黑曲霉葡萄糖苷酶的分离纯化及酶学性质研究

[目的]分离能水解獐牙菜苦苷的胞外β-葡萄糖苷酶,并研究其分子量、最适催化温度、最适pH、稳定性及催化特征。[方法]黑曲霉液体发酵3d,收集培养液,培养液经盐析、柱分离得到1个β-葡萄糖苷酶。[结果]该β-葡萄糖苷酶的分子量为86kD,最适pH为5.0～6.0,最适反应温度为50～60℃,在60℃以下时酶稳定;Ca2＋、Zn2＋、Fe3＋和Cu2＋能抑制β-葡萄糖苷酶的活性,而Mg2＋和Mn2＋能够激活β-葡萄糖苷酶的活性;纤维二糖是该β-葡萄糖苷酶的最适催化底物。[结论]该酶和大多数真菌来源黑曲霉相似,对獐牙菜苦苷的亲和性弱,对ρ-NPG的亲和力强。     

枯草芽孢杆菌WHNB 02植酸酶的酶学性质研究

从118份样品中分离到1株产植酸酶的枯草芽抱杆菌（Bacillus subtilis WHNB02）,其发酵液经乙醇沉淀、硫酸铵分级沉淀及Sephadex G-100柱层析等步骤后分离纯化了该酶,纯化倍数约为31．5倍,回收率为13．0％。该酶为单体酶,SDS—PAGE测得的分子量约为43KD,以植酸钠为底物的Km值为0．5mmol／L,酶反应的最适温度为60℃,80℃作用10min酶活保存61％,最适pH为7．0,在pH6．0—10．0范围内稳定,酶活性及稳定性都需Ca^2＋存在。EDTA,Mn^2＋,Ba^2＋（5mmol／L）对酶活具有很大的抑制作用。     

土壤拮抗链霉菌R_(15)β-1,3-葡聚糖酶的纯化与部分特性分析

拈抗链霉菌（Steptomyces spp．）R15菌株是从大白菜植株根际土壤分离得到的，其代谢产生的抗菌物质对多种植物病原真菌有很强的抑制作用。采用ABP选择性培养基诱导培养法，获得4株（R8，R15，R31和AS）产β-1，3-葡聚糖酶菌株。其中链霉菌R15菌株在ABP平板上培养7d后，透明圈最大（〉12mm），澄清度最高。从R15菌株提取酶液，经10％～75％的硫酸铵沉淀盐析、羟基磷灰石柱层析及DEAE-52柱层析得到纯化，纯化倍数为13．98，回收率达4．031％。经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测得该酶的分子量为41.3kDa。酶特性研究结果表明。该酶作用的最适温度为55℃，最适pH为5．0，低于55℃、pH7．5以下酶较稳定。Fe^3＋、K^＋、Cu^2＋、Hg^2＋对酶有抑制作用，而Ca^2＋、Fe^2＋、Ba^2＋、Mn^2＋、Al^3＋及Zn^2＋对酶有激活作用。     

鸭肝过氧化氢酶的分离纯化及部分性质研究

新鲜鸭肝经匀浆、磷酸缓冲液抽提、硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose离子交换层析、Sephacryl S-200凝胶过滤层析,得到鸭肝过氧化氢酶电泳纯制品,回收率为18．23％,比活达4780．38U／mg,纯化倍数为66．15。最适温度为40℃,最适pH为7．0,该酶在20～40℃,pH5～8内稳定．经凝胶过滤和SDS-PAGE测得该酶的全分子量为250KD,亚基分子量为62．5KD。     

β-葡萄糖苷酶纯化及酶学性质研究

研究了来源于曲霉No.5.1的β-葡萄糖苷酶的纯化和酶学性质。粗酶液经硫酸铵沉淀、DEAE-chitopearl和Sephadex G-100柱层析得到纯β-葡萄糖苷酶,SDS-PAGE凝胶电泳显示一条带,测得分子量为67.5 kD。该酶最适反应pH6.0,最适反应温度为60℃,在80℃以下、pH3.0~9.0酶活力相对稳定。K 、Na 、Mg2 和Zn2 对酶有激活作用,而Ag 和Fe2 对酶具有明显的抑制作用。该酶对纤维二糖和水杨素的水解能力最强,水解水杨素的Km值为3.09 mmol/L。     

