山荆子类受体蛋白MbRLP7负调控杜梨对腐烂病的抗性

山荆子类受体蛋白MbRLP7为研究对象，结合生物信息分析、功能验证和表达量测定，分析了其在对腐烂病菌的抗性中的作用和调控机制。结果表明，MbRLP7编码的氨基酸序列与拟南芥AtRLP6和AtRLP7相似性最高，分别为43.0%和42.8%。MbRLP7启动子区域存在多个响应逆境相关信号的顺式作用元件，并响应腐烂病菌信号。将该基因导入杜梨悬浮细胞获得过表达细胞系3个。接种腐烂病病原菌Valsa pyri后，过表达细胞的发病速度显著高于野生型细胞。腐烂病菌代谢物处理后的所有过表达细胞系的细胞存活率显著低于野生型。此外，该基因的过表达增强了腐烂病菌代谢物对病原体相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns,PAMPs）触发的免疫反应（PAMP-triggered immunity,PTI）、活性氧相关基因和病程相关蛋白PR1的诱导。综上所述，MbRLP7负调控杜梨对腐烂病的抗性，PTI、活性氧和PR1参与了该调控过程。     

解淀粉芽孢杆菌BaA-007鉴定及其对苹果腐烂病的抑制作用

从苹果韧皮组织分离获得1株潜在的生防菌菌株。基于形态和16S rDNA、gyrA鉴定其为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens),命名为BaA-007(中国农业微生物菌种保存中心,菌种编号:ACCC60382)。该菌株及其次生代谢物对苹果腐烂病菌(黑腐皮壳菌,Valsa mali)生长具有抑制作用,离体条件下可显著降低腐烂病病斑的扩散速度。以BG培养基为基础培养基,筛选其最佳培养条件为蔗糖0.5%、细菌学蛋白胨1%、硫酸二氢钾0.1%、温度36℃、pH 7.0。BaA-007处理后,苹果水杨酸(SA)响应性基因PR1、PR2和NPR1,茉莉酸(JA)响应性基因PDF1.2、CORONATINE INSENSITIVE 1(COI1)和AOS,乙烯(ET)响应性基因ETR1、ERF1和HEL以及几丁质合成酶B基因(Chitnase B,ChiB)在接种处理后的不同时间点均上调。综上所述,菌株BaA-007对苹果腐烂病有显著的拮抗效果,有望作为防治苹果腐烂病制剂开发的生防菌株。     

异位表达苹果G蛋白偶联受体基因MdGCR1降低烟草的抗旱性

以‘嘎拉’苹果(Malus×domestica‘Royal Gala’)为材料,采用同源克隆和PCR技术分离了G蛋白偶联受体基因MdGCR1。其开放阅读框(ORF)为960 bp,编码含有319个氨基酸的蛋白。系统进化树分析显示,MdGCR1与梨GCR1亲缘关系最近,同源性最高。基因表达分析显示MdGCR1主要在苹果根、茎和叶中表达,在花和果实中的表达量较低;MdGCR1受多种逆境胁迫诱导,参与多种激素响应。构建了MdGCR1植物过表达载体,并通过农杆菌介导的遗传转化获得了转MdGCR1烟草。转基因材料抗性试验结果显示:超量表达MdGCR1显著降低烟草对干旱胁迫的抗性,表明苹果G蛋白偶联受体基因MdGCR1在响应植物抗旱胁迫中发挥重要作用。     

