暗纹东方鲀抗苗勒氏管激素Ⅱ型受体基因的克隆、生物信息学及表达分析

为探究暗纹东方鲀(Takifugu obscures)抗苗勒氏管激素Ⅱ型受体(anti-Müllerian hormone receptorⅡ,Amhr2)基因的序列和结构信息,初步研究amhr2基因在性腺发育和性别分化过程中的作用,实验通过设计简并引物扩增及RACE技术,克隆出暗纹东方鲀amhr2完整的CDS区,分析其相应的生物信息学特征及其在不同组织和不同发育期的mRNA表达水平。结果表明:amhr2序列cDNA全长为1 868 bp(NCBI登录号:MH218814),编码513个氨基酸,与红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)同源性最高,达99%。氨基酸多重序列比对结果显示,Amhr2氨基酸序列中的近C-末端区域序列较为保守;通过构建系统进化树发现,暗纹东方鲀Amhr2与红鳍东方鲀亲缘关系最近。荧光定量PCR分析显示,暗纹东方鲀amhr2仅在性腺中表达,且卵巢中的表达量明显高于精巢;并且在性腺早期发育过程中,amhr2在精巢和卵巢中的表达量均呈现出先降低再迅速升高的表达趋势。研究结果表明,amhr2在暗纹东方鲀中的表达具有组织特异性,且在性别分化和性别维持等过程中发挥重要的作用。     

暗纹东方鲀Amhr2基因外显子9的SNP7271检测及其与性别相关分析

利用传统PCR和ABI 3730测序技术对暗纹东方鲀(Takifugu obscurus)Amhr2基因外显子9进行了SNP7271检测和测序分析,并对该SNP位点与暗纹东方鲀性别相关性进行了研究。结果显示,在SNP7271位点发生了G/C碱基突变,产生了CG、CC两种基因型。SNP7271和暗纹东方鲀性别存在显著相关性(P0.01)。基因型为CG的个体生理性别为雄性,基因型CC的个体生理性别为雌性。     

暗纹东方鲀芳香化酶基因的结构及表达分析

性腺型芳香化酶基因是一种调节雌雄激素平衡的基因。为初步探究暗纹东方鲀性腺型芳香化酶基因在性腺发育和性别分化过程中的作用,通过RACE及荧光定量PCR技术,成功克隆出暗纹东方鲀性腺型芳香化酶基因的cDNA全长序列,共1786 bp,编码514个氨基酸,与红鳍东方鲀及星点东方鲀同源性最高。氨基酸序列分析显示,该基因编码的蛋白是一种稳定的亲水性蛋白,但不存在信号肽序列;性腺型芳香化酶含有38个磷酸化位点、4个N-糖基化位点、2个跨膜保守结构域;其氨基酸序列在哺乳动物和鱼类中均十分保守,且含有跨膜区、Ⅰ-螺旋区、Ozol′s肽区、芳香化酶特异性保守区和亚铁血红素结合区等功能保守区。表达分析显示,暗纹东方鲀性腺型芳香化酶基因主要在肌肉和卵巢中表达,其次在其他组织中也有少量表达,而且在幼鱼不同发育期卵巢中的表达量呈现出逐渐升高再降低的表达趋势,在精巢中则基本不表达。研究结果表明,性腺型芳香化酶基因很可能参与了暗纹东方鲀雌鱼性腺分化后卵巢的发育、雌性特征的维持和其他组织的发育等过程。     

