齐口裂腹鱼感染嗜水气单胞菌后血清指标的变化

给体质量380~420g的齐口裂腹鱼腹腔注射密度为2.0×108 cfu/mL的嗜水气单胞菌液后6、12、24、48、72、90h,尾静脉抽取血液,测定其血清超氧化物歧化酶活性、总抗氧化能力、黄嘌呤氧化酶和过氧化氢酶的活性指标。结果显示,齐口裂腹鱼在感染72h后出现明显的发病症状,腹部肿大,胸鳍、腹鳍基部出血;在感染90h内活力先升后降,在12h上升出现极显著性差异(P0.01)。感染初期总抗氧化能力开始上升,48h达到峰值后下降。感染后过氧化氧酶活性明显增强,但在48h后逐渐下降。在感染90h内,黄嘌呤氧化酶指标呈直线上升趋势。表明血清指标可作为判定齐口裂腹鱼感染细菌的参考指标。     

齐口裂腹鱼染色体核型和同工酶初步研究

对齐口裂腹鱼(Schizothoraxprenanti)的形态特征、染色体核型和同工酶组织特异性进行了观察和分析。结果显示:齐口裂腹鱼形态学可数性状为背鳍Ⅲ-8,腹鳍Ⅰ-9～10,臀鳍Ⅱ～Ⅲ-5,侧线鳞90～109,侧线上鳞17～24,侧线下鳞14～19,鳃耙数为外侧:14～23,内侧:19～31;其染色体数为2n=132,核型为34m+30sm+24st+44t,臂数NF=196。乳酸脱氢酶(LDH)、酯酶(EST)、醇脱氢酶(ADH)、苹果酸脱氢酶(MDH)、过氧化物酶(POD)、谷氨酸脱氢酶(GDH)6种同工酶谱在齐口裂腹鱼中有明显的组织特异性。     

齐口裂腹鱼HMGB1基因克隆及其对嗜水气单胞菌胁迫的响应

为了解齐口裂腹鱼高迁移率蛋白B1（Schizothorax prenanti high mobility group box 1,SpHMGB1）的序列特征及其与嗜水气单胞菌胁迫的相关性,实验根据齐口裂腹鱼脾脏TSA库中获得的序列设计引物,采用克隆技术克隆SpHMGB1的核心序列并进行生物信息学分析,采用实时荧光定量PCR（qPCR）技术检测嗜水气单胞菌在体和离体胁迫后组织和巨噬细胞中SpHMGB1的响应情况。序列分析结果显示,SpHMGB1开放阅读框长为615 bp,编码204个氨基酸,理论分子量为23.5 ku,等电点为6.79,包含2个基本的HMG盒：A盒和B盒,以及一个酸性尾巴。SpHMGB1二级结构主要由47.06%的α-螺旋和50%的无规则卷曲构成。系统进化树分析显示,SpHMGB1与鱼类HMGB1聚为一支,与斑马鱼和鲫的亲缘关系最近,氨基酸一致性分别为90.7%和90.4%。qPCR检测结果显示,嗜水气单胞菌感染后SpHMGB1具有不同的时空表达趋势,其中血液在72 h表达量最高,肾脏在6 h表达量最高,脾脏在120 h表达量最高;热灭活嗜水气单胞菌刺激巨噬细胞后,SpHMGB1的表达量在0.5~24 h下调,24 h表达量最低,细胞因子IL-1β和TNF-α表达量均有上调趋势。qPCR检测结果提示,SpHMGB1可能参与齐口裂腹鱼细菌感染后的免疫响应。本实验可为进一步研究SpHMGB1在齐口裂腹鱼细菌性疾病中的免疫调节机制提供参考。     

