柞蚕微粒子病研究现状及展望

结合沈阳农业大学柞蚕研究所在柞蚕微粒子病检测方面所做的工作,综述了柞蚕微粒子病的病原、病理、检测技术及防治等方面的研究成果,以期为柞蚕微粒子病的有效检测及防治提供参考。     

柞蚕微粒子病镜检方法介绍

为提高柞蚕制种中微粒子病的检查效率和镜检人员的技术水平,介绍了显微镜的使用方法、镜检室人员组成分工及柞蚕微粒子病的检查方法,从源头上严把蚕种质量关,彻底消灭柞蚕微粒子病源,确保蚕农用上优良、放心的柞蚕种,从而实现增产、增收.     

河南柞蚕微粒子病的综合防治

柞蚕微粒子病是一种危害严重的传染性蚕病,长期以来,一直困扰着河南省的柞蚕生产和种茧繁育工作,20世纪90年代柞蚕微粒子病在河南省迅速传播。分析了河南省在柞蚕微粒子病防治方面存在的问题:镜检设备简陋,跟不上生产发展的需要;熟练的镜检人员不足,柞蚕微粒子病控制不力;预知调查难以贯彻执行,柞蚕微粒子病防治难度加大;制种时重目选轻镜选,重数量轻质量等。制种期目选、镜选和养蚕期技术操作充分结合起来,采取了严格淘汰柞蚕微粒子带毒率超标的种茧、严格目选蚕蛾、严格显微镜检种、提高放养技术等贯穿柞蚕整个世代的综合防治措施,使柞蚕微粒子带毒率逐年下降,原种种茧柞蚕微粒子带毒率基本控制在2%以内,为河南省柞蚕生产稳产高产打下了基础。     

柞蚕抗病机制及抗病物质的研究——Ⅰ.柞蚕肠道致病菌等诱导柞蚕蛹产生抗菌物质的比较研究

本文报道了柞蚕肠道致病菌、灭活的柞蚕病毒和微粒子孢子以及柞蚕自身物质诱导柞蚕蛹产生抗菌物质的试验.并与大肠杆菌(Escherichia coli K-12D31)的诱导活性进行了比较;应用酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳对上述诱导源诱导产生的抗菌物质进行了鉴定和比较,初步表明:1.柞蚕致病菌、灭活的柞蚕病毒和微粒子孢子以及柞蚕自身物质均能诱导柞蚕滞育蛹产生抗菌物质,但其活性差异显著,2.上述诱导源诱导柞蚕蛹产生抗菌物质不同组份的相对量和活性在体内持续的时间有明显差异,3.同一诱导源诱导柞蚕蛹产生抗菌物质的不同组份不是同时产生的.也不是同时消失的.     

柞蚕微粒子病发生原因及防治

本文针对四川省通江县柞蚕种场微粒子病发生现状,阐述了微粒子病的发生原因,介绍了防控微粒子病的方法。     

近年柞蚕微粒子病蔓延的原因及其防治措施

蚕种生产场家片面追求利润,盲目扩大生产,检疫人员粗心大意,人为地助长了柞蚕微粒子病的蔓延。微粒子病防治要从柞蚕病虫害防治入手,做好饰腹寄蝇的化学防治和放养技术防治工作,消灭寄主,保护天敌;要认真做好微粒子病镜检工作,加强责任心和技术培训,规范操作技术及过程;严格蚕卵及蚕期消毒防病工作,贯彻放养操作细则,确保蚕种生产安全。     

柞蚕微粒子虫在母蛾不同腹节分布的研究

研究柞蚕微粒子虫在母蛾不同部位的分布,对提高柞蚕制种过程中镜检准确性,确保柞蚕种质量及柞蚕生产安全性具有重要意义。本研究共检测了30只患病母蛾不同腹节的微粒子孢子数量分布情况,发现不同感染程度的母蛾均是第一或第二腹节的微粒子孢子数量最多,说明病原位置主要密集在第一第二腹节;重度感染病蛾,各腹节均可见较多的微粒子孢子,而中度感染和轻微感染母蛾其它腹节微孢子数量相对较少。在柞蚕制种镜检时,点片取样位置不同会影响镜检结果。     