鸭肝碱性磷酸酶的分离纯化及其部分性质研究

经过匀浆、正丁醇除脂、硫酸铵分级分离、DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换柱层析、Sephacryl S-200凝胶过滤等步骤,从鸭肝中分离纯化出电泳纯的碱性磷酸酶,该酶纯化倍数达58．3倍,比活为337．4U／mg．经SDSPAGE和凝胶过滤测得该酶的全分子量为121．0kD,亚基分子量为60．5kD．以磷酸苯二钠为底物,测得该酶的最适pH为9．0,最适温度为40℃．Na^＋、K^＋、Li^＋等一价离子对该酶活性基本无影响,Mg^2＋、Mn^2＋对该酶活性有激活作用,Cd^2＋对该酶活性有抑制作用．米氏常数Km为1．28mmol／L．     

绿色木霉内切纤维素酶的分离纯化及酶学性质的研究

绿色木霉AS3.5455经固体发酵,提取胞外纤维素酶,经硫酸铵分级沉淀、透析、DEAE Cellulose-52离子交换层析、SephadexG-150凝胶柱层析等纯化出单一组分的内切β-葡聚糖苷酶,经SDS-PAGE电泳分析,该内切酶的相对分子量约为58.7KD,内切β-葡聚糖酶的最适作用温度为55℃,最适反应pH为5.5。     

茶树菇β-葡萄糖苷酶的纯化及应用研究

从茶树菇中分离纯化一种β-葡萄糖苷酶,并对其进行酶学性质的研究。该β-葡萄糖苷酶的分子量为26 ku,最适pH值为6.0,最适温度为50℃。乙醇浸提喜树碱后的喜树果渣经β-葡萄糖苷酶和纤维素酶协同水解后,还原糖和葡萄糖的生成量分别为0.90、0.69 mg/m L。研究表明,茶树菇β-葡萄糖苷酶可应用于中草药提取残渣的生物水解领域。     

干酪乳杆菌蛋白酶纯化与动力学性质

干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)6033经增菌培养、超声波破碎、冷冻离心后获得粗酶液。粗酶液经硫酸铵分级沉淀后,分别进行阴离子交换层析、疏水层析、分子筛层析,最终获得1种纯蛋白酶。该酶分子量为61 2kD,可被苯甲基磺酰氟(PMSF)和乙二胺四乙酸(EDTA)强烈抑制,Co2 和Ca2 能增强该酶活力,Fe3 、Zn2 和Cu2 对其活性则有抑制作用。该酶在37℃时,最大酶活力出现在pH值7 0附近,pH4 0时相对酶活力下降到39 0%,而pH9 0时相对酶活力仅维持在8 0%左右。pH7 0时该酶的最适温度为37℃左右,20℃时相对酶活力下降到54 0%,而60℃时相对酶活力仅为34 0%。以酪蛋白作为底物时测得该酶Km值为1 5mg/ml、Vmax为32 0。     

鸭肝蛋白酶的分离纯化及其部分性质研究

经Tris-HCl缓冲液抽提、硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析、Sephacryl S-200凝胶过滤层析,得到鸭肝蛋白酶电泳纯制品．纯化倍数为650.16倍,回收率为19.23%．经SDS-PAGE和凝胶过滤测得该酶的分子量为35kD．该酶在pH6.0～11.0,温度低于25℃稳定,当温度上升到55℃时活性迅速下降．该酶在pH10和60℃时达到最高活性．进一步研究得知：Cu^2＋离子对该酶有明显促进作用,而Mn^2＋却使酶几乎失活．以酪蛋白为底物,在pH10.0、37℃时测得米氏常数Km值为1.33%．     

重组酵母E22植酸酶的分离纯化及酶学性质研究

对用黑曲霉植酸酶基因构建的一株重组酵母E22所产植酸酶进行分离纯化并研究各种酶学性质,表明E22植酸酶分别在pH2．5～3．0和pH5．5左右具有2个最适pH峰,有活性pH范围为pH2．0～7．5,pH2．5时的最适温度为45℃左右、对植酸钠的Km值为0．0002mol／L、比活为493328．7u／mg、受Fe^2＋抑制,pH5．5时的最适温度为55℃、对植酸钠的Km值为0．0001mol／L、比活为624376．2u／mg、受Ca^2＋和Zn^2＋抑制,85℃热处理10min酶活性保留70％,pH2．5下用胃蛋白酶、pH5．5下用胰蛋白酶处理6h后酶活均保留90％左右,分子量为61．7KD,等电点在4．5到5．0之间．     

