CRISPR/Cas9技术在获取拟南芥双突变体材料中的应用

为了研究含双MATH结构域基因sb3与sb6的功能,需要创制这2个紧密连锁基因的双突变体。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对拟南芥Col-0中的sb3、sb6基因进行特异性定点双敲除。通过PCR和Singer测序验证,共获得10株T0代转基因植株,其中5株在目标片段上没有发生编辑;另5株在sb3基因上的目标序列都发生了编辑,在sb6基因的目标序列上只有2株发生了编辑。至此成功获得了sb3与sb6基因双敲除的突变体,且获得该突变的类型为核苷酸缺失突变体。这个双突变体的获得为进一步研究双MATH结构域基因在拟南芥中的功能奠定了良好的基础。     

利用CRISPR/Cas9系统创制紧密连锁的M320与M330基因双突变体

为了研究含有多MATH结构域基因的功能,本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑系统对拟南芥中两个紧密连锁的功能冗余基因M320(AT2G25320)和M330(AT2G25330)进行共敲除,获得了之前通过杂交无法获得的多MATH结构域基因双突变体材料。通过构建针对M320和M330基因的CRISPR/Cas9共敲除质粒,借助农杆菌介导的浸花法成功转化野生型拟南芥Col-0。最终测序验证显示多MATH结构域基因被成功敲除。M320、M330以及这两个基因同时被敲除的成功率分别是5.13%、17.95%和2.56%;通过测序分析发现突变体共产生了3种可造成移码突变的杂合突变类型:分别为在靶位点插入一个A或T以及缺失一个G。本研究为我们解析多MATH结构域基因的功能提供了材料基础,同时为紧密连锁基因的功能研究提供了创制突变体的有效方法。     

拟南芥SB10基因在耐盐中的功能研究

为了研究拟南芥SB10基因在耐盐中的功能,我们利用CRISPR/Cas9技术构建载体敲除SB10基因,对转基因植株进行筛选成功获得SB10基因沉默的突变体材料。本研究通过观察突变体根长及萌发率等表型,测定突变体植株脯氨酸含量相关的抗逆生理指标,研究拟南芥SB10基因在耐盐中的功能。结果显示:NaCl胁迫下,sb10突变体的根长和萌发率明显高于野生型拟南芥,sb10突变体拟南芥植物体内脯氨酸含量明显高于野生型拟南芥。说明SB10基因功能的缺失可提高拟南芥植株的耐盐能力。该研究为SB10基因参与拟南芥植株耐盐中的分子作用途径及分析提供线索。     

利用CRISPR-Cas9技术制备水稻LOC＿Os01g07170突变体

在真核生物中,HORMA结构域具高度保守性,含HORMA结构的蛋白在细胞减数分裂中具有重要作用。LOC_Os01g07170蛋白具有HORMA结构域,系统进化树分析表明该蛋白与拟南芥ASY1相似度较高,且该基因在生殖器官大量表达,推测LOC_Os01g07170基因可能参与细胞的减数分裂。本研究利用CRISPR-Cas9技术对LOC_Os01g07170基因进行敲除,在该基因上设计了两个靶位点,构建LOC_Os01g07170基因敲除载体,采用农杆菌介导的方法转化水稻粳稻品种9522,获得T0代转基因苗。结果显示突变靶点1处共获得7棵转基因苗,鉴定得到3株纯合突变体,突变类型为在第3个外显子的第1 137号碱基缺失1个C碱基;突变靶点2处共获得11株转基因苗,有4株纯合突变体,突变类型为在第4个外显子的第1 501号碱基处插入1个C碱基。分析氨基酸序列,发现这2种突变株系都存在移码突变而使氨基酸翻译提前终止。本研究成功利用CRISPR-Cas9基因编辑技术获得了水稻LOC_Os01g07170基因的两个突变类型的株系,为进一步研究LOC_Os01g07170基因功能提供了遗传材料。     

