灯盏花内生细菌分离及其鉴定

为了解决灯盏花资源紧缺问题,对灯盏花植株及其根际土壤内生细菌进行分离鉴定。利用纯培养方法分离植物内生细菌,根据菌株形态及16S rRNA基因序列系统发育分析对分离到的内生细菌进行鉴定。结果表明获得内生细菌共100株,植株中分离得到62株、土壤中分离得到38株,其中芽孢杆菌属(Bacillus)和假单孢属(Pseudomonas)为灯盏花和根际土壤内生细菌的优势属,分别占总数的55%、28%。表明灯盏花不同部位和根际土壤内生细菌的数量、分布和种群存有差异性,叶部和正常根际土壤中分离到的内生细菌种类最多。     

茶树菇超高压保鲜过程中一株类芽孢杆菌的鉴定及系统发育分析

对超高压保鲜过程中茶树菇的包装袋分离到的菌株WM1003进行鉴定及系统发育分析,以菌株WM1003的基因组为模板扩增获得了该菌株的16S rRNA基因序列,经过序列分析及系统发育分析,对该菌株进行鉴定;PCR扩增结果表明,该菌株的16S rRNA基因的大小约为1600 bp,其GenBank登录号为HM748831;通过在线BLAST比对,结果表明该菌株属于芽孢杆菌属;基于16S rRNA基因序列的系统发育分析结果表明该菌株同已知菌Paenibacillus jamilae CECT 5266的相似性最高,为99.5%,初步将该分离菌株WM1003鉴定为Paenibacillus sp.;本文通过16S rRNA序列及系统发育分析,对菌株WM1003进行了鉴定,为茶树菇的超高压保鲜技术提供了理论支持。     

四个玉米自交系根系内生细菌的分离和鉴定

对4个玉米自交系(PH4CV、PH6WC、郑58和昌7-2)根系中的内生细菌进行分离和鉴定,为获得有益微生物资源奠定基础。通过形态学观察、生理生化特征鉴定及16S r DNA基因序列同源性分析和构建系统发育树等方法对分离菌株进行生物学鉴定,以确定其种属。共分离到23株内生细菌,鉴定为6个属,包括芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas sp.)、肠杆菌属(Enterobacter sp.)、贪噬菌属(Variovorax sp.)、鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium sp.),其中优势属为芽孢杆菌属。4个玉米自交系内生细菌的种类不同,细菌种类由多到少依次是PH6WC、郑58、PH4CV和昌7-2。通过对不同玉米自交系内生细菌的比较分析,发现内生细菌的种类和数量与玉米基因型相关。     

非培养方法解析烟草根部内生细菌的群落结构

为了解烟草根部内生细菌多样性,采用改进的CTAB法提取烟草根部总DNA,利用细菌16 S rDNA基因通用引物对烟草根总DNA进行16 S rDNA扩增,构建烟草根部内生细菌16 S rDNA克隆文库;挑取具有不同酶切谱型的克隆进行测序、比对并构建16 S rDNA基因系统发育树。构建的烟草根部内生细菌16 S rDNA克隆文库中,155个克隆分属于36个不同的分类单元,Blast结果表明,大部分克隆与已知细菌的16 S rDNA序列相似性较高,分别属于变形菌门(Proteobacteria)的Alpha、Gamma、Beta亚群,放线菌门(Actinobacteria),拟杆菌门(Bacteroidetes),厚壁菌门(Fir-micutes)中的肠杆菌属(Enterobacter)、不动杆菌属(Acinetobacter)、寡养食单胞菌属(Stenotrophomonas)、假单胞菌属(Pseudomonas)、嗜甲基菌属(Methylobacillus)、食酸菌属(Acidovorax)、芽孢杆菌属(Bacillus)等16个属,其中13.5%的克隆序列与非可培养细菌(Uncultured bacteria)的相似性在93%～99%之间,假单胞菌属细菌是烟草根部内生细菌的优势种群。这些研究结果说明烟草根部存在较为丰富的内生细菌系统发育多样性,并且潜藏着未知的内生细菌资源。     

人参灰霉病菌拮抗细菌菌株筛选及鉴定

从林下参叶片中分离内生细菌,以人参灰霉病菌为指示菌,筛选拮抗菌株,基于形态学特征和16S rRNA基因序列分析,对拮抗菌株进行鉴定。结果表明,从林下参叶片中共分离得到56株内生细菌,其中菌株FS-1对人参灰霉病菌具有很好的抑制作用。采用生长速率法测定菌株FS-1的发酵液对8种植物病原真菌均有抑制作用。该菌株具有很好的固氮作用,且能够分泌吲哚-3-乙酸(IAA)和产生胞外蛋白酶,IAA产量为4.25 mg/L。通过形态特征观察、生理生化测定和16S rRNA序列分析结果,将菌株FS-1鉴定为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)。本研究表明菌株FS-1具有一定的生防潜力,可用于人参灰霉病的生物防治。     