齐口裂腹鱼败血症的病原分离与鉴定

从发生败血症的齐口裂腹鱼体内分离出2株致病菌，通过细菌的形态特征、培养特性和生化实验鉴定为嗜水气单胞菌和温和气单胞菌。经人工感染健康鱼表现出与自然病鱼相同的症状，并从人工感染死亡鱼中分离获得同种细菌，证实齐口裂腹鱼败血症的病原为嗜水气单胞菌和温和气单胞菌。药敏实验结果表明新霉素、头孢三嗪、庆大霉素对其高度敏感，红霉素、羧苄青霉素、氮苄青霉素和磺胺等不敏感。     

神农架齐口裂腹鱼繁殖生物学特征与人工繁殖技术

2010—2013年,对神农架林区玉泉河、长坊河的齐口裂腹鱼(Schizothorax prenanti)的生物学进行了调查,并对其人工繁殖技术进行了多次尝试。对166尾野生齐口裂腹鱼样本的生物学研究表明:神农架齐口裂腹鱼在自然环境中生长缓慢;雌雄性比为1.79∶1;卵径在2.05~3.13 mm之间,平均值为(2.68±0.448)mm;Ⅳ期卵巢成熟系数4.90%~19.44%,平均(11.12±5.07)%;绝对繁殖力在1 316~11 070粒之间,平均(4 259±2886)粒,相对繁殖力为(12.83±5.67)粒/g。流水池塘培育齐口裂腹鱼,运用雌鱼尾柄粗糙程度判断雌鱼成熟度,选择成熟度好的雌雄亲鱼,用LHRH-A2和鲤脑垂体人工催产,有效催产剂量为LHRH-A2(30~40)μg/kg+鲤鱼脑垂体(2.5~3.0)mg/kg;单用LHRH-A2为60μg/kg。适时人工授精,受精卵在孵化箱内孵化。2010~2013年,共计催产18批次,结果为:催产率89.12%,受精率90.11%,孵化率88.32%。     

香鱼嗜水气单胞菌人工染病后血液生理生化指标变化

从患病香鱼的体腔液中分离获得嗜水气单胞菌病原,经培养稀释的菌液,腹腔注射人工感染健康香鱼,出现典型的出血症后,进行血液生理生化指标的测定。结果发现,病鱼红细胞数量为(1.21±0.08)×1012个/L,血栓细胞数量(189.00±5.19)×1012个/L,较健康香鱼红细胞[(2.41±0.16)×1012个/L]、血栓细胞[(380.0±20.00)×1012个/L]呈极显著降低(P0.01),血红蛋白含量呈显著减少(P0.05),而白细胞数量却显著增加(P0.05)。染病香鱼总蛋白为(47.56±2.63)g/L,健康鱼为(49.23±3.06)g/L,经检验无显著差异;而碱性磷酸酶、Cl-、Ca2+等3项血液生化指标值均呈极显著减少(P0.01),乳酸脱氢酶呈极显著增加(P0.01)。     

不同来源嗜水气单胞菌耐药基因检测

采用PCR方法,对分离于唐山和秦皇岛养殖场的宽体金线蛭(Whitmania pigra)、中国林蛙(Rana temporaria chensinensis)、牙鲆(Paralichthys olivaceus)、草鱼(Ctenopharyngodon idellua)、青鱼(Mylopharyngodon piceus)以及鲤(Cyprinus carpio)肝脏的42株不同水产养殖动物的致病性嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)进行了4种耐药基因β-内酰胺类(TEM)、氨基糖苷类(ant(3″)-I)、磺胺类(Sul3)和四环素类(tet(A))的检测。结果表明:42株嗜水气单胞菌均100%携带TEM、ant(3″)-I和Sul3,不携带tet(A)。所检不同水产动物源嗜水气单胞菌均携带TEM、ant(3″)-I及Sul3耐药基因,从分子层面表明该致病菌多重耐药或潜在耐药严重。     