利用CRISPR-Cas9基因编辑技术获得AtLCR67基因敲除突变体

拟南芥AtLCR67基因属于低分子量富含半胱氨酸(low-molecular-weight cysteine-rich,LCR)基因家族。在正常生长条件下,该基因在发育的种子中特异表达。为了研究该基因在发育或代谢过程中的可能作用,在没有合适T-DNA插入突变缺乏的情况下,我们利用CRISPR-Cas9定向敲除技术来创制该基因沉默的拟南芥突变体材料。通过构建AtLCR67基因的CRISPR-Cas9敲除质粒,借助农杆菌介导的浸花法转化野生型拟南芥Col-0,最终获得12株T0代转基因植株。对T0转基因植株的AtLCR67基因进行测序分析发现,在设计的靶位点处存在短片段缺失12个碱基和增加一个T碱基两种突变类型,进一步做RT-PCR检测分析发现突变体中AtLCR67基因完全不表达,说明成功获得拟南芥lcr67突变体。突变体材料的获得为进一步研究AtLCR67基因在发育或代谢方面的的功能奠定了良好基础。     

陆地棉GhCRE1影响种子萌发初探

为明确陆地棉细胞分裂素受体基因(GhCRE1)在调控植物生长发育中的功能,为研究陆地棉GhCRE1基因调控种子萌发的分子机理提供材料,进一步从分子水平上提高种子萌发率,通过克隆陆地棉GhCRE1基因,利用基因过表达技术将该克隆片段连接至含Ubiquitin启动子的pCUbi1390载体上构建该基因的过表达载体,同时利用CRISPR/Cas9基因编辑技术设计拟南芥CRE1基因的sgRNA片段,合成sgRNA核苷酸序列,从而构建拟南芥CRE1基因靶向敲除载体。将以上2种载体转化农杆菌,使用花序浸染法,以拟南芥为受体材料创建GhCRE1过表达株系及基因编辑功能缺失突变体。接着利用PCR技术和qPCR技术筛选鉴定获得过量表达的GhCRE1拟南芥株系及CRE1功能缺失的拟南芥株系并收获种子,经过对比统计收获的种子与野生型种子在1/2MS培养基上的萌发势进行表型分析,进一步明确陆地棉GhCRE1基因影响种子萌发的功能。结果显示,本研究成功获得了拟南芥GhCRE1过表达株系及CRISPR基因编辑功能缺失突变体株系,且通过数据整理后发现,在种子萌发第2天时,相比野生型,2个过表达转基因株系萌发势分别提...     

CRISPR/Cas9介导靶向敲除拟南芥REVOLUTA基因突变体的鉴定

CRISPR/Cas9系统可对植物的内源基因进行定点编辑,为获得基因缺失突变体提供了新的工具。HD-ZipⅢ家族成员REVOLUTA(REV)是植物发育过程中的关键转录因子。本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对拟南芥REV进行特异性定点编辑,构建REV基因编辑表达载体,并利用农杆菌介导的花序浸染法将其转入拟南芥。经潮霉素抗性平板筛选和PCR扩增及测序鉴定,获得7棵转基因株系。对转基因植株REV基因的测序结果显示,有3株均成功在靶点1处产生编辑,且其中1株在靶点2处也成功编辑。该基因编辑突变体的获得为后续深入研究REV基因在拟南芥形态发育过程中的作用提供了新的遗传材料。     