暗纹东方鲀心型脂肪酸结合蛋白H-FABP基因克隆与表达分析

为深入了解心型脂肪酸结合蛋白(heart-type fatty acid-binding protein,H-FABP)的结构与功能,采用RACE技术克隆得到暗纹东方鲀H-FABP的全长cDNA序列,共772 bp,开放阅读框为402 bp,编码133个氨基酸。生物信息学分析表明,暗纹东方鲀H-FABP基因具有一个脂质转运蛋白家族保守结构域和多个蛋白激酶磷酸化位点。NJ法系统进化分析显示,暗纹东方鲀与红鳍东方鲀亲缘关系最近,其次是鲈形目。经荧光定量PCR检测,H-FABP基因在暗纹东方鲀所有被检测的组织中都有表达,其中肝脏中的表达量最高,其次为肌肉和心脏,预示H-FABP主要参与脂肪酸氧化分解过程。为探究豆油作为脂肪源的可行性,采用不同比例(0、25%、50%和75%)豆油替代鱼油的饲料投喂初始体质量为(8.31±0.20)g的暗纹东方鲀8周。结果显示,全鱼油组肝脏中H-FABP基因的表达量显著高于50%豆油组和75%豆油组,但与25%豆油组无显著性差异,且随着饲料中豆油比例的增加,暗纹东方鲀肝脏中H-FABP基因的表达量呈下降趋势。研究表明,富含n-3多不饱和脂肪酸的鱼油可以促进脂肪酸氧化分解,能预防脂肪肝。因此,为不影响暗纹东方鲀肝脏脂肪代谢,饲料中豆油替代鱼油的比例应控制在50%以下。     

暗纹东方鲀线粒体DNA控制区结构和系统发育分析

以暗纹东方(Takifugu fasciatus)肝脏线粒体DNA为模板,参照GenBank中红鳍东方(Takifugu rubripes)线粒体DNA序列设计合成特异引物进行PCR扩增,获得了暗纹东方线粒体DNA控制区基因(818 bp)及5′端上游的tR-NAPro基因(71 bp)的全序列。控制区碱基组成为T32.2%,C 19.1%,A35.6%,G13.2%。对照其他已报道的鱼类控制区结构,对暗纹东方控制区的结构进行了分析,识别了其终止序列区、中央保守区和保守序列区,找到了终止相关的序列TAS以及保守序列(CSB1,CSB2,CSB3)。CSB1、CSB2序列相对保守,TAS与其回文基序可形成稳定的茎环结构,成为H-链复制延伸时的终止识别位点。同时运用DNA分析软件对暗纹东方与GenBank中其他10多种鱼类的mtDNA控制区序列进行比对,并选取东方属的7种鱼类mtDNA控制区序列构建分子系统树。结果显示控制区基因较适于科鱼类中同属不同种的系统发育分析。     

两种东方鲀的GH基因单核苷酸多态性分析

根据红鳍东方鲀生长激素基因全序列,设计13对引物,结合单链构象多态性(SSCP)技术和克隆测序技术对野生红鳍东方鲀、养殖红鳍东方鲀和养殖暗纹东方鲀群体进行了遗传多样性分析.结果表明:东方鲀整个生长激素基因的6个外显子中没有多态性,在其内含子2、内含子5以及3′侧翼区发现有多处序列变异位点,包括碱基的缺失、插入和一些单核苷酸突变.这些遗传多态性的存在为从分子水平上对东方鲀的鉴定提供了一定的依据.群体遗传结构分析结果表明,红鳍东方鲀养殖群体的一些等位基因丧失,造成其遗传多样性显著下降,应及早加强对其种质的保护.     

大鳍鳠 IL-1β基因cDNA克隆及表达分析

白细胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)作为炎症反应的关键介导物,通过开启基因的表达来调控免疫反应。为了丰富鱼类该基因的研究,实验采用RT-PCR和RACE-PCR技术,首次从鲇形目鱼类大鳍鳠中获得IL-1β基因cDNA的全序列。大鳍鳠IL-1β基因cDNA全长1 194 bp,包括3’非编码区域(UTR)为224 bp,5’UTR为82 bp,开放阅读框(ORF)为888 bp,编码296个氨基酸。预测的蛋白质分子量为33.843 43 ku,等电点为5.00。与斑点叉尾等其他8种脊椎动物进行同源性分析发现,大鳍鳠IL-1β氨基酸序列与斑点叉尾相似性最高,为79.0%,与原鸡的相似性最低,为22.0%。进化树分析表明,大鳍鳠IL-1β与斑点叉尾聚为一支。半定量PCR显示,大鳍鳠IL-1β基因在肌肉、脑、脾脏、头肾、体肾、胃、皮肤、肝脏及肠等组织中都有不同程度的表达;经嗜水气单胞菌刺激后大鳍鳠IL-1β基因在头肾和脾脏的转录表达显示,1 d后该基因在头肾与脾脏中的表达量都达到最大,15 d后恢复到刺激前的水平。研究显示,大鳍鳠IL-1β在抵御病原感染过程中发挥重要作用。     

