洪湖碘泡虫单管半巢式PCR检测方法的建立及应用

在异育银鲫（）引起的“喉孢子虫病”常会导致池塘养殖苗种和成鱼大量死亡。因此,建立一种特异性强、灵敏度高和易于操作的检测方法对于该病的早期诊断以及防治具有重要意义。本研究基于洪湖碘泡虫18S rDNA基因序列设计合成两组特异性引物,通过外引物组和单条内引物组合及条件优化,建立了洪湖碘泡虫单管半巢式PCR检测方法,并对该方法的特异性、灵敏度及临床应用分别进行了验证。结果显示,该检测方法特异性好,只有洪湖碘泡虫扩增为阳性,瓶囊碘泡虫（Thelohanellus wuhanensis）及异育银鲫肌肉样品等均为阴性;最低检测灵敏度极限为4.2 copy/μL;对疫区养殖池塘健康异育银鲫的卵巢、肾脏及脾脏组织样品检测发现洪湖碘泡虫阳性率分别为40%、32%和8%,检出率显著高于普通PCR。因此,本研究所建立的检测方法特异性强、灵敏度高,可应用于洪湖碘泡虫的早期快速检测。     

洪湖碘泡虫在发病和隐性感染异育银鲫组织器官中的分布

为探究洪湖碘泡虫在被感染异育银鲫不同组织器官中的分布及不同感染阶段的差异，实验采用显微镜镜检、PCR检测及组织病理切片相结合手段，对发病及隐性感染异育银鲫的肌肉、伪鳃、鳃、头肾等11个组织器官进行了广泛检测分析。显微镜镜检发现，在发病鱼的咽、伪鳃和鳃能观察到孢囊或成熟孢子；在隐性感染异育银鲫的咽上壁与副蝶骨间结缔组织、伪鳃及其血管周边观察到大量棕黄色结节，并含有洪湖碘泡虫的成熟孢子。不同组织器官DNA样品PCR检测发现，在发病鱼除肌肉外的其他10个组织器官中均检测到洪湖碘泡虫存在，其中伪鳃检出率最高(100%)；隐性感染异育银鲫在咽上壁组织、伪鳃、头肾、体肾、脾脏及卵巢中检出洪湖碘泡虫，伪鳃检出率也为最高(26.7%)。组织病理切片显示，发病鱼咽上壁内分布着大量蜂巢状孢囊及成熟孢子，伪鳃被严重侵占和破坏；残存伪鳃鳃丝周边能观察到增殖和发育阶段的孢子生成细胞。综上所述，本研究首次报道了洪湖碘泡虫在发病和隐性感染异育银鲫不同组织器官中的分布差异，发现伪鳃可能是洪湖碘泡虫寄生和发育成熟的重要器官。结果为洪湖碘泡虫病的准确检验检疫和进一步开展致病机制研究奠定基础。     

鲫复合种隐性感染洪湖碘泡虫调查及遗传多样性分析

为探究严重危害养殖异育银鲫“喉孢子虫病”病原的宿主范围以及不同宿主寄生虫株间的遗传差异,本研究广泛采集了金鱼、红鲫、异育银鲫、彭泽鲫、方正银鲫、淇河鲫、金背鲫等我国常见鲫复合种样品,采用18S rDNA PCR检测了各样品伪鳃的洪湖碘泡虫感染率,并进一步通过巢式PCR克隆测序获得部分样品洪湖碘泡虫的ITS2序列。PCR检测结果发现来自7个地区8种鲫属鱼类品系都存在洪湖碘泡虫的隐性感染,感染率为25.0 % ~ 88.2 %;ITS2序列分析表明感染鲫复合种的洪湖碘泡虫株系间序列差异较低,所获得的序列间仅有6个差异信息位点,平均遗传距离为0.003;不同来源虫株间共存在7种单倍型, 其中H1、H2和H3只出现在金鱼、红鲫寄生虫株,H5广泛存在不同来源的异育银鲫寄生虫株。系统发育分析显示,来自不同鲫复合种的洪湖碘泡虫聚集为2个分支,其中寄生金鱼的虫株与瓶囊碘泡虫亲缘关系较近。本研究结果为阐明异育银鲫“喉孢子虫病”的流行病学规律和防控疾病发生提供重要基础数据。     