利用CRISPR-Cas9基因编辑技术获得水稻OsWOX9C基因突变体

WUSCHEL-Related HOMEOBOX(WOX)基因家族是植物所特有的一类转录因子基因家族,该家族成员在植物发育的不同过程中发挥了重要的调节功能。相比于双子叶模式植物拟南芥,对于单子叶模式植物水稻中WOX基因家族成员功能的了解还很不充分。水稻DWT1/OsWOX9隶属于WOX基因家族的中间支,该基因在水稻主穗和分蘖穗的协同生长中起到了重要的调节作用。OsWOX9B和OsWOX9C是水稻中与DWT1/OsWOX9最为同源的基因,并具有相似的表达模式,但是否具有相似的生物学功能尚不清除。为了研究水稻WOX基因家族成员OsWOX9C的功能,我们利用CRISPR-Cas9基因编辑体系,设计了水稻WOX家族基因OsWOX9C(LOC_Os05g48990)的敲除靶点,构建了OsWOX9C基因的敲除载体。通过对OsWOX9C基因序列分析,将合成的靶点序列插入p BIN-sg R-Cas9-Os载体中,构建p BIN-sg R-Cas9-Os-Target载体,通过农杆菌介导的方法转化水稻品种9522。从5株T0代转基因苗中鉴定出1株OsWOX9C突变的杂合突变体,并通过对自交分离群体的测序分析,筛选出OsWOX9C的四种突变类型。这四种突变体的突变位点均在外显子第146位碱基处,包括插入碱基A或T的两种纯合突变类型,以及插入A/T或C/T的两种双等位突变类型。通过蛋白序列分析,发现这四种突变株系均导致移码而使氨基酸提前终止致使基因突变。本研究利用CRISPR-Cas9基因编辑技术获得了水稻OsWOX9C基因的敲除突变体,为进一步研究OsWOX9C基因的功能提供了重要的遗传材料。     

利用CRISPR-Cas9基因编辑技术获得水稻OsMADS56基因突变体

OsMADS56是水稻中长日照下的开花抑制基因,与拟南芥中同时影响开花时间和花发育的SOC1同源。为了深入探究OsMADS56基因对水稻开花时间的调控功能,本研究利用反向遗传学的方法通过CRISPR/Cas9基因编辑技术对OsMADS56基因设计了2个特异性敲除靶位点,构建了OsMADS56基因敲除载体,并通过农杆菌介导的转化方法成功获得了野生型粳稻9522背景的转基因苗。鉴定结果显示9棵OsMADS56转基因苗中包含了3种纯合突变类型,包括第一个外显子第45号碱基处缺失了一个G碱基、缺失了包含了第一个起始密码子的100个碱基对以及在第5个外显子第322号碱基处插入一个A碱基。通过蛋白序列比对分析,发现这三种类型的突变均造成移码突变和蛋白翻译提前终止引起保守结构域的缺失。本研究获得的水稻OsMADS56基因的三个突变体株系对今后进一步深入研究该基因的功能具有重要意义。     

甘蓝型油菜含MATH结构域基因BnaM154过表达载体的构建与转化

编码含MATH结构域(Meprin and TRAF homology domain)的基因目前在油菜中研究较少。本研究以甘蓝型油菜‘湘油15’(XY15)种子发育35 d抑制差减(suppression subtractive hybridization, SSH)文库为基础,进一步筛选获得实际编码中有两个连续MATH结构域的功能未知基因,该基因全长DNA序列为1 800 bp,我们将其命名为BnaM154。将目的片段克隆后插入表达载体pFGC5941-Nap中,成功构建了pFGC5941-Nap::BnaM154过表达载体。利用农杆菌介导的甘蓝型油菜下胚轴遗传转化方法,成功获得8株稳定遗传的转基因苗,为进一步研究BnaM154基因在甘蓝型油菜中的功能提供了科学依据。     

甘蓝型油菜BnaABI4基因CRISPR/Cas9编辑载体的构建及甘蓝型油菜转化

ABI4(Abscisicacid-insensitive4)是ABA响应途径中重要的转录因子。本研究以甘蓝型油菜全基因组数据库为基础,借助拟南芥ABI4蛋白的氨基酸序列,通过序列比对,获得了甘蓝型油菜的2个BnaABI4,分别命名为BnaABI4-A (GenBank登录号为BnaA03g18970D)和BnaABI4-C (GenBank登录号为BnaC03g725-10D)。在这两个基因的CDS序列上寻找一段长度为20 bp、序列相同的片段作为基因编辑的目标位点,构建CRISPR/Cas9基因编辑载体pCAMBIA1300-sg RNA/Cas9-BnaABI4;借助根癌农杆菌介导的油菜下胚轴遗传转化法,成功将BnaABI4的基因编辑表达框转入甘蓝型油菜‘湘油15’中,共获得转基因植株13株,这将为深入研究甘蓝型油菜BnaABI4的生物学功能提供科学依据。     