暗纹东方鲀雌雄个体形态差异及其判别分析

为比较暗纹东方鲀(Takifugu fasciatus)雌雄个体之间的主要形态指标及形态差异,对296尾暗纹东方鲀的11项计量性状及11项比例性状进行了统计和分析.主成分分析结果显示,暗纹东方鲀22项形态指标可以划分为整体轮廓、整体及尾部的浑圆程度、头部特征、尾部长度比例4个方面,累积贡献率达72.31％.逐步判别分析...     

暗纹东方鲀越冬养殖试验

暗纹东方鲀(Takifugu obscurus)属硬骨鱼纲,辐鳍亚纲,棘鳍总目,鲀形目,鲀科,东方鲀属,其肉质洁白、细嫩,味道鲜美,享有“鱼中之王”的美誉,具有较高的经济价值。暗纹东方鲀为近海海域河川洄游鱼类,溯河性强。每年春末夏初,性成熟的亲鱼成群游入江河产卵,幼鱼在江河或通江湖泊中育肥,到翌年春季返回海里,在海里长大,到性成熟时再溯河到淡水中产卵。暗纹东方鲀为肉食性鱼类,在自然界中主食虾、蟹、螺、鱼苗、水生昆虫,是一种对盐度适应能力较强的鱼。近几年,随着暗纹东方鲀人工繁殖技术的突破和养殖技术的成熟,其养殖规模不断扩大。然而,由于…     

暗纹东方鲀血细胞发生的观察

通过对暗纹东方鲀(Takifugu obscurus)血液涂片及头肾、体肾、脾脏和肝脏四种脏器印片的光镜观察,发现血细胞的发育大致经过三个阶段,即原始阶段、幼稚阶段、成熟阶段。实验对不同发育阶段的红血细胞、淋巴细胞、单核细胞、粒细胞进行了观察和测量,并对暗纹东方鲀血细胞的发生过程做了初步探讨。实验结果表明暗纹东方鲀血细胞的发育主要在头肾和体肾,肝脏印片未观察到原始造血细胞,提示肝脏可能不是暗纹东方鲀的造血器官。     

大鳍鳠IL-1β基因cDNA克隆及表达分析

白细胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)作为炎症反应的关键介导物,通过开启基因的表达来调控免疫反应。为了丰富鱼类该基因的研究,实验采用RT-PCR和RACE-PCR技术,首次从鲇形目鱼类大鳍鳠中获得IL-1β基因cDNA的全序列。大鳍鳠IL-1β基因cDNA全长1 194 bp,包括3'非编码区域(UTR)为224 bp,5'UTR为82 bp,开放阅读框(ORF)为888 bp,编码296个氨基酸。预测的蛋白质分子量为33.843 43 ku,等电点为5.00。与斑点叉尾等其他8种脊椎动物进行同源性分析发现,大鳍鳠IL-1β氨基酸序列与斑点叉尾相似性最高,为79.0%,与原鸡的相似性最低,为22.0%。进化树分析表明,大鳍鳠IL-1β与斑点叉尾聚为一支。半定量PCR显示,大鳍鳠IL-1β基因在肌肉、脑、脾脏、头肾、体肾、胃、皮肤、肝脏及肠等组织中都有不同程度的表达;经嗜水气单胞菌刺激后大鳍鳠IL-1β基因在头肾和脾脏的转录表达显示,1 d后该基因在头肾与脾脏中的表达量都达到最大,15 d后恢复到刺激前的水平。研究显示,大鳍鳠IL-1β在抵御病原感染过程中发挥重要作用。     

