利用CRISPR/Cas9技术创建OsCOL9水稻突变体

CRISPR/Cas9系统可对植物的内源基因进行有效定点编辑,为作物的遗传育种提供了新的方向。以感病水稻品种丽江为材料,抗病基因OsCOL9为靶基因,探索该系统对水稻内源基因定点编辑效率以及获得有研究意义的突变体。OsCOL9基因CDS序列全长1 266 bp,编码一个422 aa蛋白,分子量大小约为45.6 k Da,蛋白质结构的N端含有B-box结构域,C端含有CCT(CONSTANS、CONSTANS-Like、TOC1)结构域。设计4个长20 nt的guide RNAs(gRNAs)靶点,靶向编辑OsCOL9基因的CDS起始区域以及外显子的末端,分别由U3、U6a、U6b以及U6c启动子驱动,提取T1转基因植株的基因组DNA并对编辑位点附近的DNA片段进行序列分析。结果表明,T1材料中OsCOL9的碱基缺失数最多可达59 bp,突变次数最多可达11次,取得较好的基因编辑效果。同时本试验出现了脱靶效应,因此着重探讨了降低脱靶效应的方法。由于CRISPR/Cas9系统在进行基因编辑时没有外源基因的导入,加上该技术的快捷、简便,对生物技术与传统育种的结合具有重要实践意义。     

基于CRISPR/Cas9技术的水稻miR1866突变体构建

microRNA (miRNA)是长度为18～25个碱基的非编码单链RNA,在植物生长发育过程中起着重要的调节作用.水稻是世界上重要的粮食作物之一,近年来调控水稻生长发育的miRNA不断被发掘,但目前关于miR 1866的研究还比较少.本研究通过构建miR1866的CRISPR/Cas9表达载体,创制miR1866的突...     

CRISPR/Cas9基因编辑技术在玉米分子育种中的应用概述

玉米是我国第一大粮食作物,有效提升玉米产量和品质对保障我国粮食安全起着至关重要的作用。简要论述了CRISPR/Cas9 基因编辑技术研究历程、编辑类型和作用原理,以及在功能基因验证、玉米产量、品质改良和抗逆育种方面的应用,说明了在玉米基因组水平上进行基因定向编辑改造对玉米分子育种具有重要研究和应用价值。通过借鉴相关国家对基因编辑作物进行监管的措施,为不断完善我国的监管政策提出了一些对策建议。     

基于CRISPR/Cas9技术的水稻OsARF12突变体的构建

为研究水稻生长素响应因子OsARF12在水稻生长发育中的作用,通过CRISPR/Cas9基因编辑技术,设计OsARF122个不同外显子突变靶点,化学合成包括突变靶点的特异性序列,并与中间载体sgRNA连接进而与Cas9终载体重组获得OsARF122个不同突变靶点的表达载体.选取测序成功的单一克隆,利用农杆菌介导法导入粳...     

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建水稻OsABI5突变体

在水稻种植生产上,因其种子经常发芽率不齐,导致水稻直播困难,不仅影响水稻的生产成本还影响其产量,因此水稻直播的突出问题要保持优良的种子萌发力。ABA是种子萌发的抑制因子,它通过诱导ABI5的表达来抑制种子萌发,在种子正常萌发的过程中,随着种子吸胀和GA生物合成,ABA和ABI5的含量都迅速下降,促使种子萌发。本研究利用CRISPR/Cas9技术构建OsABI5突变体,以期提高种子的萌发率和萌发速度。通过农杆菌介导法将构建好的OsABI5敲除质粒转化‘日本晴’水稻的愈伤组织,经PCR和Western Blot鉴定筛选得到两株OsABI5弱表达的阳性突变株系。通过对osabi5-2突变体和‘日本晴’萌发表型的观察,发现osabi5-2突变体2 d发芽率显著高于‘日本晴’,二者4 d的萌发势也是osabi5-2突变体略高。本研究利用CRISPR/Cas9技术构建了OsABI5突变体,对研究水稻OsABI5调控种子萌发的分子机制具有重要意义。     

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建水稻OsSLR1敲除突变体

GA是种子萌发的促进因子,能解除种子休眠和刺激萌发,GA的信号通路可以通过对DELLA蛋白的去抑制作用来完成的。通过对不同物种的DELLA蛋白功能的研究,发现不同物种的DELLA蛋白的功能具有高度保守性,本实验主要研究水稻中的DELLA蛋白SLR1,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建OsSLR1基因敲除突变株。首先,通过对OsSLR1的结构和功能域进行分析比对,最终选择3个靶点;然后,利用重组法构建CRISPR/Cas9敲除载体;最后,通过农杆菌介导法,将敲除载体转染成熟的日本晴水稻愈伤,待培育出幼苗,通过PCR和Western Blot进行鉴定。最终筛选得到1株Os SLR1敲除突变株系slr1-1,通过观察突变体萌发表型,发现slr1-1突变体第2天发芽率显著高于日本晴,而且slr1-1突变体的生长速度显著快于日本晴。通过不同浓度PAC对slr1-1突变体萌发表型的影响,发现水稻的DELLA蛋白SLR1敲出的突变体种子萌发不受PAC抑制,表明OsSLR1是通过调控GA信号途径影响水稻种子的萌发,详细的调控机制和互作蛋白等还有待深入的研究。通过对SLR1调控GA信号通路控制水...     