番茄灰霉病菌拮抗细菌B21的鉴定

对分离于叶片表面能较强抑制番茄灰霉病菌生长的拮抗细菌B21菌株进行了鉴定。通过形态特征、生理生化特征观察,利用PCR技术对菌株B21 16S rDNA序列作全序列分析,序列结果在GeneBank中进行Blast同源序列检索,再用DNAStar软件与Bacillus属的其它种进行同源性分析,结果显示B21与已报道的B. subtilis 16S rDNA序列（登陆号AY172513）有99.93%的相似性,且两者在系统发育树中处于同一个分支。确定B21为枯草芽孢杆菌（B. subtilis）的一个菌株。     

柑橘皮内生细菌分离及柑橘青霉病菌拮抗菌筛选研究

柑橘青霉病是柑橘贮藏期的主要病害,为利用拮抗内生菌进行生物防治,本研究选取3个品种柑橘的橘皮,采用研磨液培养法分离纯化得到26株内生细菌。通过对峙培养法,发现5株内生细菌对柑橘青霉病菌有明显拮抗作用,占菌株总数的19.2%。对这5株细菌进行初步鉴定,分属于气芽孢杆菌属（Aerobacillus sp.）、芽孢杆菌属（Bacillus sp.）、气单胞菌属（Aeromonas spp.）、假单胞杆菌属（Pseudomonas spp.）和黄单胞杆菌属（Xanthomonas spp.）5个属。不同的柑橘品种橘皮内的内生拮抗细菌的出现频次不同。抑菌结果表明,培养3天时,H-3抑菌圈直径最大,达到了15.3 mm,H-18抑菌圈最小,只有5.6mm;4天时,各抑菌圈直径均有缩小,但缩小幅度不大;5天时H-3拮抗作用仍十分明显,抑菌圈直径为10.3 mm。根据H-3的菌体形态特征、生理生化测定及其16S rDNA序列分析,鉴定该菌为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）,该菌的发现对柑橘青霉病的生物防治有较好的应用价值。     

番茄内生细菌种群动态分析及拮抗菌株的筛选

摘要：采用研磨组织稀释分离法对3个种植地区的番茄内生细菌的种群分布、数量变化规律进行了初步探讨。共分离、纯化得到内生细菌374株,经形态及理化特征鉴定,分属10个不同的属,13个种。其中假单孢菌属Pseudomonas sp.,黄单孢菌属Xanthomonas sp.;肠杆菌属Entenobacter sp.和芽孢杆菌属Bacillus sp.为优势种群。内生细菌在番茄植株种群数量从0.21x104 到13.82x104 cfu.g -1鲜重之间,但不同品种、组织、生育期及种植地,内生细菌的种群和数量各不相同,各组织中内生细菌的种群及数量根中最多,其次是茎和叶,成株期内生细菌无论种类和数量都明显高于苗期。采用平板对峙法从分离的内生细菌中筛选出对番茄灰霉病菌具有体外拮抗活性的菌株32个,占菌株总数的8.56%; 25个菌株对叶霉病菌有抑制作用,占菌株总数的6.68%;对灰霉病菌和叶霉病菌都具有拮抗作用的菌株20个,占菌株总数的5.35%。对灰霉病菌有强拮抗作用的菌株12个,对叶霉病菌有强拮抗作用的菌株仅1个,其中芽孢杆菌是主要的类群。     

植物根际土壤细菌的分离与鉴定

为了揭示不同植物根际土壤细菌的群落结构和多样性,以期为更好地利用植物根际土壤细菌奠定基础。笔者采用稀释分离法,对12种不同植物的根际土壤细菌进行了分离,并采用16SrDNA序列测定与系统发育分析法初步确定了细菌的分类地位。结果表明,不同种类植物的根际土壤中,可培养细菌的多样性不同,重茬地和多年生植物的根际土壤中细菌的种类和数量较多;12种植物的根际土壤中共分离得到芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、短杆菌属(Brevibacterium)、节杆菌属(Arthrobacter)、沙雷氏菌属(Serratia)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、不动杆菌属(Acinetobacter)和Massilia等8个属的137株细菌,其中,芽孢杆菌属为优势属,占81.0%。芽孢杆菌属内占主要比例的有：B.megaterium、B.aryabhattai、B.subtilis、B.amyloliquefaciens等种,其中B.subtilis,B.amyloliquefaciens等细菌种类据文献报道为有益微生物,可以在今后的研究中进行开发和利用。植物根际土壤中的可培养细菌种类丰富多样,有望成为有益微生物资源库进行开发利用。     