苹果花脸症状相关基因差异表达的分析

【目的】苹果花脸病主要由苹果锈果类病毒（apple scar skin viroid,ASSVd）引起，是一种严重危害苹果产量和果实品质的病害，通过分析苹果花脸症状相关基因表达，探索花脸症状形成的潜在机制。【方法】削取无症状且无ASSVd侵染的果皮和表现花脸症状的弘前富士苹果果皮，提取果皮总RNA，通过高通量测序并进行转录组数据分析。【结果】利用RT-PCR方法从表现花脸症状的苹果果皮中得到两条ASSVd序列，其基因组长度分别为331 nt和330 nt，与已公布的ASSVd山东烟台苹果分离物SDYT-1(MW302328.1)和SDYT-3(MW315909.1)完全一致。转录组测序结果表明，与无症状果皮相比，表现花脸症状的果皮中共有差异表达基因6938个，其中有3331个基因显著上调，3607个基因显著下调。通过差异表达基因功能注释分析，表明这些差异基因参与到植物激素（茉莉酸、水杨酸和生长素）合成和信号转导、苯丙烷生物合成等代谢途径。此外，转录组数据分析发现与植物防御反应相关转录因子的编码基因，如MdWRKY18-like、MdWRKY71、MdNAC29、MdWRKY70等在表现...     

超表达MdFLS2的拟南芥fls2突变体识别细菌鞭毛蛋白,提高对轮纹病菌的抗性

以红肉苹果‘紫红3号’愈伤组织为试材,克隆了细菌鞭毛蛋白受体基因MdFSL2,研究了其与拟南芥AtFLS2对细菌鞭毛蛋白敏感性差异以及对苹果轮纹病抗性的影响。进化树分析表明,MdFLS2与拟南芥AtFLS2亲缘关系较远,处于不同的进化树分支,与梨PbFLS2的亲缘关系最近。时空表达特异性研究表明,在苹果叶片中MdFLS2表达不随组织衰老而产生差异,能够被外源SA处理诱导,不受IAA、ACC处理影响;在根系中表达量最高,而在花与果实中表达量较低。在拟南芥中异源过表达MdFLS2,显著抑制植株生长,并出现叶片边缘枯死或细胞死亡的表型。在转基因拟南芥中受SA诱导的病程相关基因AtPR1、AtPR2和AtPR5,及衰老相关基因AtORE1和AtNAP的表达水平均显著高于野生型。为研究MdFLS2是否具有感知细菌鞭毛蛋白的能力,进行拟南芥根系生长抑制试验,MdFLS2超表达恢复了细菌鞭毛蛋白N端22个保守氨基酸肽段(flg22)对拟南芥fls2突变体根系生长的抑制作用,但flg22分别处理30和60 min,或20和40 min,flg22诱导的标志性基因表达水平及MAPK激酶活化水平在过表达MdFLS2的fls2突变体中显著低于同样处理的野生型。超表达MdFLS2提高了拟南芥叶片对轮纹病菌的抗性,并增强了拟南芥突变体fls2对假单胞菌DC3000的抗性。研究结果说明苹果MdFLS2是一个有功能的免疫相关基因,MdFLS2与AtFLS2在具体执行功能与作用机制上可能存在差异。     

茉莉酸合成基因LoxD参与调控番茄的抗旱性

为了研究茉莉酸(JA)调节番茄抗旱的机理,以番茄品种‘Castlemart’茉莉酸合成基因LoxD过表达植株(LoxD-oe)、LoxD点突变植株(spr8)以及对应的野生型(WT)为材料,进行自然失水处理,分析叶片相对含水量、可溶性糖、丙二醛含量、气孔开度和保卫细胞中H₂O₂含量,以及ABA信号通路和质膜相关离子通道基因等表达的变化。结果表明,LoxD受干旱胁迫诱导,过表达LoxD基因提高了叶片相对含水量和可溶性糖含量,降低了MDA的含量,上调了SnRK2-like、SLAC1、AtrbohD、CPK1表达,下调ABI2、KAT1表达,激活了保卫细胞中H₂O₂信号,气孔开度变小,从而减少了干旱胁迫下水分的散失。说明LoxD基因参与了番茄抗旱性的调控。     