鸭肝过氧化氢酶的分离纯化及部分性质研究

新鲜鸭肝经匀浆、磷酸缓冲液抽提、硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose离子交换层析、Sephacryl S-200凝胶过滤层析,得到鸭肝过氧化氢酶电泳纯制品,回收率为18.23%,比活达4 780.38 U/mg,纯化倍数为66.15.最适温度为40℃,最适pH为7.0,该酶在20～40℃,pH 5～8内稳定.经凝胶过滤和SDS-PAGE测得该酶的全分子量为250 KD,亚基分子量为62.5 KD.     

黑曲霉木聚糖酶XynⅢ的纯化与酶学性质

通过超滤和DEAE-Sepharose CL-6B离子交换层析等方法,将黑曲霉J506发酵所产的木聚糖酶XynⅢ纯化至电泳级均一纯,分子量经SDS-PAGE测定为27.9 kDa.酶学特性研究表明,XynⅢ能够水解桦木木聚糖,燕麦木聚糖,地衣多糖和大麦β-葡聚糖,最适温度和最适pH值分别为50℃和4.6,具有较宽的pH稳定性,并且在50℃以下较稳定.Ca2 ,Co2 ,Cu2 ,Mn2 ,Pb2 ,K ,Zn2 and EDTA对酶有不同程度的抑制作用,Fe2 和Mg2 对酶有轻微的激活作用.     

β 淀粉酶的分离纯化及酶学性质研究

以"渝薯17"为实验材料,从淀粉生产废水中分离纯化β-淀粉酶.去皮、1∶10(m/V)匀浆抽提,经过乙醇分级沉淀、DEAE-Sepharose离子交换层析和Superdex-200凝胶过滤层析获得电泳纯β-淀粉酶并对其酶学性质进行了研究.结果表明:该酶的比活力高达333.15U/mg,显著高于市售枯草杆菌来源酶活(50U/mg);纯化倍数9.93倍,回收率66.60%;亚基分子量约为55.12kD,全酶分子量约为223.54kD;最适温度50℃,最适pH值6.2;50℃以下,pH值6~8具较好的稳定性.在最适条件下以可溶性淀粉为底物,测得Km为0.001 36g/mL,V_(max)为0.112mg/mL·min;Mn~(2+),Pb~(2+),Li~+,Zn~(2+),K~+,Cu~(2+),草酸,SDS对该酶有不同程度的抑制作用,Co~(2+)有激活作用,有机物作用不明显.     

黄孢原毛平革菌过氧化物酶的分离、纯化和酶学特性研究

从木质素降解菌Phanerochaete chrysosporium中纯化出两种木质素降解酶：木质素过氧化物酶（LiP）和锰依赖过氧化物酶（MnP）。经测定LiP和MnP的分子量分别为37kD和40kD,最适作用温度均是37屯;保温2h,LiP的半失活温度为40℃,MnP为45℃;LiP最适作用pH2．8,稳定pH2．2—5．2;MnP最适作用pH4．6,稳定pH4．0—7．0。Fe^2＋LiP和MnP均表现出促进作用,Na^＋、K^＋、Ca^2＋、Mg^2＋、Zn^2＋、Fe^3＋、Ag^＋、CO^2＋、NH4^＋对LiP有促进作用,对MnP则表现出抑制作用。与此相反,Mn^2＋对MnP酶活的高效促进作用,对LiP表现出了轻度的抑制作用,这也体现出了MnP对Mn^2＋的依赖性。Cu^2＋对LiP活性无影响,而对MnP有强烈的抑制作用。Fe^3＋两者活性的抑制都达到了90％。     