棉花根部拮抗枯萎病菌或黄萎病菌的可培养内生细菌多样性分析

为解析棉花内生细菌的种群结构,更好地开发利用生防内生细菌,以棉花枯萎病菌、黄萎病菌为指示病原真菌,对常抗棉和泗棉3号根部分离获得的内生细菌进行拮抗活性筛选,获得87株至少对其中1个指示病原真菌具有拮抗作用的内生细菌。ARDRA分析(Amplified ribosomal DNA restriction analysis)和16S r DNA序列测定表明棉花根部可培养内生拮抗细菌可分为13个ARDRA类群,分属于芽孢杆菌属(Bacillus)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、农杆菌属(Agrobacterium)、中华根瘤菌属(Sinorhizobium)、不动杆菌属(Acinetobacter)和假单孢菌属(Pseudomonas)7个属。其中常抗棉根部内生拮抗细菌分属于芽孢杆菌属、短芽孢杆菌属、伯克霍尔德氏菌属和农杆菌属,而泗棉3号根部内生拮抗细菌则分属于芽孢杆菌属、伯克霍尔德氏菌属、中华根瘤菌属、不动杆菌属和假单孢菌属,二者的优势种群都是芽孢杆菌属细菌。BOX-PCR分析显示这些内生拮抗细菌具有丰富的遗传多样性。通过测定这些内生拮抗细菌对棉花黄萎病菌和棉花枯萎病菌的拮抗力大小,以及是否具有产纤维素酶、几丁质酶、蛋白酶和嗜铁素的活性,表明这些内生拮抗细菌具有不同的生防作用机制。     

患根肿病的上海青根内生菌组成和结构的研究

旨在优化植物根内生菌高通量测序分析技术,更好地解析健康与患根肿病上海青根内生菌之间的差异。采用高通量测序方法,对其16S rDNA的V3-V4区进行扩增,并通过合适的软件和数据库进行菌群分析。结果表明,植物内生菌受植物叶绿体DNA的干扰大,平均叶绿体数据占67%。上海青根内生微生物菌群具有丰富的多样性,主要由变形菌门、放线菌门、拟杆菌门和厚壁菌门细菌组成,优势种群为假单胞菌,根瘤菌,芽孢杆菌,以及链霉菌等。健康样品的稳定性较好,不同患根肿病样品之间菌群比例差异较大。研究显示,根肿病侵染对上海青根内生菌群的结构和组成有较为显著的影响。     

葡萄叶可培养内生真菌多样性与分布特征

为研究葡萄叶可培养内生真菌菌群的多样性,分别对采集于云南省丘北县的云南太阳魂葡萄酒庄资源圃内的9个葡萄品种不同类型叶片进行内生真菌的分离,对分离的内生真菌采用ITS序列分析并结合形态学方法进行分类鉴定。共分离到可培养内生真菌1067株。经鉴定归属为90种28个属。其中Colletotrichum和Alternaria为优势属,优势度分别为39.08%和25.21%。不同品种葡萄可培养内生真菌分离率为0.56~1.13,多样性指数为1.32~2.39,而健康植株成熟叶的内生真菌分离率和多样性指数基本上都高于其幼嫩叶片和发病植株的成熟叶片的。对不同品种葡萄的内生真菌的分离率、多样性指数和相似性分析结果表明,葡萄叶片内生真菌菌群丰富具有一定的宿主专一性,但多样性总体偏低。     

基于高通量测序技术分析使它隆对玉米根系内生菌多样性的影响

利用Illumina Miseq高通量测序技术,对玉米根系内生菌16S rRNA的V4~V5可变区序列进行测定,分析不同时期有杂草生长（长草组）与使用使它隆除草对玉米根系内生菌群落组成的影响。从5个玉米根系样品共得到166 647条有效序列、145 298条优质序列和4 464个细菌OTUs。Alpha多样性分析结果表明,玉米根系内生菌的群落多样性随玉米植株的生长而增加;使用使它隆除草后,群落的丰富度和均匀度在花期下降,在成熟期下降明显。对群落组成分析发现,使用使它隆除草后,与长草组相比,花期和成熟期的内生菌在门及属水平上的分布均发生较大变化。内生菌的基因功能分析表明,使用使它隆除草后,花期根系内生菌的异型生物质的降解代谢通路丰度高于未喷施使它隆的长草组样品;成熟期糖代谢通路丰度高于长草组。结果表明,喷施使它隆能降低玉米根系内生菌的多样性,并使内生菌的组成比例发生变化。花期根系内生假单胞菌属等比例的增加与异型生物质的降解代谢有关;成熟期肠杆菌属、芽孢杆菌属等比例的增加与糖代谢功能的提高有关。     