刺葡萄R2R3-MYB转录因子VdMYB14调控类黄酮合成功能解析

【目的】类黄酮作为葡萄果实中一类重要次生代谢物质,进一步研究其合成调控机制对于提高果实品质具有重要意义。【方法】结合前期研究基础,以会同黑果刺葡萄(Vitis davidii‘1338’)为试材,通过qRT-PCR分析VdMYB14在6个果实不同发育阶段果皮中的表达水平变化。利用MEGA软件构建系统发育树,分析VdMYB14蛋白与其他类黄酮相关MYB蛋白的系统发育关系。利用亚细胞定位技术分析VdMYB14在细胞中的位置。在烟草中异源表达VdMYB14基因,验证其对类黄酮合成的调控功能。【结果】VdMYB14蛋白与苹果花色苷合成负调控因子MdMYB111同源度较高,亚细胞定位发现VdMYB14定位在细胞核中。与野生型相比,VdMYB14转基因烟草株系的花中原花色素含量增加,花色苷积累减少。过表达VdMYB14烟草花中,原花色素合成关键基因NtLAR和NtANR的表达量显著上调,而花色苷合成关键基因NtUFGT的表达量显著下调。【结论】VdMYB14基因能够促进原花色素合成途径关键基因的表达,抑制花色苷合成关键基因的表达,导致类黄酮前体物质倾向于原花色素合成途径,从而抑制花色苷合成,促进原花色素积累。     

番茄果胶裂解酶基因SlPL参与调控裂果机制研究

以裂果率差异极显著的番茄为材料,分析了SlPL(Solyc03g111690)基因的表达差异,进一步利用基因遗传转化对其进行功能验证。结果表明,SlPL在易裂番茄‘NT189’中的表达量显著高于耐裂番茄‘NT91’;在番茄果实中的表达量显著高于根、茎、叶、花等器官,且在果实转色期和红熟期表达量较高;通过灌水处理和ABA处理诱导果实开裂,发现在相同处理时期,易裂果材料果实中SlPL表达量总体显著高于耐裂果材料。通过遗传转化获得SlPL过表达（OEPL）和敲除（pl）的株系,与野生型相比,OEPL更易裂果,且果实硬度显著降低,pl果实硬度升高。OEPL果实中原果胶含量显著低于野生型,水溶性果胶含量显著高于野生型,pl果实中原果胶和总果胶含量显著高于野生型;OEPL果实中果胶裂解酶活性显著高于野生型,pl果实中果胶裂解酶活性显著低于野生型。基因表达分析发现,OEPL果实中细胞壁代谢相关基因SlPG2、SlPME2.1、SlCel2、SlGH9C5和乙烯合成途径相关基因SlACS4、SlACO1的相对表达量显著高于野生型,pl果实中则相反。pl果实中乙烯响应因子SlERF2的相对表达量显著高于...     

异源表达唐菖蒲GhOPR3 提高了拟南芥的抗逆性

 通过RT-PCR 与RACE 技术从唐菖蒲（Gladiolus hybridus）品种‘Rose Supreme’球茎中克 隆茉莉酸生物合成途径中的关键酶——12–氧–植物二烯酸还原酶（12-oxo-phytodienoic acid reductase， OPR）基因的1 489 bp 全长cDNA 序列，quantitative RT-PCR 结果表明，GhOPR3 在唐菖蒲叶、花、根、 匍匐茎、新球茎和籽球中都表达，其中在籽球和匍匐茎中相对表达量较高；0.1 ~ 0.5 mmol · L-1 的茉莉酸 甲酯（Methyl jasmonate，MJ）处理后，提高了GhOPR3 在球茎中的表达量和内源MJ 含量；采用农杆菌 介导侵染拟南芥花粉，进行GhOPR3 基因的过表达分析，过表达拟南芥株系较野生型提高了耐盐性和抗 旱性；提高了机械损伤后相关基因的表达水平和内源MJ 含量。     