嗜水气单胞菌源黄鳝出血病的组织病理学研究

应用组织学方法研究了分离自患出血病黄鳝(Monopterus albus)体内的嗜水气单胞菌(Aermonas hydrophila)人工感染健康黄鳝后引起的组织病理学变化。结果显示:健康黄鳝感染嗜水气单胞菌后发病呈急性过程,感染后15~33 h为发病死亡高峰期。黄鳝人工感染后出现的临床症状与自然发病病例相似,主要表现:体表出现出血斑、肛门红肿、腹腔充血以及各实质性器官出血、充血。人工感染黄鳝的肝脏、脾脏和肾脏的病理变化明显:肝脏出现广泛的充血、出血,肝细胞出现空泡变性、坏死;肾脏肾小管上皮的肿胀、结构的消失,肾小球出血、变性坏死;脾脏充血、出血;肠粘膜上皮脱落,基底膜排列紊乱,大量出血。结果表明,嗜水气单胞菌感染黄鳝后的病理变化主要表现为肝脏、肾脏等实质性器官充血、出血,及广泛的组织细胞变性和坏死。     

嗜水气单胞菌对鲤鱼血液指标的影响

以嗜水气单胞菌感染健康鲤鱼,与对照组相比较,结果表明:红细胞脆性、白细胞计数极显著增加;红细胞计数、血红蛋白显著降低;血沉速率加快明显;红细胞显著大于正常值但红细胞核大小无明显变化。感染鲤生化指标变化也很显著,总蛋白极显著低于对照组;谷丙转氨酶极显著升高;甘油三酯下降也十分明显。     

100种中草药体外抑杀嗜水气单胞菌的药效研究

用琼脂扩散法(打孔法)测定了诃子等100种中草药对嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)的抑制作用,并用二倍稀释法测定抑菌效果较强的48种中草药对嗜水气单胞菌的最小抑菌(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)。结果显示∶大部分中草药对嗜水气单胞菌有抑制作用,诃子和秦皮的抑杀效果最好,其抑菌圈直径达20 mm以上,MIC和MBC相同,都为3.91 mg/mL(诃子)和7.81 mg/mL(秦皮);红藤、仙鹤草和覆盆子等13种中草药有中等强度的抑菌和杀菌效果;雷公藤等33种中草药抑菌作用弱;而牛蒡子等52种中草药无抑菌作用。     

齐口裂腹鱼维氏气单胞菌１６ＳｒＤＮＡ序列分析

报告齐口裂腹鱼病原菌的检测和生物学特性。从齐口裂腹鱼肠道中分离出菌株Spc0408, 采用常规形态特征的观察、生理生化试验、结合16SrDNA基因序列分析对其进行鉴定并构建系统发育树。该菌为革兰氏染色呈阴性,短杆形,无芽孢。生化鉴定结果显示具该菌有动力性,H2S、尿素阴性、不发酵木糖、鼠李糖、山梨醇等;β-半乳糖苷酶、葡磷胨水、枸橼酸盐阳性等。菌株16SrDNA的长度为1443 bp,登录号为JF929912,其和Genbank中多株维氏气单胞菌相似性高达97%,系统发育树显示菌株Spc0408和多株维氏气单胞菌聚为一簇。结合分离菌的表型特征及分子鉴定结果,可以判定该菌株在分类上属于维氏气单胞菌,本研究可以对相关病原菌的分类鉴定提供参考。     