环介导恒温扩增技术检测血卵涡鞭虫

血卵涡鞭虫病是海水甲壳类的重要寄生虫病,其流行范围广、死亡率高、危害非常严重。本研究根据GenBank中已登录的血卵涡鞭虫(Hematodinium sp.)ITS1序列设计了1套引物,该引物可识别目标基因中6个不同区段。以此套引物建立了一种基于环介导恒温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)的血卵涡鞕虫病诊断方法。特异性试验结果表明,该套引物对血卵涡鞕虫检测具有较高的特异性,能有效检出血卵涡鞕虫。敏感度试验结果表明,该LAMP技术的灵敏度比常规PCR技术高4个数量级。分别运用LAMP和常规PCR技术对25份临床疑似病例进行检测,LAMP方法共检出感染病例25份,常规PCR检出感染病例23份。该技术能在65℃恒温条件下45～60min完成目的DNA的扩增,可直接通过肉眼观察反应产物中是否产生白色沉淀或经SYBRGreenI染色后通过颜色变化、扩增产物的琼脂糖凝胶电泳来定性判断结果,这将为血卵涡鞕虫病的临床诊断提供一种更加简便、快速、实用的方法。     

奥尔森帕金虫环介导等温扩增(LAMP)检测方法的建立及应用

奥尔森帕金虫是重要的贝类病原性寄生虫之一,为建立快速、灵敏、准确和使用简便的检测方法,实验根据奥尔森帕金虫5.8S rDNA中的内转录间隔区(internal transcribedspacer,ITS)序列,建立了环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测方法,并对反应温度、反应体系中Mg2+浓度和反应时间进行了优化。该方法的检测灵敏度约为30拷贝质粒DNA,并且特异性较强,与海水帕金虫、包纳米虫、波豆虫及急性病毒性坏死病毒(acute viral necrosis virus,AVNV)等病原均无交叉反应。使用LAMP法对两批菲律宾蛤仔样品进行检测,结果表明,LAMP检测与传统PCR检测相比,灵敏度更高,检测结果更准确。实验所建立的奥尔森帕金虫LAMP检测方法简单、快速、灵敏且特异性强,可以在沿海贝类养殖厂及条件简陋的实验室使用。     

贝类派琴虫实时荧光定量PCR检测方法的建立和应用

选择派琴虫保守的核糖体DNAITS-2区域设计引物和TaqMan探针,通过对反应体系和反应条件进行优化,建立了实时荧光定量PCR检测派琴虫的方法。所构建方法检测质粒模板DNA的动态范围为2.6×10^1～2.6×10^7拷贝,敏感度可检测到26拷贝质粒DNA,而且与包拉米原虫、隐孢子虫等其他寄生性原虫无交叉反应,也不受贝类组织DNA的干扰。利用本研究所建立的方法对来自我国山东、福建等不同沿海海域的30份贝类样品进行检测,检出阳性样品3份。研究表明,本研究所构建的派琴虫实时荧光定量PCR检测方法具有快速、灵敏和特异等优点,可满足国内养殖场及进出口水生动物携带派琴虫的检测需要。     

异育银鲫寄生洪湖碘泡虫的鱼卵传播途径

洪湖碘泡虫(Myxobolus honghuensis)是引起异育银鲫(Carassius auratus gibelio Bloch)“喉孢子病”的重要病原, 每年导致养殖苗种和成鱼大量死亡。本研究通过隐性感染异育银鲫母本人工受精、实验室条件下受精卵孵化和幼鱼培育, 采用单管半巢式 PCR、荧光定量 PCR 和寡核苷酸荧光原位杂交等检测手段进行亲本、卵和幼鱼等环节的检测分析, 探究异育银鲫寄生洪湖碘泡虫是否存在经卵传播途径。结果表明, 所采用的 34 尾异育银鲫母本(A1~A22, B1~B12)的洪湖碘泡虫隐性感染率达 50%~75%, 其中, 卵和伪鳃检出率高于卵巢组织样品; 特异性寡核苷酸探针荧光原位杂交在隐性感染母本的卵巢、伪鳃、肾、脾组织检测到洪湖碘泡虫前孢子生成阶段营养体; 实验室条件下阳性母本所产的卵经孵化和培育出的幼鱼 15 dph 和 30 dph 样品可以检出阳性(A1、A18、B8 和 B9); 荧光原位杂交显示 15 dph 幼鱼在伪鳃、鳃和肾脏组织检测出阳性信号。本研究进一步揭示了异育银鲫寄生洪湖碘泡虫存在经鱼卵传播途径; 研究结果可为相关疾病制定防控措施奠定重要的理论基础。     