转梭梭HaPrxQ基因拟南芥植株的获得与检测

HaPrxQ是参与活性氧清除的重要基因。根据已发表的过氧还蛋白基因序列,设计特异引物,扩增到完整的HaPrxQ基因;构建植物表达载体pCAMBIA2300-HaPrxQ,通过农杆菌介导转化拟南芥,获得转化植株种子。对收获的T0代种子进行卡那霉素抗性筛选,并通过PCR对抗性苗进行检测。结果表明,构建的载体成功转化拟南芥并获得了9份转HaPrxQ基因苗。     

异源表达细菌二氢喋呤合成酶基因提高拟南芥叶酸含量的研究

植物是人体叶酸的重要来源,人体缺乏叶酸会导致贫血、新生儿神经系统疾病,还与心血管病及某些癌症的发病有关,因此提高食用作物中叶酸的含量是代谢工程的研究目标之一。本研究将从细菌中分离到的编码二氢喋呤合成酶（DHPS）基因FolP,由35S启动子驱动在拟南芥线粒体中过量表达,获得了转基因植株,转基因植株叶酸总含量比野生型对照提高了48%,表明DHPS酶对植物叶酸的合成起着调控作用。     

CRISPR/Cas9介导的拟南芥TT1基因的敲除

在菜油品质上黄籽相较于褐籽更为优良,且更易于合成高质量的生物柴油。已有研究表明TT1(TRANSPARENT TESTA 1)基因是类黄酮代谢途径中的关键基因,为了通过CRISPR/Cas9基因编辑载体验证TT1基因在白菜型油菜中的功能,本研究先在拟南芥中进行了TT1基因的编辑。构建了CRISPR/Cas9 TT1基因编辑载体,通过农杆菌介导侵染拟南芥花序的遗传转化方式将编辑载体引入拟南芥Columbia生态型,通过表型观察发现T1代12株阳性苗中产生了11株表型株,其中1株表现为褐籽,2株表现为黄籽,9株表现为黄籽和褐籽的嵌合。测序检测分析其突变型结果发现,TT1靶位点处有单碱基缺失、单碱基插入、多个碱基缺失、碱基缺失后插入以及两个靶位点之间多个碱基缺失的多种突变类型。T2代获得一株纯合突变体,TT1两个靶位点之间产生79 bp的碱基缺失,且全株表现为黄籽。本研究为CRISPR/Cas9载体在白菜型油菜中TT1基因功能验证提供借鉴,并为其它作物TT1同源基因的功能验证提供了新的突变体材料。     

花生AhPLDα基因植物过表达载体构建及对拟南芥的遗传转化

为了明确花生AhPLDα基因在响应干旱胁迫信号传导中的功能和作用机制,以ABA处理的冀花4号花生叶片c DNA为模板,用RT-PCR方法扩增AhPLDα1和AhPLDα2的全长CDS片段,采用酶切-连接的方法分别将这2个基因定向克隆到植物表达载体p Bar-F3上,冻融法将重组子转入根癌农杆菌GV3101,利用改良Floral-dip法将过表达质粒转入拟南芥。菌落PCR和酶切结果表明,Ca MV35S启动子驱动的过表达载体重组质粒p Bar-AhPLDα构建正确。通过RT-PCR和qRT-PCR验证,表明AhPLDα1和AhPLDα2基因整合到拟南芥基因组中并能过量表达,获得了阳性转基因纯合株系。干旱胁迫试验表明,转基因植株的耐旱性较野生型明显增强。可见,AhPLDα基因参与了干旱胁迫应答过程,是转基因途径提高作物耐旱性的潜在候选基因。     