饲料中豆粕蛋白替代鱼粉蛋白对齐口裂腹鱼幼鱼生长性能、体成分及血液生化指标的影响

试验分别以豆粕替代0(对照组)、20%、40%、60%、80%、100%的鱼粉蛋白设计出6种等氮等能的饲料配方, 按照配方配制试验饲料(A1、A2、A3、A4、A5和A6)。将540尾体质量为(14.67±0.51) g的齐口裂腹鱼随机分为6个试验组, 每组3个重复, 每个重复30尾试验鱼, 分别投喂6种不同的试验饲料, 养殖时间为45 d。结果表明, 豆粕蛋白替代水平对齐口裂腹鱼的生长有显著影响。豆粕替代鱼粉蛋白的比例为60%时, 试验鱼的增重率(WGR)、特定生长率(SGR)、饲料蛋白效率(PER)均达到最高(分别为118.08%、1.95%/d和207.22%), 饵料系数(FCR)最小(1.27)(P<0.05)。与其余各试验组相比, 替代比例为100%的试验组的WGR、SGR、PER显著降低, FCR显著升高(P<0.05)。通过二次多项式回归分析可知, 齐口裂腹鱼生长性能最佳时豆粕蛋白替代比例为34.25%~45.46%; 随着豆粕替代鱼粉蛋白比例的增大, 鱼体水分、粗灰分、肥满度差异不显著(P>0.05), 粗蛋白在豆粕蛋白替代水平为60%时达到最高(15.53%), 但在豆粕蛋白替代比例小于80%时试验鱼体粗蛋白、粗脂肪含量无显著差异(P>0.05), 肝体指数则随豆粕蛋白替代水平增加而增大, 但在0~80%之间均无显著差异(P>0.05)。随着豆粕蛋白替代比例的增加, 超氧化歧化酶(SOD)的活性有一定的波动, 在豆粕蛋白替代比例为40%达到最高, 豆粕蛋白替代比例在20%~60%时, 溶菌酶(LSZ)的活性逐渐升高, 但各组间及与对照组间的差异不显著(P>0.05), 谷草转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT)随着豆粕替代比例增加而逐渐升高, 但豆粕蛋白替代比例小于80%时差异不显著(P>0.05)。豆粕蛋白替代比例为100%时AST、ALT活性显著高于其余各试验组(P<0.05)。说明饲料中豆粕替代一定比例的鱼粉蛋白可促进齐口裂腹鱼的生长, 提高对饲料蛋白的代谢和免疫能力, 但豆粕替代鱼粉蛋白比例超过80%则可引起肝损伤或组织病变。在本试验条件下, 综合考虑其生长指标、体成分及免疫指标, 齐口裂腹鱼的饲料中豆粕对鱼粉蛋白的最大替代比例为80%, 当其替代比例为34.25%~45.46%时可获得最佳生长效果。     

齐口裂腹鱼生长激素基因全长cDNA克隆与序列分析

鱼类生长激素是一种单一肽链蛋白激素,主要作用是促进机体的生长.采用RT-PCR方法,首次从齐口裂腹鱼(Schizothorax prenanti)脑垂体总RNA中克隆出生长激素(gFowth hormone,GH)cDNA的开放阅读框ORF(open reading frame)序列,全长633bp.经DNA Star软件分析,该基因编码210个氨基酸,分子量为23.55 kD,等电点为5.46,含有1个疏水区和1个N-糖基化位点.空间结构含有4个α螺旋和4个β折叠,形成2个二硫键.序列比较发现,齐口裂腹鱼GH与草鱼、鲤的GH同源性分别为99.8%、99.4%;与黄鳝、花鲈和大黄鱼的GH同源性分别为57.4%、63.5%和64.2%.     

齐口裂腹鱼无乳链球菌的分离鉴定及其感染的病理损伤

2012–2013年四川齐口裂腹鱼(Schizothorax prenanti)养殖场流行一种临床特征为突眼、体表出血和神经症状的传染病, 在肝、肾涂片检查中发现链状G⁺球菌。从自然发病齐口裂腹鱼分离到2株形态与涂片检查一致的G⁺球菌(DML120817, YZH130830), 其在脑心浸液培养基(BHI)平板上28℃培养48 h, 形成白色圆形、表面光滑、边缘整齐的针尖大小菌落。经人工感染实验证实分离菌株为该病的病原菌。根据分离菌株的形态学和生理生化检测结果初步判定其为无乳链球菌(Streptococcus agalactiae); 16S rRNA基因序列分析表明, 2分离株 (GenBank登录号分别为KF773744和KF761304) 与GenBank中无乳链球菌(S. agalactiae)16S rDNA序列同源性达96.5%以上。在以分离菌16S rDNA序列 (GenBank登录号分别为KF773744和KF761304) 及其GenBank中同源性较高的链球菌16S rDNA序列构建的系统发育树上, 分离菌与无乳链球菌聚为一族; 同时在基于无乳链球菌cfb基因进行的特异性PCR检测中, 分离菌均为阳性, 进而鉴定2株分离菌为无乳链球菌。2株无乳链球菌对强力霉素、阿莫西林、先锋霉素V、氧氟沙星和左氧氟沙星等均敏感, 但在新霉素与丁胺卡拉霉素上存在差异。病理学观察发现, 无乳链球菌感染齐口裂腹鱼对多组织器官都造成明显的病理损伤, 尤其是肝、肾、脑的损伤较为严重, 表现为明显的变性、坏死以及炎症细胞浸润, 且细菌侵入肝、肾、脾以及神经元细胞内, 导致线粒体、内质网等细胞器损伤。     