嗜水气单胞菌与温和气单胞菌的LAMP检测方法的建立

利用环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）分别建立嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila,AH）与温和气单胞菌（A.sobria,AS）的快速检测方法。针对嗜水气单胞菌pilin基因、温和气单胞菌zipA基因设计特异性LAMP引物。在恒温条件下利用实时浊度仪对2组引物进行特异性和灵敏度试验,并以琼脂糖凝胶电泳和核酸染料颜色变化对扩增结果进行判定。结果显示,LAMP实时浊度法能够特异地检测嗜水气单胞菌和温和气单胞菌,最低检出限分别为46 fg·mL^-1和320 fg·mL^-1,是普通PCR方法的104倍和102倍;并能应用于已知临床样品检测。该研究建立的嗜水气单胞菌与温和气单胞菌LAMP快速检测方法具有高效、特异、灵敏的特点。     

贝类派琴虫PCR检测方法的建立及初步应用

根据派琴虫的基因保守序列设计了特异性引物,对派琴虫的DNA进行PCR扩增并将产物克隆到pMD18-T载体后测序.结果表明,扩增大小为596bp,与预期扩增序列同源性为99.8%.该PCR方法检测灵敏度高,最低可检测1pg的派琴虫DNA;特异性强,对荧光假单胞菌、嗜水气单胞菌、大肠杆菌、葡萄球菌、副溶血孤菌、沙门氏菌、诺瓦克样病毒等贝类病原体的扩增均为阴性.用该PCR技术对广西沿海的104份牡蛎、49份贻贝和20份文蛤病料进行检测,阳性率分别为14.6%、10.6%和15.0%.结果显示,派琴虫广泛存在于中国南方沿海的养殖贝类中,建立的PCR方法可用于贝类派琴虫的临床快速检测.     

应用多聚酶链反应检测生鸡肉中沙门氏菌的研究

目的:建立快速、特异、灵敏的PCR方法以检测生鸡肉中的肠炎沙门氏菌。方法:以肠炎沙门氏菌的sefA基因作为靶序列设计一对引物,将样品增菌后用煮沸法提取细菌基因组DNA进行检测。结果:每克生鸡肉污染3.0×10°CFU肠炎沙门氏菌,经16h增菌培养后可扩增出500bp特异性性DNA带,对28份屠宰场样品的检测结果与传统方法相符合。结论:PCR法适于生鸡肉中肠炎沙门氏菌的快速、准确检测。     

猪圆环病毒2型PCR检测方法的建立

根据猪圆环病毒2型(PCV2)的基因序列,设计一对能特异性扩增PCV2ORF2基因的引物,通过对PCR方法的优化,建立了快速的PCR检测方法用于病料中PCV2感染的检测。用本方法对猪瘟病毒(HCV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病毒(PRV)进行了扩增,均未有条带出现,表明该方法具有良好的特异性;敏感性试验表明,该方法能够检测到的最低DNA模板浓度为1.0×10-5ng/μL;重复性试验表明,该方法具有良好的稳定性。     

奶牛结核病的PCR检测方法的建立及应用

根据PCR技术的原理建立了奶牛结核病的PCR诊断方法,并测定出该方法的敏感性为30.9pg/ūL。特异性试验结果表明,除牛结核分枝杆菌的特异扩增带(242bp)外,其他的细菌均未出现特异性扩增带。用该方法对陕西省某奶牛养殖小区的121份乳样中的结核分枝杆菌进行检测,结果显示,在121份乳样中有3份为阳性,阳性检出率2.48%。本试验还用PCR方法对PPD检测和胶体金检测法进行验证,结果表明PCR方法敏感性强,特异性高,是一种提高牛结核病临床诊断的好方法。     

[鱼师]诺卡菌特异性PCR快速检测方法的建立

[鱼师]诺卡菌（Nocardia seriolae）是危害中国南方大口黑鲈（Micropterus salmoides）养殖业的主要病原之一,由于该菌在培养基上生长缓慢,对其分离鉴定造成诸多不便。文章根据[鱼师]诺卡菌16S-23S转录间隔区（ITS）序列设计特异性引物建立了[鱼师]诺卡菌特异性PCR快速检测方法。试验结果表明,利用设计的特异性PCR引物只能扩增出[鱼师]诺卡菌特异性片段,检出限为5pg模板DNA。在此基础上研制了PCR快速检测试剂盒并对[鱼师]诺卡菌人工感染的大口黑鲈组织进行了检测,结果显示该试剂盒能从未出现明显发病症状的大口黑鲈组织中检出阳性片段,阳性率为100％,比传统细菌分离鉴定方法更加灵敏、快速且高效,具有较好的应用前景。     