柞蚕微粒子病发生原因及防治意见

柞蚕微粒子病是一种由微孢子原虫寄生而引起的慢性传染病,它是柞蚕生产的毁灭性病害之一.50年代初期,因微粒子病传播几乎给河南柞蚕生产造成灭绝性危害,各级政府和业务部门全力以赴,采取紧急防治措施,数年后使微粒子病得到有效控制,柞蚕生产得以稳定发展.多年来由于各地比较重视,柞蚕微粒子病在局部虽有发生,但没有造成大的危害,全省生产比较平稳.但是,90年代中期由于思想的麻痹和质检工作的放松,微粒子病又在河南省蚕区发生,养蚕发病率达到10%左右,严重的达到30%,特别是种茧发病率高.这次发病导致全省出现严重的缺种局面,严重影响河南柞蚕生产的发展.为有效制止微粒子病的发生和蔓延,从1997年年底开始全省上下制定了实施方案,提出了防治意见和措施.通过5年的努力,微粒子病防治工作取得显著成效,种茧微粒子病发生率逐年降低(2002年为4.22%、2003年为2.32%和2004年为1.29%),种茧合格率也逐年得到提高(2002年为80.39%、2003年为93.05%和2004年为95.74%),使河南柞蚕生产摆脱了微粒子病的困扰,步入了安全稳定的生产阶段.现将河南柞蚕微粒子病的发病原因和防治措施总结如下.     

部分一化性柞蚕品种对微粒子病食下感染的抵抗性研究

<正>不同类型的柞蚕,对核型多角体病存在着不同的抵抗性[1],而对微粒子病的抵抗性如何,至今未见报导。近几年,柞蚕微粒子病的危害日趋严重,查明不同类型柞蚕对微粒子病的抗性差异,对养蚕防病和抗病育种等将会起到一定的指导作用。2002～2003年,我们用一化性柞蚕作材料,测定了部分蚕品种(生产种)和不同发育阶段的柞蚕对微粒子病的抵抗性。现将结果初报如下： 1 试验材料和方法 1．1 供试品种 三三、三九、一○一、河四一、早一、六号,均由本场柞蚕育种室品保组提供。 1．2 供试病原 取新鲜的柞蚕微粒子病蛹,加入适量灭菌水,通过研磨、过滤和离心提纯,将提纯的微孢子稀释、查数,配成一定浓度,保存于冰箱中备用。 1．3 测定方法 取不同类型的柞蚕作材料,在各龄起蚕时,将目的病液用微量进样器进行经口(蚁蚕     

应用PCR技术检测柞蚕微孢子虫

采用斑迹抽提法提取柞蚕微孢子虫(Nosema pernyi)基因组DNA,基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳图谱中有大小约15kb的清晰、完整条带。选用已报道的微粒子属16S rRNA基因的保守序列设计P1/P2和N1/N22对引物,对柞蚕微孢子虫基因组DNA进行PCR扩增,结果2对引物分别扩增出1条大小不同的特异谱条带,其中用引物N1/N2扩增可检测出0.47ng的DNA模板。应用同样的PCR引物、体系和反应条件,可有效扩增出受感染柞蚕幼虫、成虫中的微孢子虫基因组DNA条带。该项检测技术有望应用于柞蚕微粒子病的早期诊断。     

柞蚕微孢子虫3种孢壁蛋白的提取与鉴定

在微孢子虫侵染宿主的过程中,孢壁蛋白扮演着重要的角色。分别采用沸水浴法、SDS法从柞蚕微孢子虫(Nosema per-nyi,Np)孢子中提取孢壁蛋白以及利用发芽后的孢子壳提取孢壁蛋白,对提取的孢壁蛋白进行SDS-PAGE分析和质谱鉴定。结果显示,将发芽后的孢子壳以沸水浴法提取孢壁蛋白最为有效,但操作复杂,部分孢壁蛋白损失严重。初步鉴定从发芽后的孢子壳中提取的编号为P35、P32和P29的3种蛋白属于柞蚕微孢子虫孢壁蛋白,蛋白分子质量分别为35、32、29 kD,其中孢壁蛋白P32的含量最丰富,P35和P29的含量相对较低。根据相应肽指纹图谱预测孢壁蛋白P32的一级结构类似核孔蛋白,可能与孢壁的选择透过性有关,而P35与VASA2n蛋白的一级结构类似,因此有可能与柞蚕微孢子虫的繁殖有关。     