中华鲟热休克蛋白hsp30基因cDNA的克隆及其在高温胁迫下的表达分析

实验克隆了中华鲟(Acipenser sinensis)热休克蛋白hsp30基因cDNA的全长、分析了其分子结构与特征,并研究了其在高温胁迫下的表达水平。结果显示,中华鲟hsp30基因cDNA序列全长为1 037 bp,其中开放阅读框(ORF)636 bp,5′端非编码区(5′UTR)38 bp,3′端非编码区(3′UTR)363 bp,共编码211个氨基酸。氨基酸多序列比对发现含有一个保守的α晶状体结构;系统进化分析显示,中华鲟HSP30与鱼类HSP30聚为一支,与小体鲟HSP30氨基酸序列相似性最高,为79%。荧光定量PCR结果表明,中华鲟hsp30基因在皮肤中的表达量最高,肝脏次之,在肠中的表达量最低。高温胁迫后,心脏、脾脏、肾脏和皮肤中hsp30基因表达量均显著增加,表明这些器官在中华鲟应对高温胁迫中可能起着重要作用。     

暗纹东方鲀线粒体细胞色素b及其侧翼tRNA基因的克隆与序列分析

以暗纹东方纯（Takifugu fasciatus）肝脏的线粒体DNA为模板，按照红鳍东方豚（Takifugu rubripes）线粒体DNA序列设计合成特异引物进行PCR扩增，克隆并测定线粒体细胞色素b（Cyt b）及其侧翼tRNA基因的全序列，结果显示，克隆的暗纹东方纯Cyt b基因（1137bp）及其5’端上游的tRNA^Glu基因和3’端下游的tRNA^Thr基因序列共1327 bp。用DNA分析软件对暗纹东方纯与GenBank中10个目13种鱼类的Cyt b序列进行比较分析，显示暗纹东方纯与这些鱼类的Cyt b基因具有较高的同源性，与同属红鳍东方纯的同源性最高，为96．1％；与同目不同科的矛尾翻车纯（Masturus lanceolatus）和翻车纯（Mola mola）的同源性分别为74．1％和74．8％。tRNA^Glu基因由69个碱基组成，tRNA^Thr基因由72个碱基组成，与红鳍东方纯相应tRNA的碱基组成完全相同。推定的这两种tRNA的二级结构都具有典型的三叶草型结构，各臂的碱基配对率高，稳定性好。根据暗纹东方纯与其他13种鱼的Cyt b基因序列同源性所建立的进化树比较，结果与传统的分类地位基本吻合。     

九孔鲍MSTN基因cDNA克隆及表达

肌肉生长抑制素(MSTN)是转化生长因子β超家族(TGF-β)中参与动物肌肉生长的重要调控因子。为了解MSTN基因在九孔鲍中的功能,本研究采用c DNA末端快速扩增(RACE)技术从九孔鲍右侧壳肌中获得了MSTN基因c DNA全长,并运用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)技术检测了MSTN在各组织和发育时期的表达水平。结果显示,九孔鲍c DNA全长3 755 bp,其中5′非编码区(5′UTR)324 bp,3′非编码区(3′UTR)1 985 bp,开放阅读框(ORF)1 446 bp,编码481个氨基酸,分子质量为54.96 ku,理论等电点p I为9.41;具有N端信号肽(1~17 aa)、TGF-β前肽区域(157~367 aa)和成熟肽区域(379~481 aa),以及蛋白酶水解位点RRPR(364~368 aa)和C端生物活性区9个保守的半胱氨酸残基,符合TGF-β超家族蛋白典型结构特征,且预测到2个新的蛋白酶水解位点RQRR(120~124 aa)、RYRR(235~239 aa)。系统进化树结果显示,九孔鲍MSTN基因和红鲍MSTN基因聚为一支。q RT-PCR结果表明,九孔鲍MSTN基因在检测的6个组织中均表达,且在足、右侧壳肌、外套膜中高表达,在鳃、性腺、肝脏中低表达;在检测的7个发育时期均表达且在受精卵、原肠胚、稚鲍时期高表达,在卵、4细胞期、8细胞期、幼鲍时期表达量较低。研究表明MSTN基因可能在九孔鲍肌肉生长中具有重要作用。     