二温式PCR检测对虾传染性皮下和造血器官坏死病毒的研究

根据对虾传染性皮下和造血器官坏死病毒(IHHNV)基因序列,设计了1对可以扩增356 bp IHH-NV某段基因序列的特异性引物,优化建立了能快速检测IHHNV的二温式PCR。特异性试验和敏感性试验结果表明,该技术只对IHHNV DNA模板进行扩增,得到356 bp的DNA扩增片段,而对SPF南美白对虾组织DNA和其它对虾病原DNA/RNA的扩增结果为阴性;该技术最低能检测到10 pg的IHHNV感染对虾组织样品总DNA。应用该技术对400份对虾临床样品进行检测,结果有96份样品呈现阳性,表明该病在我国南方的养殖对虾中广泛存在,二温式PCR技术可以直接用于该病的临床快速检测和流行病学调查。     

虾夷扇贝脓胞病病原查氏弧菌的PCR快速检测

应用PCR技术,建立一种能够快速有效检测出虾夷扇贝脓胞病致病病原查氏弧菌的方法。根据查氏弧菌的GyrB基因的高保守区序列,设计1对扩增片段为144 bp的引物,并利用PCR技术对其进行了特异性和敏感性检测。试验结果表明,该方法对查氏弧菌DNA的检测呈特异性,每个PCR反应检测的敏感度为0．43 pg的DNA和3．9 cuf的细菌。由人工感染和海区取样的虾夷扇贝的病灶组织中可以检测出相应的病原菌,说明本方法有效可行。     

瓶囊碘泡虫的重描述及其与洪湖碘泡虫分子标记的比较

为了完善瓶囊碘泡虫的分类学特征及厘清其与洪湖碘泡虫的分类关系,实验采用形态学、组织学和分子生物学方法对瓶囊碘泡虫进行了重描述,并与洪湖碘泡虫的分子标记进行了系统比较。结果显示,瓶囊碘泡虫寄生于异育银鲫的鳃,形成乳白色的圆形或椭圆形孢囊,直径为1.2～1.4 mm。成熟孢子壳面观呈梨形,前端较尖,后端钝圆,孢子长17.3～19.6 μm,孢子宽7.4～9.9 μm。两个极囊呈瓶状,大小不等。大极囊长6.4～9.7 μm,大极囊宽2.1～3.3 μm;小极囊长5.3～8.9 μm,小极囊宽2.0～3.3 μm。极丝圈数为8～11圈。组织学分析显示,瓶囊碘泡虫寄生于鳃小片间的上皮组织。BLAST分析显示,本研究获得的瓶囊碘泡虫的SSU rDNA序列与GenBank中瓶囊碘泡虫序列的相似性为99.5%～99.8% （KC425223-KC425225,MH329620,JQ690361,JQ690373,KJ725082,MN227351,DQ339482）。系统发育分析表明,瓶囊碘泡虫与洪湖碘泡虫形成姐妹支。瓶囊碘泡虫与洪湖碘泡虫分子标记序列的比较显示,这两种碘泡虫的序列相似性为98.2%～98.8% ,遗传距离为0.014～0.018,存在27个碱基差异。SSU rRNA二级结构分析显示,瓶囊碘泡虫和洪湖碘泡虫不同群体间的二级结构一致,两个物种间的二级结构存在明显差异,表明SSU rRNA二级结构可以作为鉴别瓶囊碘泡虫和洪湖碘泡虫的分子特征。本研究完善了瓶囊碘泡虫在异育银鲫鳃部的详细寄生部位,提出SSU rRNA二级结构可以作为有效鉴别瓶囊碘泡虫和洪湖碘泡虫的分子标记。     

