果表明：1）成功构建了库容量为4.3×107的噬菌体单链抗体库,其重组率为83.3%,经三轮筛选对噬菌体抗体库进行富集,富集倍数为1.43×104;2）优化了间接ELISA方法,筛选到3株与BVDV gP48蛋白具有高亲和力的单链抗体以及其基因序列,通过IgBLAST分析显示,3株单链抗体均为鼠源IgG。综上,从gP48蛋白的单链抗体库中筛选获得3个具有高亲和力的单链抗体,可用于后续BVDV检测方法的建立。     

斑点叉尾天然单链(ScFv)噬菌体抗体库的构建及初步鉴定

以健康未经免疫的斑点叉尾为试验材料,取其新鲜外周血,分离淋巴细胞,提取总RNA,逆转录合成cDNA。PCR扩增重链Fd和轻链cDNA,以纯化的VH、VL基因为模板,以与VH基因3′-端和VL基因-5′端序列互补的Linker—Primer Mix为引物,将VH、VL随机拼接为ScFv。通过酶切连接,依次将PCR产物插入质粒p3MH相应位点,热激法转化大肠杆菌XL1-Blue,加入辅助噬菌体VCSM 13,构建噬菌体单链抗体库。测定库容并酶切鉴定。斑点叉尾天然单链(ScFv)噬菌体抗体库成功构建为进一步筛选特异性抗体及从斑点叉尾病变组织中提取特异性抗原用于免疫治疗奠定了基础。     

稀有放线菌小单孢菌噬菌体ΦHAU8基因组文库的构建

利用大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒pHZ1358作为载体,构建了小单孢菌噬菌体ΦHAU8的基因组文库,文库质粒酶切结果表明,噬菌体ΦHAU8基因文库中的质粒DNA是由载体pHZ1358和噬菌体基因组片段组成的.     

鸡胚成纤维细胞cDNA T7噬菌体表达文库的构建和鉴定

构建鸡胚成纤维细胞(CEF)T7噬菌体表达型cDNA文库,为筛选和研究CEF上病毒受体分子奠定基础。提取纯化CEF的mRNA,反转录合成双链cDNA,补平末端,连接EcoRⅠ/HindⅢ接头,双酶切,凝胶过滤层析除去小于400bp的cDNA片段,合成双链cDNA定向与T7噬菌体左右臂连接,体外包装后建成cDNA表达文库。测定文库大小、重组率,并以PCR鉴定cDNA插入片段的大小。结果表明,构建的cDNA文库滴度为2.2×107pfu/mL、扩增后滴度为3.5×1010pfu/mL,重组效率达98%、插入片段多在0.4～3kb之间,平均插入片段长约1.3kb。表明所建文库具有很高的质量,从而为筛选目的cDNA克隆奠定了基础。     

甘薯黑斑病菌基因组文库构建

通过DNA提取方法对比,采用CTAB/LiCl法提取甘薯黑斑病菌基因组DNA,再利用限制性内切酶BamH I对纯化的甘薯黑斑病菌基因组DNA进行部分酶切,获得大小为15kb左右的DNA片段.将经BamH I酶切消化的Lambda DASH II载体臂与DNA片段相连,然后以大肠杆菌XL1BlueMRA(P2)为寄主细胞,在国内首次成功构建了甘薯黑斑病菌(Ceratocystis fimbriata)基因组文库,所构建基因文库效价为4.12×105pfu/mL.     

噬菌体抗体库的构建及抗猪脂肪细胞膜单抗的筛选

 用猪脂肪细胞以免疫删减法免疫小鼠，取其脾细胞，RT-PCR扩增抗体重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）基因，克隆入噬菌粒表达载体pCANTAB5E中，构建单链抗体（ScFv）文库。用猪脂肪细胞，对其进行3轮吸附-洗脱-富集，筛选抗猪脂肪细胞膜单抗。经ELISA检测，51/96克隆具有与猪脂肪细胞结合活性，阳性率为53%，与猪肝细胞则成阴性反应，初步证明了单抗的特异性，为猪脂肪细胞膜单抗的制备提供了一种新的方法。     

PCV2 Cap蛋白噬菌体单链抗体库的构建及淘选

用重组的PCV2Cap蛋白免疫Balb/c小鼠,从免疫小鼠脾细胞中提取总RNA,经反转录后,扩增抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因,利用Overlap PCR方法将VH基因和VL基因组装成单链抗体(ScFv)基因,将ScFv基因克隆到噬菌粒载体pCANTAB-5E中,并将重组载体转化至感受态大肠杆菌TG1中,获得PCV2Cap蛋白的单链抗体文库,经测定抗体库库容为3.58×106。通过辅助噬菌体M13K07拯救,构建鼠源PCV2Cap蛋白的噬菌体单链抗体库。4轮生物淘选后,经ELISA方法检测,最终获得3株能与Cap蛋白特异性结合的噬菌体克隆。