短枝型苹果赤霉素受体基因MdGID1a 及其启动子克隆和表达分析

 以短枝型富士苹果‘龙富短枝’（Malus × domestica Borkh.‘Longfu Duanzhi’）枝条为试材, 采用RT-PCR 结合RACE 技术,克隆获得苹果赤霉素受体基因MdGID1a,GenBank 基因数据库的登录号 为JF516247。该基因编码区共1 035 bp,推测其编码345 个氨基酸。氨基酸序列分析显示,其具有HSL 基因家族的保守氨基酸结构域HGG 和GXSXG,与其它植物赤霉素受体基因具有较高的同源性。其启动 子序列包含植物激素和光等响应元件。实时定量qRT-PCR 分析表明,MdGID1a 在短枝型‘龙富短枝’和 普通型‘长富2 号’枝条不同生长阶段、在叶片、枝条、果实、花和叶芽中的表达水平存在明显差异。 苹果赤霉素受体基因MdGID1a 在短枝型苹果枝条伸长过程中具有一定的调控作用。     

柠檬中超表达印度酸橘脱落酸合成基因CrNCED1增强脱水抗性

为了探明印度酸橘(Citrus reshni)脱落酸合成关键基因CrNCED1的功能,分析了CrNCED1的表达特性,并将其在柠檬中超表达获得转基因植株,对转基因植株进行脱水抗性分析。结果表明,CrNCED1在印度酸橘叶片中表达量最高;并且其表达受脱水、低温和ABA诱导,但不受盐诱导,其中ABA诱导上调作用强烈。超表达CrNCED1的转基因柠檬植株ABA含量显著高于野生型,脱水处理后叶片萎蔫程度比野生型轻,其相对失水率、MDA和活性氧含量均显著低于野生型,叶片气孔开度显著小于野生型,表明超表达CrNCED1增强了转基因柠檬的抗脱水能力。     

激素信号调控果树果实花色苷合成机制研究进展

围绕花色苷合成路径相关基因的表达调控,综述了脱落酸、茉莉酸、乙烯、生长素、细胞分裂素、油菜素内酯、赤霉素、独脚金内酯对果树中花色苷积累的调控作用及其内在分子机制,以期为明确植物激素信号转导关键通路,合理应用植物激素类物质调控果实发育提供理论支撑,同时也为不同果树花色苷代谢通路的深入研究提供参考。     

柑橘超量表达CsNBS-LRR通过SA信号途径增强对溃疡病抗性

克隆了柑橘CsNBS-LRR基因,分析该基因在柑橘溃疡病菌（Xcc）、水杨酸、茉莉酸甲酯诱导下的表达特征,通过在晚锦橙中超量表达验证其功能。结果表明,CsNBS-LRR的开放阅读框为3 633 bp,编码1 210个氨基酸。其在感病品种晚锦橙中受Xcc诱导下调表达,而在低感品种四季橘中上调表达;在四季橘中受水杨酸诱导明显上调表达,而晚锦橙中上调幅度较小;两品种CsNBS-LRR受茉莉酸甲酯诱导均不明显;超量表达载体转化晚锦橙获得4个阳性植株;抗性评价表明超量表达CsNBS-LRR明显提升了转基因植株对柑橘溃疡病的相对抗性（病情指数为野生型的75% ~ 88%）;转基因植株中水杨酸含量和水杨酸合成途径中关键基因转录水平明显提高;水杨酸信号途径中的PR基因转录水平也升高。综上所述,CsNBS-LRR是柑橘抗溃疡病的1个抗病基因,它可能通过对水杨酸途径的调控一定程度上增强柑橘对溃疡病抗性。     

番茄生长素响应因子基因SlARF12在果实发育过程中的功能分析

以番茄‘Micro-Tom’为材料,研究了生长素响应因子基因SlARF12 （序列号：HM565127.1）在果实发育过程的生物学功能。实时定量PCR 检测表明,SlARF12在花蕾中表达量逐渐降低,而在授粉后的子房中显著高于去雄后未授粉的子房。利用RNA干扰（RNAi）技术抑制SlARF12表达,对番茄植株营养生长与花的发育没有显著影响,但SlARF12 RNAi果实显著大于野生型与空载转化植株的果实,且开花前去雄未授粉不能形成单性结实的果实。利用半薄切片观察转基因番茄果实早期发育细胞学特性发现,转化植株的果实果皮细胞显著大于对照果实细胞,但是两者果皮细胞层数没有显著差异。基因表达分析发现在SlARF12 RNAi的子房与幼果中细胞分化相关基因CycB1.1和CDKB2.1等的表达水平同对照相比下降,而SlPEC等细胞膨大基因表达量显著高于对照。所以抑制SlARF12可增强果实中细胞膨大相关基因的表达,从而促进果实膨大。以上结果表明,SlARF12可负调控番茄果实膨大但不参与坐果启动调控过程,显示了生长素通过ARF信号精细调控果实发育的各个阶段。     