家蚕微孢子虫PCR检测的研究

根据家蚕微孢子虫（Nosemebombycis,N．b）孢子的DNA序列，设计合成一对引物，对家蚕微孢子虫孢子及其近缘种孢子的DNA进行PCR检测。结果表明只有家蚕微孢子虫孢子DNA获得特异性扩增区带，大小为317bp，可以区别于Nosemasp.MG1和MG2、柞蚕微孢子虫、Vairimorphanecatrix及Pleistophoraanguillarum等。对N.b孢子DNA检测灵敏度达1ng水平。     

柞蚕微孢子虫侵染后柞蚕5龄雌雄个体血淋巴蛋白质含量和组成的变化及差异分析

以柞蚕5龄幼虫为材料添食柞蚕微孢子虫(Nosema pernyi,Np),通过测定与分析不同性别5龄幼虫血淋巴蛋白质含量和组成变化的差异,为探究柞蚕对柞蚕微孢子虫感染的免疫应答提供依据。感染柞蚕微孢子虫的不同性别柞蚕5龄幼虫的血淋巴蛋白质含量随蚕体发育进程出现不同的变化:雌性个体与雄性个体分别在添食Np后24 h与48 h,血淋巴蛋白质含量极显著增加(P<0.01),且持续至添食后96 h,其中雌性个体的血淋巴蛋白质含量又极显著高于雄性个体(P<0.01);在添食Np后120 h,雌、雄个体的血淋巴蛋白质含量与对照组无显著性差异(P>0.05)。SDS-PAGE分析表明,添食Np后的柞蚕5龄幼虫血淋巴蛋白质组成与对照组基本一致,均显示出20条分子质量在20.1～97.2 kD的蛋白条带,其中雌、雄个体在添食后96 h,大小约44 kD的蛋白条带明显加深,大小约28 kD的蛋白条带雌性个体在添食后144 h、雄性个体在添食后120 h明显加深,且雄性个体在添食后120～168 h大小约42 kD的蛋白条带明显加深,但在添食后192 h与对照组无明显差异。研究结果说明Np侵染后,柞蚕5龄幼虫血淋巴蛋白质的含量及组成均产生了一定的变化,并且雌雄个体间的变化存在差异。     

柞蚕微孢子虫胶体金免疫层析检测法

利用柞蚕微孢子虫孢子液直接免疫家兔获得柞蚕微孢子虫多克隆抗体后,分别采用双抗夹心法和竞争法制作胶体金免疫层析试纸条,建立能简便、快捷、准确诊断柞蚕微粒子病的柞蚕微孢子虫胶体金免疫层析检测法。双抗夹心法和竞争法分别是将柞蚕微孢子虫多克隆抗体与25 nm和17 nm的胶体金颗粒结合并固定在金标垫上,然后均将羊抗兔二抗包被在硝酸纤维素膜上作为质控点(C),但是2种方法制作的胶体金免疫层析试纸条的反应模式不同:前者是以柞蚕微孢子虫多克隆抗体作为检测点(T),而后者以柞蚕微孢子虫孢壁蛋白作为检测点(T)。2种方法制作的胶体金免疫层析试纸条的检测时间均为10 min,检测灵敏度为0.8×107个/mL,与柞蚕血淋巴无交叉反应,特异性强,操作简单,其中,以双抗夹心法制作的试纸条显色更清晰,结果更可靠,更具实用价值。     