网箱与微流水养殖的齐口裂腹鱼肌肉营养成分的比较与分析

本研究比较和分析网箱与微流水两种养殖模式下体质量(76.5±17.8)g和(67.2±8.1)g的齐口裂腹鱼Schizothorax prenanti肌肉常规营养成分。结果显示:两组齐口裂腹鱼肌肉中一般营养成分含量不存在显著性差异,均含有18种氨基酸;除色氨酸(Trp)和组氨酸(His)外,网箱组齐口裂腹鱼肌肉中其余氨基酸、氨基酸总量、必需氨基酸总量和鲜味氨基酸总量均显著低于微流水组。氨基酸评分(AAS)和化学评分(CS)结果显示:两组齐口裂腹鱼肌肉中必需氨基酸构成合理,色氨酸均为第一限制性氨基酸,赖氨酸在必需氨基酸中评分最高。两组齐口裂腹鱼肌肉中均含有21种脂肪酸,网箱组饱和脂肪酸(SFA)总量和单不饱和脂肪酸(MUFA)含量显著低于微流水组,而多不饱和脂肪酸(PUFA)含量显著高于微流水组,且n-3/n-6比值要高于网箱组。综上所述,微流水养殖的齐口裂腹鱼营养价值更高。     

免疫增强剂对齐口裂腹鱼生长性能和免疫功能的影响

为探究饲料中添加免疫增强剂对齐口裂腹鱼(Schizothorax prenanti)生长性能及免疫功能的影响,在基础饲料中分别添加0.1%、0.2%和0.3%的枯草芽孢杆菌、酵母细胞壁多糖和酵母水解物,养殖初始体重(61.12±1.37) g的健康齐口裂腹鱼90 d。结果显示,相比对照组,枯草芽孢杆菌组和酵母细胞壁多糖实验组的齐口裂腹鱼增重率(WGR)和特定生长率(SGR)显著升高(P0.05),饵料系数(FCR)降低,且以酵母细胞壁多糖对提高齐口裂腹鱼生长性能效果最为明显。当添加剂量增加到0.3%时,酵母细胞壁多糖组增重率和特定生长率相比于其他两个梯度有显著性提高,而其他两个实验组差异不显著,酵母细胞水解物则能显著降低饵料系数;在免疫功能方面,3种免疫增强剂的3种浓度下,齐口裂腹鱼溶菌酶(LSZ)和超氧化物歧化酶(SOD)活性均显著高于对照组(P0.05),且以芽孢杆菌组效果最为显著,分别为(3.93±0.35)μg/mL和(153.34±1.50)μg/mg;而3个实验组碱性磷酸酶(ALP)活性与对照组相比差异不显著,且不同剂量组间不存在显著差异(P0.05)。当添加量为0.1%时,酵母细胞壁多糖组和酵母提取物组酸性磷酸酶(ACP)活性均显著低于对照组,当添加量为0.3%时,3个实验组酸性磷酸酶(ACP)活性均显著高于对照组(P0.05)。研究表明,酵母细胞壁多糖对促进齐口裂腹鱼生长效果最好,而枯草芽孢杆菌对提高鱼类的免疫功能最好。