澳洲青苹苹果虎皮病关键预警基因的筛选

【目的】筛选澳洲青苹苹果果实贮藏过程中虎皮病发生前的关键表达基因，为澳洲青苹苹果虎皮病发生预警研究提供理论依据。【方法】以澳洲青苹苹果果实为试材，于商业采收期采收并于低温（0±0.5℃）下长期贮藏，监测果实色泽和乙烯释放量，同时统计冷库贮藏期及冷藏后货架期的虎皮病发病情况，并采用实时荧光定量PCR技术检测与澳洲青苹苹果虎皮病发生相关基因的表达水平。【结果】澳洲青苹苹果低温贮藏50 d时，果实在冷库中未发病，置于货架期2 d时，果实出现轻微的虎皮病症状；低温贮藏70 d时，果实在冷库中开始发病。基于前人研究及转录组数据，鉴定到MdACO、MdAFS、MdCAT1、MdCAT2、MdPAL1、MdPAL2、MdC3H、MdPPO、MdPOD1、MdPOD2与澳洲青苹苹果虎皮病相关；通过实时荧光定量PCR技术进一步分析，确定MdAFS、MdC3H和MdCAT1的表达量在虎皮病发生前10 d，即贮藏第40天急剧上升，随后呈现下降的趋势，可作为虎皮病发生的预警基因。【结论】MdAFS、MdC3H和MdCAT1可作为澳洲青苹苹果贮藏期虎皮病发生的关键预警基因。     

梨CRK家族基因及其腐烂病菌侵染响应成员的鉴定

在植物响应逆境过程中,半胱氨酸富集类受体激酶（Cysteine-rich receptor like kinase,CRK）起重要的调控作用。本研究中以结构域Stress-antifung（Pfam：PF01657）和Pkinase（Pfam：PF00069）的保守序列为种子序列,在全基因组范围鉴定了梨（Pryus spp.）CRK家族成员。此外,对其蛋白理化性质、进化特征、基因在染色体上的位置、顺式作用元件（cis-acting regulatory element,cis-element）和表达模式进行了分析。共获得32个CRK家族成员,其氨基酸数、分子量和等电点分别介于440 ~ 1 217、48.90 ~ 137.02 kD和5.31 ~ 8.59,主要位于质膜。根据进化分析,将来自梨、拟南芥、苹果、番茄和水稻的156个CRK分为6个亚组,梨CRK主要分布于亚组Ⅳ,Ⅴ和Ⅵ。梨CRK中存在5个串联重复的基因簇,共包含了20个成员。此外,该基因家族所有成员的启动子区域都存在多个响应激素和逆境信号的cis-element。接种腐烂病菌Valsa pyri（Vp）后,杜梨（Pyrus betulifolia,抗病）和‘早酥’梨（Pyrus bretschneideri,感病）中分别发现8个和10个CRK发生了差异表达,6个基因在两种资源中都发生了差异表达。差异基因中,Pbr001477.1和Pbr000205.4在抗、感病资源中都显著上调,而其他基因的表达量在两种资源中呈现不同的变化趋势。     

