利用分裂泛素酵母双杂交技术钓取小麦TaSC互作蛋白质

TaSC (Triticum asetivum L. salt-tolerance related gene, GenBank 登录号为AY956330)是从小麦耐盐突变体RH8706-49 中克隆的高盐诱导表达的耐盐相关基因。以该基因编码的蛋白质TaSC 为诱饵, 运用分裂泛素酵母双杂交技术从小麦cDNA 表达文库中钓取互作蛋白质, 筛选到一个编码小麦未知功能蛋白质的基因(GenBank 登录号为AK336035), 命名为TaSCIP1 (TaSC interaction protein 1)。双分子荧光互补(BiFC)实验证实TaSCIP1 与TaSC 存在互作。该互作蛋白的分离有利于进一步研究TaSC 基因的耐盐机制。     

甘蓝型油菜Cu/ZnSOD和FeSOD基因的克隆及菌核病菌诱导表达

依据拟南芥、芥菜型油菜和白菜已知超氧化物歧化酶(SOD)保守序列设计引物,用同源序列法和RT-RACE技术克隆甘蓝型油菜Cu/ZnSOD和FeSOD基因,经序列分析和基因片段拼接,得到Cu/ZnSOD和FeSOD基因的全长cDNA,分别为756 bp (GenBank登录号AY970822)和1 037 bp (GenBank登录号EF634058)。以cDNA序列设计引物,获得1 322 bp的Cu/ZnSOD基因组DNA (GenBank登录号DQ431853)和1 659 bp的FeSOD基因组DNA (GenBank登录号EF634057)。生物信息学分析表明,Cu/ZnSOD基因ORF框长459 bp,编码152个氨基酸残基的蛋白质,在基因组序列结构上具有7个外显子和6个内含子。而FeSOD基因ORF框长792 bp,编码263个氨基酸残基的蛋白质,在基因组序列结构上具有8个外显子和7个内含子。二者外显子和内含子交接处完全符合GT/AG规则。利用获得的Cu/ZnSOD的cDNA片段作探针,对菌核病菌诱导甘蓝型油菜叶片的mRNA进行Northern blotting分析,结果显示在同一品种(系)中菌核病菌诱导后Cu/ZnSOD mRNA表达量比诱导前升高,抗(耐)型油菜Cu/ZnSOD mRNA表达量明显高于感病型。油菜叶片SOD酶活性分析结果也获得了完全一致的结果。以上结果表明,甘蓝型油菜SOD基因与菌核病抗性相关。     

棉属野生种旱地棉苏氨酸醛缩酶基因GarTHA的克隆及功能验证

盐胁迫是影响作物生长和发育的重要因素之一。一些棉属野生种具有较好的耐盐性, 是开展棉花耐盐性机制研究以及改良陆地棉耐盐性的重要资源。本研究基于cDNA-AFLP技术分离获得的旱地棉(Gossypium aridum)盐胁迫下差异表达片段序列信息, 经电子克隆技术和RT-PCR方法克隆了旱地棉苏氨酸醛缩酶基因cDNA全长, 命名为GarTHA (GenBank登录号为KC167360)。该cDNA全长为1 018 bp, 包含一个822 bp的完整ORF, 编码273个氨基酸残基, 蛋白质分子量为82.57 kD, 等电点为4.89。GarTHA基因与杨树PtTHA基因同源性最高, 为84.6%。为进一步验证其功能, 利用拟南芥逆境胁迫启动子rd29A构建植物表达载体, 将GarTHA基因的完整ORF转入拟南芥中, 获得转基因植株并进行了耐盐性鉴定。结果表明, 在盐胁迫下转基因拟南芥种子的发芽率明显高于野生型, 且转基因植株的根长显著高于野生型。说明GarTHA基因可能参与植物的盐胁迫反应, 从而提高植物抗逆性。     