玉米蛋白粉替代鱼粉对暗纹东方鲀溶菌酶活性及c型溶菌酶mRNA表达的影响

以初重为(41.26±1.09)g的暗纹东方鲀为实验鱼,配制5种玉米蛋白粉使用量为0%、5%、10%、15%、20%的实验饲料,玉米蛋白粉对饲料中鱼粉的替代水平分别为0%、7.4%、14.8%、22.2%和29.6%。用实验饲料饲养暗纹东方鲀60d,研究玉米蛋白粉替代鱼粉对暗纹东方鲀肝胰脏、头肾和脾脏组织的溶菌酶活性及其c-型溶菌酶mRNA相对表达量的影响。结果表明,(1)暗纹东方鲀肝胰脏、头肾和脾脏的溶菌酶比活力分别为9.14、42.12和40.49U/mgprot,头肾和脾脏组织中c-型溶菌酶mRNA相对表达量分别是肝胰脏的3.76和3.24倍。(2)玉米蛋白粉替代鱼粉显著影响暗纹东方鲀溶菌酶比活力。5%和10%组的肝胰脏和头肾组织溶菌酶比活力显著高于对照组(P<0.05),而15%和20%组肝胰脏和头肾组织溶菌酶比活力则显著低于对照组(P<0.05);5%和10%组的脾脏组织溶菌酶活力与对照组无显著性差异(P>0.05),而15%和20%组显著低于对照组和5%组(P<0.05)。(3)玉米蛋白粉对暗纹东方鲀c型溶菌酶基因mRNA相对表达量有显著影响(P<0.05)。肝胰脏组织中5%和10%组表达量显著高...     

基于线粒体基因组的东方鲀属系统发育学及群体遗传学

为了细致探究东方鲀属内系统发育关系,本研究首次基于群体尺度对东方鲀属物种进行系统发育分析。利用线粒体基因组,在包含10个种的124尾东方鲀中,挖掘了1 488个单核苷酸多态性（SNP）位点和4个插入缺失（INDEL）,使用这些遗传变异位点进行了系统发育及群体遗传学分析。发现网纹东方魨与铅点东方鲀可能是同种异名,且二者形成的姊妹群位于东方鲀属基部;暗纹东方鲀与红鳍东方鲀、菊黄东方鲀与双斑东方鲀各自亲缘关系较近。此外,实验发现了4尾可疑的双斑东方鲀和菊黄东方鲀杂交个体,以及2尾可疑的横纹东方魨杂交个体。遗传多样性方面,弓斑东方鲀遗传多样性最低。此外,实验在10种东方鲀中共找到595个种间特异性SNP位点。Ka/Ks分析表明,nd6基因的Ka/Ks最高（平均为1.19）,说明在东方鲀属中nd6可能经历了正选择,而ATP合成酶基因可能在东方鲀适应淡水环境中受到选择。研究表明,东方鲀属内系统发育关系较为复杂,且在野生环境下东方鲀物种间广泛存在自然杂交现象,该研究为东方鲀物种快速鉴定提供可靠的分子标记,加速东方鲀属系统发育研究进展,并为东方鲀野生种质资源保护提供了理论依据。     