茉莉酸甲酯抑制贮藏葡萄扩展青霉菌试验及机理研究

研究了茉莉酸甲酯对(1±1)℃贮藏期间巨峰葡萄青霉病的抑制作用,同时分析了其对葡萄果实抗病相关酶活性以及主要致病菌扩展青霉(Penicillium expansum)离体生长的影响。结果表明,茉莉酸甲酯可显著降低贮藏期间葡萄青霉病的发病率,并可显著诱导几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶、苯丙氨酸解氨酶和过氧化物酶活性的升高;在离体条件下也明显抑制扩展青霉的孢子萌发率和芽管长度。因此,茉莉酸甲酯可间接诱导葡萄果实抗病性,并直接抑制病原菌生长,从而显著抑制果实采后腐烂的发生,在葡萄采后保鲜中具有较好的应用前景。     

苹果磷酸果糖激酶基因MdPFPβ调控果实可溶性糖积累的功能

为阐明苹果（Malus×domestica Borkh.）磷酸果糖激酶基因MdPFPβ(Pyrophosphate-fructose 6-phosphate 1-phosphotransferase subunit beta,基因序列号MD09G1112800)的生物学功能,首先分析了基因启动子和全长序列信息,该基因包含全长为483 bp完整的开放阅读框,编码161个氨基酸。利用PlantCare数据库进行基因启动子顺式作用元件分析发现,MdPFPβ启动子序列中含有与脱落酸（abscisicacid,ABA）、低温及干旱信号相关的调控元件。荧光定量PCR分析发现,MdPFPβ在苹果叶片和成熟果实中表达量较高,并且受外源ABA的诱导表达。在外施ABA的条件下,MdPFPβ过量表达的苹果愈伤组织中可溶性糖含量明显上升。此外,MdPFPβ转基因番茄植株的光合性能增强,MdPFPβ可能通过调控糖代谢酶的活性最终影响果实中的可溶性糖含量。     

茉莉酸甲酯诱导葡萄悬浮细胞防卫反应机制的研究

为明确茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,Me JA)诱导葡萄果实抗病反应的机制,以‘巨峰’葡萄悬浮细胞为试材,将其继代培养一次后分别在含10μmol·L-1 Me JA的B5培养基和含100 nmol·L-1隐地蛋白的B5培养基中(模拟病原菌接种)振荡培养15 d,每3 d测定1次细胞质量及抗病相关指标。结果显示:单一Me JA处理未激活葡萄悬浮细胞内的防卫反应;而单一隐地蛋白处理则可立即显著诱导葡萄悬浮细胞内源H2O2迸发,提升vv NPR1.1、PR1和PR2表达水平和植保素含量;经Me JA处理的葡萄悬浮细胞在添加隐地蛋白后,其细胞内出现较单一隐地蛋白处理更为显著的H2O2迸发、PR基因表达和植保素合成现象,说明经Me JA处理的悬浮细胞只在病原激发子胁迫时才表达出较强的系统抗性。因此,Me JA诱导的葡萄悬浮细胞抗病反应可归因于Priming(植物敏化过程或防御准备过程)机制。此外,经Me JA诱导的Priming反应对葡萄悬浮细胞生长无显著影响,暗示其未抑制葡萄细胞生长和胞内物质积累。     

热水处理对草莓果实的保鲜效应及其与乙烯相关基因表达的关系

 以七八成熟‘丰香’草莓果实为试材, 研究了45 ℃热水处理15 min对草莓果实的保鲜效应,并采用RT2PCR技术探讨了热水处理对草莓果实贮藏过程中乙烯合成相关基因及乙烯受体基因表达的影响。结果表明, 热水处理显著抑制贮藏期间果实花青素积累, 减小果实失重率、腐烂指数, 缓解可溶性固形物和可滴定酸含量下降, 提高可溶性蛋白质含量, 促进维生素C含量下降, 同时抑制果实呼吸速率和乙烯释放速率, 明显延长果实贮藏寿命。RT-PCR 分析结果表明, 热水处理明显抑制贮藏期间草莓果实ACS、ACO、乙烯受体( ETR1和ERS1) 基因的表达, 但对EIN1基因表达没有明显影响。以上结果说明, 热水处理延缓草莓果实衰老可能与其抑制乙烯合成及作用有关。