重叠延伸PCR技术在单碱基定点突变中的作用

氨基酸通透酶(amino acid permease,AAPs)是一种跨膜转运蛋白,广泛参与植物体内氨基酸的吸收与转运。本试验通过重叠延伸PCR技术对氨基酸通透酶基因进行单碱基定点突变,以便为今后研究植物对外源氮的吸收与利用率奠定基础。本研究根据Tair数据库中拟南芥AtAAP1基因序列,利用Primer Premier 5.0软件设计含有1个突变位点的2对互补的定点突变引物和1对带有pCAMBIA3301-GFP载体的多克隆位点的接头引物,以野生型拟南芥叶片的cDNA为模板,进行3次PCR扩增,将获得的突变基因片段连接到pCAMBIA3301-GFP载体上,转化DH5α感受态细胞。将筛选的阳性菌株送至公司测序,测序结果表明拟南芥AtAAP1基因的第908位碱基A突变为T,实现了单碱基定点突变,这与预计结果相同,说明成功依靠重叠延伸PCR技术做到目的基因的定点突变。该技术能方便快速地获得定点突变序列,为进一步研究AtAAP1基因的功能奠定了基础。     

植物乙烯受体及转基因育种研究进展

在对模式植物拟南芥的遗传学和分子生物学的深入研究中,获得了乙烯应答过程中大量的突变体,分离了编码乙烯受体的基因,其编码产物的结构和功能也已得到鉴定,一些乙烯受体基因已用于转基因植物的研究。本文对近几年已确认的乙烯受体基因突变体,对乙烯受体基因的遗传途径、表达模式及其编码产物的结构、功能及其相互关系做了综述。探讨了利用乙烯受体基因进行转基因植物研究的可行性。     

农杆菌介导法将高赖氨酸蛋白基因sb401导入水稻

培育高赖氨酸的水稻品种是提高稻米营养品质的重要途径。本研究利用农杆菌介导法将水稻胚乳特异表达启动子PGlu驱动的马铃薯花粉特异水溶性蛋白基因sb401导入粳稻品种日本晴和籼稻恢复系501R的幼胚愈伤组织中,以期提高水稻胚乳中赖氨酸的含量。经PCR检测,从70株T0再生植株中筛选出18株转基因植株(日本晴13株,501R5株)。对转基因植株的Southern blotting分析表明,sb401基因已经转入并整合进了水稻基因组中。测定10株T0代转基因植株成熟种子的总蛋白含量和赖氨酸含量,结果表明,有8株的总蛋白含量,5株的赖氨酸含量皆提高了20％以上;其中,8号样品(日本晴转基因植株)的种子总蛋白含量和赖氨酸含量分别为10．5％和0．383％,与对照相比分别提高了32．74％和35．34％,表明sb401基因在大部分转基因植株中的翻译水平上得到了比较有效的表达。     

rd29A启动子的克隆及提高烟草抗逆性的研究

根据GenBank上公布的rd29A基因序列(D13044),利用PCR方法从拟南芥(Arabidopsis thaliana)基因组DNA中扩增得到了rd29A基因的启动子片段.序列分析表明,该片段与D13044有99%的同源性,它包括了DRE等4种完整的顺式作用元件.与GUS基因融合构建双元植物表达载体pBI-rd.转基因烟草的GUS活性组织染色分析及Northern杂交分析均表明,3种胁迫处理均可诱导GUS基因大量表达.其中,15%PEG和0.5%NaCl胁迫处理的转基因烟草比0℃低温处理的转基因烟草的GUS表达量高,而未经胁迫处理的转基因烟草的GUS基因只有少量表达.这些结果表明,rd29A属胁迫诱导型启动子,当植物遭受逆境胁迫时,rd29A启动子可以驱动下游目的基因超量表达,这就为通过基因工程途径提高植物抗逆性奠定了基础.