LED光谱对红鳍东方鲀仔稚鱼形态性状及生长相关基因表达的影响

设置4种LED光谱环境,分别为蓝(λ450 nm)、绿(λ525 nm)、黄(λ590 nm)和白(λ400~780n m),水温控制在(22±1)℃,光周期为16L:8D,光强设为200 mW/m2。研究光谱对红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)受精卵孵化和孵化后1~18 d (即实验第6~23天)仔稚鱼形态性状(全长、体长、躯干长、尾长、头长、眼径和体高)以及生长相关基因,包括生长激素(GH)、生长激素受体1型(GHR1)、类胰岛素生长因子1型(IGF1)基因相对表达量的影响。结果显示,蓝、绿、黄光处理组的受精卵比白光处理组早2 d孵化;在实验结束时,蓝光处理组中,仔稚鱼的全长、体长、躯干长和尾长生长最快,黄光处理组中,头长、眼径和体高生长最快。对于生长相关基因,蓝光下的GH基因表达量显著高于黄、白光组(P<0.05),但与绿光组无显著性差异;不同光谱下,GHR1、IGF1基因的表达量无显著性差异。结果表明,蓝光、绿光和黄光促进红鳍东方鲀受精卵的孵化,蓝光有利于红鳍东方鲀仔稚鱼的生长发育。本文研究了不同光谱对红鳍东方鲀仔稚鱼早期发育的形态性状及生长相关基因表达的影响,为养殖厂对红鳍东方鲀育苗提供科学的参考依据。     

暗纹东方鲀线粒体COIII克隆及序列分析

克隆并测定了暗纹东方鲀线粒体基因组(m tDNA)含完整的细胞色素氧化酶亚基Ⅲ(CO III)及其下游70 bp的tRNAG ly序列。CO III基因编码框包含786个核苷酸,编码262个氨基酸的蛋白质。鱼类CO III的序列组成对A T核苷酸的偏倚程度比较低。通过暗纹东方鲀与GenBank中8个目12种鱼类的CO III序列同源性比较,显示暗纹东方鲀与这些鱼类的CO III基因具有较高的同源性。根据暗纹东方鲀与鲀目其他5种鱼的CO III基因序列所建立的进化树,与传统的分类地位相吻合。推定的tR-NA的二级结构具有典型的三叶草型结构。根据CO III序列构建的分子进化树分析,认为在采用线粒体基因序列进行分子进化分析时,应综合考虑物种遗传变异的特点。     

芳香化酶抑制剂对暗纹东方鲀CYP19A、DMRT1基因表达及性腺分化的影响

采用组织学和分子生物学方法,研究了投喂芳香化酶抑制剂来曲唑(LE)后暗纹东方鲀(Takifugu obscures)初孵仔鱼CYP19A、DMRT1基因表达以及性腺的组织学变化,以期进一步了解P450芳香化酶(P450arom)在鱼类早期性别分化过程中的作用。RT-PCR结果显示,对照组样品CYP19A和DMRT1表达显示性二态,雌性表达CYP19A基因,雄性表达DMRT1基因。LE处理组在性别分化期间,雄性样品单一表达DMRT1,雌性样品则同时表达CYP19A和DMRT1。qRT-PCR结果显示:LE处理组雌性仔鱼CYP19A基因表达被显著抑;虽然在仔鱼出膜后22d(dph)的表达水平高于9 dph,但仅为同日对照组的2.11%。LE处理组雌性样品22 dph时DMRT1基因表达量上调,至150 dph时达对照组雄性水平。55 dph的性腺组织学结果表明,LE处理可导致暗纹东方鲀稚鱼原始卵巢退化,并向功能性精巢发育。150 dph的LE处理组性腺均为精巢,并与对照组精巢发育同步。结论认为,暗纹东方鲀性腺分化期间P450arom是卵巢形成和维持发育所必须的,抑制P450arom活性可导致雌性暗纹东方鲀发生雄性化逆转。     

河鲀异钩虫病的防治方法

河鲀异钩虫病是日本养殖红鳍东方鲀危害最大的寄生虫病,我国在2002年首次确认此病在养殖红鳍东方鲀时发生,笔者于2002年在暗纹东方鲀亲鱼越冬时发现,2003年和2004年一龄暗纹东方鲀越冬时又多次发现,是目前长江口区域养殖暗纹东方鲀鱼种时发病最严重的,损失最大的一种寄生虫病。本病全年均可发生,危害各生长阶段的河纯鱼,并且常常和纤毛虫病、车轮虫病、细菌病并发。