2株黑曲霉植酸酶的分离纯化及其酶学性质研究

对黑曲霉A3214及其诱变株N14所产植酸酶进行分离纯化并研究各种酶学性质,表明A3214植酸酶和N14植酸酶的最适pH均为2．5,最适温度均为50℃,60℃保温10min后酶活保留均在80％左右,用胃蛋白酶处理后酶活均保留80％左右,分子量均为47．4KD,等电点均在4．5到5．0之间,K^＋,Na^＋,Ca^2＋,Mg^2＋．Fe^2＋在高浓度时对A3214植酸酶和N14植酸酶都有抑制作用,而Zn^2＋,Cu^2＋,Mn^2＋却几乎没有抑制作用,A3214植酸酶对植酸钠的Km值为0．0005mol／L,N14植酸酶对植酸钠的Km值为0．0004mol／L,A3214植酸酶的比活为135777．5u／mg,N14植酸酶的比活为148447．5u／mg。     

嗜碱菌AL-103果胶酶酶学性质的研究

研究了嗜碱菌AL-103果胶酶酶学性质。经硫酸铵盐析和缓冲液透析,获得粗酶,该酶最适反应温度60℃,最适作用pH6,40℃保温10min酶活基本不损失,在pH7．0～10．5范围内酶蛋白稳定：Li^＋、Ca^2＋和Mg^2＋对酶有激活作用,AL^3＋有抑制作用,Co^2＋、Pb^2＋、Fe^3＋、Mn^2＋和Hg^2＋有强烈抑制作用。     

木聚糖酶的分离纯化及性质研究

采用硫酸铵盐析、Phenyl—Sepharose CL-4B疏水层析、Sephadex G-50凝胶层析和DEAE- Sepharose fast flow阴离子交换层析等分离技术,从宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)固态培养物浸出液中分离出一种SDS—PAGE电泳纯木聚糖酶组分,其最终的收率为19．0％,纯化倍数为26．9。该木聚糖酶的相对分子质量20．7 ku,等电点pl5．0,含糖量0．42％;该酶的最适作用温度为50 C,在50 C以下较稳定;最适作用pH 5．0,在pH 5．5～9．0时较稳定;Ca2+对该酶活性有一定的激活作用,而Pb2+,Sn2+,Cu2+,Al3+则有较强的抑制作用。以桦木木聚糖为底物,测得该酶的Km值和Vmax分别为3．5 mg／mL和5000 μmol／(min·mg)。     

黑曲霉N25植酸酶的分离纯化及酶学性质研究

黑曲霉N2 5 (AspergillusNiger)菌株所产胞外植酸酶 ,经硫酸铵分级沉淀 ,纯化测得此植酸酶分子量为 6 9 15KD ;最适 pH 4 6 ;最适温度为 6 0℃。聚乙二醇 10 0 0 0、Fe2 +、低磷对酶有激活作用 ,而Ca2 +,Mg2 +,Mn2 +,EDTA对酶有抑制作用     

柿果实乙醇脱氢酶酶学特性研究

以磨盘柿（Diospyroskaki Thunb．）果皮为试材,提取乙醇脱氢酶（Alcohol Dehydrogenase）并进行纯化。经过30％～70％硫酸铵沉淀分离、SephadexG-25脱盐柱脱盐、DEAESepharose Fast Flow离子交换层析纯化后,研究温度、pH、金属离子、底物对乙醇脱氢酶活性的影响。结果表明,纯化后乙醇脱氢酶纯化倍数为41．80倍,活性回收率为44．73％。将乙醇脱氢酶酶液分别置于20、30、40、45、50、55和60℃温育后测定,其最适反应温度为45℃;在pH5．0、7．0、8．0、9．0、10．0和11．0下乙醇脱氢酶的最适PH为10．0;在甲醇、乙醇、丙醇、丁醇和戊醇为反应底物时,最适底物为丁醇;金属离子中,K^＋0和Na^＋对活性略有增强的作用,二价金属离子除Mg2＋几乎没有影响之外,Zn2＋、Mn2＋和Ca^2＋对酶活性有一定的抑制作用,Cu^2＋和Fe^3＋则完全抑制了酶的活性。在25℃,pH10．0的条件下ADH氧化乙醇的米氏动力学参数Km值为8．33mmol／L,最大反应速度Vmax为0．021μmol／min。乙醇脱氢酶的活性受温度、pH、金属离子、底物的影响较大,并且只有在合适的条件下,酶活性才能达到最大值。