杂交鳢(斑鳢♀×乌鳢♂)弹状病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为了建立一种能在临床上快速、准确检测杂交鳢弹状病毒(HSHRV)的TaqMan实时荧光定量PCR方法,利用PCR技术扩增HSHRV-C1207 G蛋白的全长序列,构建重组质粒,作为荧光定量PCR的标准品,根据HSHRV-C1207 G蛋白的保守序列,设计合成了一对能特异性扩增143 bp片段的引物和TaqMan探针,以标准品为模板建立HSHRV的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,并对该方法的灵敏度、可重复性和特异性进行评价。结果显示:建立的荧光定量PCR检测方法标准曲线有较好的线性关系,相关系数(R2)为0.999,斜率为-3.290;荧光定量PCR最低可以检测到10个病毒核酸分子拷贝,而传统PCR方法最低可检测到1×103个拷贝;38个平行样品重复性实验组内变异系数为0.84%;对其他6种水产养殖常见病毒均无扩增反应。应用该方法对采集的21份患病鳢样品进行检测,其中18份为阳性,与细胞分离和电镜观察结果相同;以传统PCR方法检测同样的样品,仅13份为阳性。本研究建立的TaqMan实时荧光定量PCR方法灵敏度高、特异性强,能较好的用于临床HSHRV的检测,对病毒病原定量检测与杂交鳢弹状病毒病的快速诊断具有重要意义。     

LAMP法在水产动物病原快速检测中的应用

近年来,一种新的恒温核酸扩增方法LAMP法(loop-mediated isothermal amplification),即环介导等温扩增法已经被开发利用。它采用能特异识别靶序列上6个位点的4条引物及一种具有链置换活性的DNA聚合酶(Bst DNA polymerase),在恒温条件(60~65℃),不到1h的时间里进行核酸扩增,其扩增效率可达到109~1010个数量级,具有特异性强、等温灵敏、操作简单、产物易检测等优点。LAMP法已经被用来快速检测水产动物病原(细菌、病毒、寄生虫)。文章就LAMP法的反应原理、引物设计及其在水产动物病原快速检测中的应用等做简要的综述。     

虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei)实时荧光定量PCR检测方法的建立及对虾样品的检测

根据Gen Bank中公布的虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei)(EHP)SSU r DNA序列设计1对特异性引物,建立并优化了EHP的SYBR Green I实时荧光定量PCR(q PCR)检测方法。结果显示,该方法在60℃的退火温度时扩增效果最好,产物的熔解曲线为1个单峰,构建的方法对8.3×101–8.3×108 copies/μl的EHP SSU r DNA片段的检测响应具有良好的线性关系,扩增产物阈值循环数(Ct)与模板起始量的对数[log(Sq)]的关系为Ct=–3.369 log(Sq)+39.364(R2=0.992),扩增效率为98.1%,检测灵敏度下限为8.3×101 copies/μl,在线性范围内具有良好的组内和组间重复性。对实际样品的检测表明该方法比已报道的套式PCR的检测灵敏度约高4倍。利用本方法对采集自江苏、海南和山东的3批凡纳滨对虾样品的肝胰腺组织DNA(Hp DNA)中的EHP SSU r DNA进行了q PCR检测,结果显示,EHP的载量指数与对虾生长速率呈负相关关系,肝胰腺中EHP载量在103 copies/(ng Hp DNA)时代表了较高的风险水平。本研究建立的q PCR方法具有特异、灵敏、快速、定量的优点,所建立的方法及检测数据可为EHP的防控提供技术参考。     

养殖沉积环境中气单胞菌属细菌的实时荧光定量PCR检测方法的建立

利用GyrB基因的特异性引物建立沉积环境中气单胞菌属细菌的实时荧光定量PCR检测方法。将已知浓度的气单胞菌菌液加入灭菌的沉积物样品中,作为模拟沉积物样品。通过选择和优化沉积物DNA提取方法、特异性引物、标准曲线模板,建立沉积环境中气单胞菌属细菌准确检验的实时荧光定量PCR方法,同时验证该方法的特异性、灵敏性、重复性。结果表明,采用改进的溶菌酶-SDS温和裂解法提取沉积物DNA,以扩增GyrB基因片段的IAF和IAR为特异性引物,并直接以模拟沉积物样品DNA为标准品构建标准曲线,可以建立适用于定量检测沉积环境中气单胞菌属细菌的实时荧光定量PCR方法。该方法可灵敏、特异、准确地定量检测刺参养殖池塘底泥中气单胞菌属中不同种的细菌,检出效率可达103CFU/g。统计分析显示,变异系数为0.21%-0.80%,均小于5%,表明重复性良好。