利用可视化CRISPR/Cas9系统获得拟南芥Cas9-free突变体

CRISPR/Cas9是实现基因精准突变的有效工具而被广泛应用到功能基因组学研究中.通常需要在已编辑后代的基因组中剔除此编辑体系,以防Cas9进一步编辑导致复杂的脱靶效应.本研究利用可视化的CRISPR/Cas9基因编辑系统敲除拟南芥AtPAE4基因,测序结果显示AtPAE4在第一个外显子的第478号碱基前面插入了一个...     

CRISPR/Cas9介导的拟南芥TT1基因的敲除

在菜油品质上黄籽相较于褐籽更为优良,且更易于合成高质量的生物柴油。已有研究表明TT1(TRANSPARENT TESTA 1)基因是类黄酮代谢途径中的关键基因,为了通过CRISPR/Cas9基因编辑载体验证TT1基因在白菜型油菜中的功能,本研究先在拟南芥中进行了TT1基因的编辑。构建了CRISPR/Cas9 TT1基因编辑载体,通过农杆菌介导侵染拟南芥花序的遗传转化方式将编辑载体引入拟南芥Columbia生态型,通过表型观察发现T1代12株阳性苗中产生了11株表型株,其中1株表现为褐籽,2株表现为黄籽,9株表现为黄籽和褐籽的嵌合。测序检测分析其突变型结果发现,TT1靶位点处有单碱基缺失、单碱基插入、多个碱基缺失、碱基缺失后插入以及两个靶位点之间多个碱基缺失的多种突变类型。T2代获得一株纯合突变体,TT1两个靶位点之间产生79 bp的碱基缺失,且全株表现为黄籽。本研究为CRISPR/Cas9载体在白菜型油菜中TT1基因功能验证提供借鉴,并为其它作物TT1同源基因的功能验证提供了新的突变体材料。     

CRISPR/Cas9介导靶向敲除拟南芥REVOLUTA基因突变体的鉴定

CRISPR/Cas9系统可对植物的内源基因进行定点编辑,为获得基因缺失突变体提供了新的工具.HD-Zip Ⅲ家族成员REVOLUTA(REV)是植物发育过程中的关键转录因子.本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对拟南芥REV进行特异性定点编辑,构建REV基因编辑表达载体,并利用农杆菌介导的花序浸染法将其转入拟...     

CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术及其在作物品种改良中的应用

基因组编辑技术是用特殊的核酸酶对基因组进行精准修饰的一种新兴技术。2013 年研究人员发现了CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)系统,将其中的CRISPR/Cas9 系统成功改造成RNA引导的核酸内切酶,发展了CRISPR/Cas9 介导的基因组编辑技术。该技术能够对包括植物在内的几乎所有物种的基因组进行高效、精准的定点修饰,而且程序简易、操作方便灵活,加速了遗传工程、功能基因组学的研究,给生命科学的各个领域带来了革命性变化。本综述回顾了CRISPR/Cas9 的出现、改进与发展,简述了CRISPR/Cas9 介导的基因组编辑技术的作用机理,归纳总结了CRISPR/Cas9 介导的基因组编辑技术在作物品种改良、提高作物品质和产量中的应用,最后,分析了该技术在作物品种改良中的发展前景及应用价值,以期为合理利用该技术进行种质创新、品种改良提供理论依据。     

基于CRISPR/Cas9技术的水稻千粒重基因tgw6突变体的创建

利用CRISPR/Cas9技术对调控水稻产量千粒重基因TGW6定点编辑,获得了一套有重要育种价值的tgw6突变体。设计了分别由U3、U6a和U6b启动子驱动、长20 bp的guide RNA (gRNA)靶点以靶向编辑TGW6基因的外显子,首先将这3个靶点一起组装到pYLCRISPR/Cas9-MT(I)载体上,然后利用农杆菌介导侵染水稻材料H447 (R819/玉针香//R819的BC₃F₆);提取T₀代转基因植株的基因组DNA并对编辑位点附近的DNA片段进行PCR检测及测序分析。结果表明,T₀代材料中tgw6的突变频率高达90%,其中纯合缺失突变率约占51%。对T₁代纯合缺失突变体的千粒重性状的调查分析结果表明,部分tgw6的缺失突变能显著提高千粒重(大于5%)。不同类型tgw6突变体的成功创建不仅丰富了tgw6的变异类型,为水稻的高产稳产奠定了重要的材料基础,还证实了CRISPR/Cas9技术在水稻基因工程育种中高效、易操作的特点,具有重要的理论与实践意义。     