大豆尿黑酸叶绿基转移酶基因的克隆与进化分析

采用基于EST的电子克隆方法,以拟南芥(Arabidopsis thaliana)的尿黑酸叶绿基转移酶基因(Homogentisate phytyltransferase,HPT)cDNA序列为信息探针,对大豆的EST数据库进行同源检索筛选,获得了1 777 bp长大豆HPT基因的cDNA序列(GenBank登录号为:AY956421),经RT-PCR扩增、分子克隆和序列分析验证,表明与电子克隆序列一致;该基因具有完整的开放阅读框架(ORF,173～1 408 bp),推测编码411个氨基酸的蛋白。该蛋白与拟南芥(Ara-bidopsis thaliana)、苜蓿(Medicago sativa)、水稻(Oryza sativa)、玉米(Zea mays)、光合集胞蓝细菌(Synechocystis)的序列进行了比较,发现该基因具有保守性。     

小麦耐盐相关基因TaSTK的克隆

利用RACE方法,从小麦耐盐突变体RH8706-49中扩增获得小麦丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（Triticum aestivum serine-threonine protein kinase）基因TaSTK的全长cDNA序列,含1 958 bp,其中开放阅读框1 431 bp,编码476个氨基酸。其编码区基因组DNA全长为4 095 bp,含5个外显子。该基因的全长cDNA序列及基因组序列均已提交GenBank数据库（登录号：DQ103756和DQ341377）。经过NCBI比对发现该基因的氨基酸序列与丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶、酪氨酸蛋白激酶、蛋白激酶都具有较高的同源性。Northern杂交检测表明,TaSTK在小麦中属于盐诱导增强型基因,并且在耐盐材料RH8706-49中诱导增强程度高于敏盐材料H8706-34。TaSTK的杂交信号非常弱,表明TaSTK在小麦幼苗的叶片组织中属于低表达的基因类型。     

棉花中两个新的F-box蛋白基因的克隆与表达分析

 以棉花EST序列分析为基础,利用电子克隆和RT-PCR技术,从棉花中克隆了2个新的F box蛋白基因,分别命名为GhFB1 (GenBank核酸数据库登录号：EF419428)和GhFB2 (GenBank登录号：EF503623)。GhFB1cDNA全长866bp,编码162个氨基酸;GhFB2 cDNA全长657bp,编码161个氨基酸,而且两者均含有植物F-box蛋白家族特有的F-box结构域。序列比较分析表明,GhFB1和GhFB2蛋白与水稻OsGID2,拟南芥AtSLY1具有高同源性,是棉花中F-box蛋白家族的新成员。RT-PCR结果表明,GhFB1和GhFB2在根、下胚轴、叶、茎、花和纤维中都有表达,而且均在棉花纤维起始和伸长时期有优势表达,推测这2个基因在棉纤维早期发育中可能起重要作用。     

大豆吡哆醛激酶基因的克隆与表达分析

以拟南芥吡哆醛激酶基因(PK)的蛋白质序列为信息探针,对大豆(Glycine max)EST数据库进行同源搜索和序列拼接,获得了全长为1102 bp的大豆吡哆醛激酶基因的cDNA序列,经RT-PCR克隆和序列分析验证,结果表明与电子克隆序列一致(GenBank登录号为DQ006813).该eDNA序列的开放阅读框(0RF)位于第119～1045位,推测编码308个氨基酸.采用半定量RT-PCR方法研究了该基因的组织特异性表达情况和对强光逆境的反应,结果表明该基因在大豆根茎叶中都有表达,对强光逆境不敏感.将大豆PK基因编码的蛋白序列与马铃薯(Solanum tuberosum,AAY85186)、拟南芥(Arabidopsis thaliana,AAK94021)、水稻(Oryza sativa,ABA99785)、小麦(Triticum aestivum,AAR00318)和油菜(Brassica napus,ABE73472)的吡哆醛激酶蛋白序列进行比对,发现其一致性分别为:81%,75%,78%,79%和76%.比对结果说明在植物中该基因编码的蛋白质存在显著的相似性.根据蛋白比对结果绘制的系统发育树基本代表了它们在经典分类上的地位.     