中国广东家蚕微粒子孢子在Antheraea eucalypti细胞系的感染增殖

将中国广东的Ｎｏｓｅｍａ ｂｏｍｂｙｃｉｓ ＣＧＳ,用０２ｍｏｌ／ＬＫＯＨ 处理后,接种感染Ａ．ｅｕｃａｌｙｐｔｉ 细胞系。孢子的发芽率达８７％ ,在Ａ．ｅｕｃａｌｙｐｔｉ 细胞初期感染率为２７ ％ 。发育各阶段具２ 核,可观察到短极丝孢子和二次感染体形成,孢子芽母细胞按二分裂形成２ 个双核的孢子芽,具典型 Ｎｏｓｅｍａ 属特征。Ｎｏｓｅｍａｂｏｍｂｙｃｉｓ ＣＧＳ 生物学特性、血清学类型与日本Ｎｏｓｅｍａ ｂｏｍｂｙｃｉｓ ＮＩＳ００１ 大致相同,但孢子大小、裂殖体的形态、在Ａ．ｅｕｃａｌｙｐｔｉ 细胞寄生的细胞感染率、每个细胞的产孢数,２ 种微孢子虫却有差异。     

破碎法提取家蚕微孢子虫孢子核酸的PCR检测灵敏度试验

蚕微粒子病检测技术是该病防治中的一项重要技术,本文在通过破碎法提高模板核酸获取量的基础上,对纯化家蚕微粒子虫孢子的PCR检测灵敏度进行了测试。提取核酸-模板稀释测试12对引物的灵敏度中有4对引物达到0．05粒（10^2粒/mL）、4对引物5粒（10^4粒/mL）、1对引物50粒（10^5粒/mL）、2对引物500粒（1...     

家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)孢壁蛋白提取方法的优化研究

分别用SDS法、煮沸法、碱溶法和Brosson法,提取家蚕微孢子虫孢壁蛋白,并对孢壁蛋白及处理后的孢子形态进行比较研究。结果表明,不同方法处理后的孢子形态均保持完整,SDS处理后孢子为短杆状且明显变得粗壮,煮沸处理后孢子变小呈梭形,其他方法处理的孢子均有膨胀现象。SDS-PAGE检测显示,SDS法提取的孢壁蛋白出现3条明显的主带,煮沸法提取的孢壁蛋白出现5条明显的主带,0.1 mol/L KOH提取的孢壁蛋白出现2条主带;而Brosson法提取的孢壁蛋白呈现出20~30条带,体现了家蚕微孢子虫孢壁蛋白组成的复杂性,并适合于孢壁蛋白质组学的研究。     

粉纹夜蛾培养细胞对家蚕微孢子虫的吞噬及与孢壁蛋白的关系

解明家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,Nb)入侵宿主细胞的相关因素,有助于深入研究Nb对家蚕的侵染机制。利用激光共聚焦显微镜观察Nb孢子接种粉纹夜蛾(Trichoplusiani,Tn)培养细胞48h后孢子的分布状态和培养细胞的生长情况,并对接种Nb孢子后的Tn培养细胞培养物总蛋白进行SDS-PAGE分析,证实经0.2mol/LKOH预处理的Nb孢子可以被Tn培养细胞所吞噬。对Nb孢子孢壁蛋白的SDS-PAGE分析显示,Nb孢子经KOH预处理后,大小为80kD和12kD的孢壁蛋白带缺失或明显减弱,30kD的孢壁蛋白带丰度降低。推测KOH预处理使Nb孢子部分孢壁蛋白被分解(部分或完全)或使蛋白结构发生变化,由此影响了Nb孢子与Tn培养细胞的相互作用关系,有利于Tn培养细胞对Nb孢子的吞噬。     

家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)向家蚕BmN细胞接种与增殖的观察

利用DIPA活体荧光染色的方法对家蚕微孢子虫 (Nosemabombycis)的体外发芽、侵染、增殖的过程进行了观察。结果表明 :侵染过程从发芽开始持续到感染后 2 4h ,感染初期的芽体具有二核性 ,随后合二为一 ,感染后 2 4h进入裂殖体增殖阶段形成多核裂殖体 ,感染后 5 4h出现孢子母细胞、短极丝孢子及孢内发芽现象 ,感染后 6 0h出现二次感染体及趋于成熟的孢子 ,感染后 96h开始形成大量的成熟孢子、空孢壳及二次感染体的再分裂 ,此时在感染家蚕BmN细胞中 ,难于明确划分家蚕微孢子虫的各发育阶段。