番茄遗传资源的聚类分析研究

通过测定番茄品质特性的遗传多样性和分子标记的多态性,对番茄品种资源进行了聚类分析。结果表明,品质特性聚类分析和分子标记聚类分析最后都形成了四大类群,而且都把果实硬度大、软化速度慢、果型长圆、含水量低、可溶性固形物含量高的加工番茄聚合在了一起,说明一些分子标记可能和控制番茄加工品质特性的基因有比较紧密的连锁关系。分子标记更能灵敏地区分不同品种间的遗传差异。不同类群间品质性状的差异明显大于群内不同品种间的差异,说明聚类分析是鉴别品种资源遗传差异程度、筛选核心资源的有效手段。     

栽培三七内生真菌优势种群分离鉴定

栽培三七为五加科人参属多年生草本药用植物,旨在从药用植物栽培三七中分离出能够产生与宿主植株相同或者相似的生物活性物质的内生真菌菌株。以栽培三七为材料,开展栽培三七内生真菌的分离、纯化,依据传统形态特征并结合真菌的ITS序列进行菌株鉴定。初步从栽培三七中共分离得到内生真菌24株,鉴定为12属（种）,栽培三七不同器官组织的内生真菌种类和数量差异较大,根和叶中最多,茎中较少。其中从叶片中分离出11株,6属;茎中分离出1株,1属;根中12株,5属。统计结果表明叶片中分离出的菌株优势种为普通青霉菌(Penicillium commune)、胶孢刺盘孢菌(Colletotrichum gloeosporioides),均占叶片菌株分离的27.28%;须根中分离出的菌株优势种为球毛壳菌(Chaetomidium arxii),占须根菌株分离的72.73%。栽培三七内生真菌具有丰富的生物多样性,实验结果为进一步探讨栽培三七内生真菌与生理活性物质之间的关系提供材料基础和实验参数。     

濒危药用植物沙冬青内生真菌分离及其抑菌活性初步研究

为探明濒危药用植物沙冬青内生真菌资源的多样性及其抑菌活性特征,通过组织块法对内生真菌进行了分离,并选择小麦全蚀病菌、枸杞黑果病菌、番茄灰霉病菌、黄瓜枯萎病菌、黄瓜立枯病菌5种植物病原真菌和枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌4种细菌作为指示菌,采用对峙法和改进的菌块法测定抑菌活性。结果显示,从沙冬青不同组织器官中分离出41株内生真菌,根部最多,其次为叶部,茎部最少,经形态学初步分类鉴定归于5个目,6个科,19个属;有31株菌对2种或多种指示菌有不同程度的抑制作用,占菌株总数的75.6%,15株内生真菌对1种或多种供试细菌指示菌具有不同程度的抑制作用,占分离菌株总数的36.6%,其中5株内生真菌分别对4种植物病原真菌指示菌具有明显的抑制作用,占菌株总数的12.2%,8株内生真菌对1种供试细菌指示菌有明显的抑制作用,占分离菌株总数的19.5%, 4株内生真菌菌株即对供试植物病原真菌指示菌又对供试细菌指示菌有明显抑制作用, 抑菌范围宽,属于青霉属、束丝菌属、茎叶核菌属。濒危药用植物沙冬青具有丰富的内生真菌资源,其开发和利用具有重要的生态学意义和经济价值。     

盐碱地引种沙枣根瘤内生菌及根际土壤AM真菌的多样性

为了揭示黑龙江省盐碱地引种沙枣根瘤内生菌及根际土壤丛枝菌根(Arbuscular Mycorrhizal,AM)真菌的多样性,采用根瘤切片法和湿筛法并结合分子生物学手段对沙枣根瘤内生菌及根际土壤中的AM真菌进行分离、鉴定和多样性分析。研究结果表明:从沙枣根瘤内成功地分离和鉴定出了27个纯菌株,其中放线菌4株、细菌14株、真菌9株,内生细菌的多样性指数最为丰富,与根瘤形成有关的内生放线菌多样性指数最低,但放线菌类群中Frankia sp.(代号H01)菌株优势度指数和均匀度指数最高;从沙枣根际土壤中共分离和鉴定出5属8株AM真菌,Glomus属有3株,Funneliformis属有2株,Septoglomus属有1株,Rhizophagus属有1株,Acaulospora属有1株。Rhizophagus intraradices在样品中的分离频度达到了100%,孢子密度高达48.5个/50 g土,是典型的优势菌株。在沙枣苗木菌根化及根瘤化培育过程中,Frankia sp.(H01)和Rhizophagus intraradices可作为重要的候选菌株。