小麦谷氨酰胺合成酶前体Ⅱ基因的克隆与分析

采用RACE方法,从小麦耐盐突变体RH8706-49的转录产物中获得谷氨酰胺合成酶Ⅱ(GS2)前体基因的全长cDNA序列,共包含1 690 bp,其中ORF区1 284 bp,编码427氨基酸。该基因已提交GenBank（登录号：DQ103756）。经Blast比对,该基因与大麦、水稻、玉米GS2的同源性分别达94.6%、87%和90.4%。经Northern Blottin     

陆地棉质体转录活性因子基因GhPTAC的克隆及其耐盐性分析

为了挖掘新的耐盐基因及调控途径，利用基因芯片技术及抑制性差减文库技术筛选到质体转录活性因子，通过RACE及RT-PCR技术克隆到该基因的cDNA全长，命名为GhPTAC。该cDNA全长1 564 bp，其中ORF 1 038 bp，推测编码345个氨基酸残基的多肽。生物信息学分析表明GhPTAC为拟南芥PTAC13同源基因，同源性60.6%。编码蛋白为转录活跃的染色体(TAC)的一个组分，参与叶绿体基因组转录终止/抗终止调节。Real-time PCR分析结果表明，GhPTAC受盐胁迫诱导上调表达，在耐盐材料中9806中表达水平明显高于盐敏感材料中S9612，这与芯片结果一致。     

大豆GmHKT6;2基因的克隆与表达特性分析

为探明大豆中HKT蛋白基因的耐盐作用机理,从耐盐大豆材料中克隆到GmHKT6;2基因完整的cDNA序列,GmHKT6;2基因的开放阅读框(ORF)全长1 644 bp,编码547个氨基酸。序列比对与进化树分析表明:GmHKT6;2是大豆中的一个新HKT蛋白基因;GmHKT6;2基因在大豆的根、茎及叶中均能表达,150 mmol/L NaCl处理后,该基因在大豆根、茎及叶中的表达被强烈诱导并高效表达。结构域分析结果表明:大豆GmHKT6;2基因拥有10个可能的跨膜结构域(TMD)和阳离子转运蛋白保守结构域,推测其是通过调节相关阳离子的转运来调控大豆的耐盐性。     

果子蔓凤梨Actin基因的克隆与序列分析

持家基因Actin常被用作定量、半定量PCR试验的内参,以确定目标基因的相对表达量。基于前期从全长cDNA文库中获得Actin基因的EST单克隆,进行Primer Walking测序,获得一个Actin基因的全长cDNA序列,序列长1625bp,ORF为1131bp,可编码377个蛋白氨基酸,命名为Goactin1(GenBank登录号:HQ184438)。蛋白质理论分子质量为41.7kD,等电点pI为5.31,包含一个Actin superfamily保守区,二级结构主要由随机卷曲、Alpha螺旋、延伸链和Beta转角组成。此外以2BTF A链为基础建立起了Goactin1蛋白的三级结构图。系统进化树分析表明Goactin1蛋白与马铃薯、棉花、烟草、短柄草、拟南芥等的Actin蛋白聚为一类,它们的亲缘关系最近。     

大豆吡哆醇生物合成蛋白基因(PDX)的电子克隆和进化分析

电子克隆(In silicocloning)是随着基因组计划和EST计划实施而发展起来的利用生物信息学手段进行基因克隆的新方法。根据物种间同源基因相对保守的特点,以拟南芥(Arabidopsis thaliana)吡哆醇生物合成蛋白cDNA序列为信息探针,对大豆(Glycine max)EST数据库进行同源搜索和序列拼接,获得了1 280 bp长的大豆吡哆醇生物合成蛋白的基因序列(GenBank登陆号为DQ139265)。经过RT-PCR扩增、基因组PCR扩增、分子克隆和序列分析验证,结果表明与电子克隆序列完全一致。该基因具有完整的开放阅读框架(ORF,20~955 bp),编码311个氨基酸。通过与水稻、日本百脉根、烟草、截形苜蓿等物种的吡哆醇生物合成蛋白序列比对,发现该基因具有高度的保守性。表明根据物种间同源基因序列,对跨物种间EST数据库进行同源检索、筛选、拼接,是克隆基因的有效途径。     