利用基因编辑技术改良水稻直链淀粉含量与香味

直链淀粉含量是稻米品质的理化指标之一,理想的稻米直链淀粉含量是13%~18%,有香味的稻米特别受消费者欢迎。本研究利用CRISPR/Cas9系统对Wx、Badh2(fgr)2个基因进行定突变,分别在Wx的5’UTR内含子剪切点和编码区序列(CDS)的第13外显子处设计靶点,Badh2的编码区序列(CDS)的第3和第9外显子处设计靶点,构建2个双靶点CRISPR/Cas9载体,通过遗传转化导入受体‘中早35’中,2个独立的转化事件分别得到14株和13株T0代转化苗,对T0突变情况分析表明,突变频率分别为57.1%,46.2%;对Wx基因编辑后产生的4个无转基因标记的T2代稳定株系进行直链淀粉含量测定,结果分别为12.2%、11.3%、7.4%、4.9%,比未编辑的对照‘中早35’(24.6%)大幅降低;同时对Badh2编辑后产生3个无转基因标记T2代稳定株系进行香气物质2-乙酰-1-吡咯啉(2-AP)含量测定,结果分别为228.16μg/kg,198.31μg/kg,2095.24μg/kg通过口嚼判断这3个株系确实有不同程度的香味,而没有香味的对照‘中早35’为0.000001μg/kg,以上所有株系的农艺性状与对照‘中早35’一致。综合结果表明,利用CRISPR/Cas9系统成功编辑水稻Wx、Badh2基因,获得了稳定遗传、较低直链淀粉含量且带有香味的突变体,为优质稻育种提供了新的种质资源和创建方法。     

一个CRISPR/Cas9-VQR基因编辑系统的构建

CRISPR/Cas9系统是一种广泛应用于细菌、酵母、动物和植物中的基因组定点编辑技术,但该编辑系统的使用范围受PAM (proto-spacer-motif)位点NGG的限制。本研究通过突变Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9)编码氨基酸(1135位的天冬氨酸D突变成缬氨酸V, 1335位的精氨酸R突变为谷胱氨酸Q, 1337位的苏氨酸T突变为精氨酸R,命名该突变子为Cas9-VQR)改造其识别PAM为NGA的位点以扩大其使用范围。并使用玉米Ubi启动子启动Cas9-VQR基因、优化SpCas9的密码子、加入保守的核定位信号序列、增加单子叶植物中保守的3′UTR序列和使用水稻U6启动子启动gRNA来修饰该编辑系统。结果表明Cas9-VQR系统能够识别PAM为NGA的位点,并进行有效的切割。体外酶切活性检测结果表明Cas9-VQR的切割效率为5%～70%。水稻转化检测结果表明Cas9-VQR的切割效率约为27.5%～70.5%,平均切割效率为46.23%。本研究拓宽了CRISPR/Cas9系统在作物中的使用范围,特别是NGA PAM位点较高的作物。     

大豆生物钟基因GmLNK1/2、GmRVE4/8和GmTOC1 CRISPR/Cas9组织表达分析及敲除靶点的鉴定

生物钟基因能够参与调控植物的整个生命进程,对提高作物产量具有重要的作用。LNK1(NIGHTLIGHTINDUCIBLE AND CLOCK-REGULATED 1)、LNK2、RVE4 (REVEILLE 4)、RVE8 (REVEILLE 8)和TOC1 (TIMING OF CAB EXPRESSION1)是植物中重要的生物钟基因。本研究利用BLAST同源比对和进化树分析的方法分别鉴定AtLNK1、AtLNK2、AtRVE4、AtRVE8和AtTOC1在大豆中的同源基因,通过qRT-PCR实验证明这些生物钟基因在大豆根、茎、叶等组织中均有表达。成功构建这些基因的CRISPR/Cas9敲除载体,并利用大豆根毛转化体系成功鉴定出13个基因的CRISPR/CAS9有效靶点。为进一步获得稳定的大豆突变体材料及研究其生物钟基因的功能提供了理论基础。     

基于CRISPR/Cas9技术的水稻温敏不育基因tms5突变体的构建

为创新优良温敏不育系, 促进两系杂交稻育种的发展, 我们以水稻温敏不育基因TMS5为编辑对象, 设计了由水稻U3启动子驱动、长20 bp的guide RNA (gRNA)靶点以靶向编辑 TMS5 基因的第1个外显子, 将靶点与表达载体pCAMBIA1301连接, 再用农杆菌介导法获得水稻转基因株系。提取T₀代转基因株系的基因组DNA, 并对TMS5编辑位点附近的DNA片段进行PCR检测及测序分析。结果表明, T₀代植株的突变率为63.89%, 其中纯合缺失突变率为34.78%。对T₁代纯合缺失突变体的不育起点温度和农艺性状调查分析结果表明, 28℃是tms5突变体花粉育性的转换温度。大田试验结果表明, 与野生型相比, tms5突变体的结实率和单株重均显著降低。粳稻tms5突变体的获得为培育粳稻不育系奠定了材料基础。