马铃薯块茎颗粒结合型淀粉合酶基因的克隆及其RNAi载体的构建

GBSSI是马铃薯块茎中控制直链淀粉合成的关键酶, 为培育高支链淀粉含量或纯支链淀粉含量的转基因马铃薯材料, 根据GenBank登录号X58453设计特异引物, 采用RT-PCR技术获得马铃薯块茎GBSSI相似基因, 利用生物信息学相关软件分析, 预测GBSSI相似基因cDNA序列编码的蛋白质结构和功能。结果表明, 克隆的GBSSI相似基因与报道的GBSSI基因序列相似性达到99.78%, 其开放阅读框长1 824 bp, 编码607个氨基酸, 具有许多重要功能位点;三级结构预测结果表明该蛋白具有淀粉合成功能, 基因序列已注册到GenBank, 序列登录号为EU403426。以此基因CDS内542 bp的靶标序列作为干扰区段, 扩增GBSSI的正反向基因片段, 并引入237 bp的内含子序列, 构建由Patatin启动子驱动的具有“正义基因片段gbss A-内含子VP1-ABI3-like protein-反义基因片段gbss B”的植物干扰表达载体pBI121g-PgABI, 将为淀粉合成的进一步研究和高支链淀粉含量或纯支链淀粉含量的马铃薯品种的培育奠定基础。     

萝卜扩展蛋白基因RsEXPB1克隆与表达特征分析

本文根据GenBank中扩展蛋白序列设计特异引物,从萝卜高代自交系"NAU-LVYH06"中克隆到一个扩展蛋白基因RsEXPB1(GenBank accession No.GQ387363,GQ387364).其编码区基因组序列长度为1 430bp,包括4个外显子和3个内含子;RT-PCR获得长度为898 bp的cDNA,开放读码框(ORF)为29～820 bp,推导编码263个氨基酸,含有1个组氨酸(His-Phe-Asp,HrD)功能域,ORF和推导蛋白序列与拟南芥AtEXPB3(GenBank accession No.NM118965)同源性分别为87%、92%.半定量RT-PCR检测到该基因主要在萝卜生育前期的幼叶、肉质根木质部和韧皮部中表达,且表达丰度可能与该部位细胞生长分裂状态相关,差异较明显.     

苎麻纤维素合成酶基因cDNA的克隆及表达分析

以苎麻 [Boehmeria nivea (Linn.) Gaud.] 栽培种湘苎3号为材料, 通过简并引物RT-PCR结合RACE技术首次成功克隆苎麻纤维素合成酶基因BnCesA1 5′端450 bp序列以外的全部cDNA 序列, 序列长3 276 bp, 编码一段938个氨基酸的蛋白质。经基因比对及蛋白质结构分析确证是苎麻纤维素合成酶基因。半定量RT-PCR分析显示：BnCesA1在苎麻根、茎、叶和芽组织中均有表达, 其表达量为茎＞叶＞芽＞根, 相对表达量依次为 0.791、0.381、0.319和0.183。从其表达模式可以推测该基因同时参与了苎麻细胞初生和次生细胞壁纤维素的合成。     

擎天凤梨泛素基因的克隆与序列分析

鉴于泛素与植物受高温等环境胁迫下产生的一些诱导型蛋白降解有关,本研究根据擎天凤梨Ostara早期花器的全长cDNA文库,经大规模随机测序及重叠群（contigs）内EST序列的拼接,获得了擎天凤梨多聚泛素基因全长cDNA序列（GenBank登录号：GQ890686）,序列长1896bp,开放阅读框长1323bp,编码441个蛋白氨基酸残基,蛋白质分子质量为49.3kD,等电点pI为6.59。蛋白二级结构预测显示,该蛋白主要由随机卷曲、延伸链、α螺旋和β-转角组成;系统进化树分析表明与拟南芥推定的多聚泛素UBQ10（gi｜23397122｜gb｜AAN31845.1｜）亲缘关系最近;经推断它是由5个单体泛素组成的多聚泛素。本研究有助于进一步探讨该基因在低温胁迫下的反应机理以及如何采用分子调控手段增强擎天凤梨的耐低温能力。