富有柿果ACC氧化酶cDNA的克隆及其序列分析

以富有柿果为材料,用RNA提取试剂盒提取总RNA,根据已报道的柿果ACC氧化酶(1-aminocyclopropane-l-carboxylic acid oxidase,ACO)基因的序列设计并合成1对引物,通过RT-PCR方法获得1条约1.2 kb特异片段,把该片段连接到pGEM-T easy vector上进行测序,其全长共1 237 bp,编码区697 bp,共编码231个氨基酸残基。序列分析结果表明,该序列与DK-ACO1的cDNA序列同源性达99%,氨基酸的同源性达98%。     

樱桃ACC氧化酶基因的克隆和序列分析

以樱桃基因组DNA为模板定向克隆其ACC氧化酶基因。对PCR扩增的目的片段用1％琼脂糖凝胶电泳检测后，进行回收、连续转化，通过蓝白筛选挑取白色菌落提取质粒DNA进行酶切鉴定，确定重组子后采用双脱氧终止法测定DNA全序列。DNA测序结果显示，樱桃的ACC氧化酶基因序列全长为1310bp，由2个外显子和3个内含子构成，外显子总长为1000bp。同源性分析可知，樱桃与桃的ACC氧化酶基因DNA序列同源性达97．8％。     

桃果实ACC氧化酶基因的克隆及序列分析

乙烯是调控果实成熟衰老的内源激素,有效地调控乙烯的生物合成便是控制果实成熟的关键,而ACC氧化酶是植物乙烯生物合成途径中的限速酶之一。本研究以成熟的白粉桃为材料提取果实总RNA,克隆ACC氧化酶基因,旨在利用反义技术抑制乙烯合成,延迟桃果实成熟,提高硬度。将克隆片段与pMD18-T载体连接并转化到E.coliDH5α,经PCR、酶切和测序鉴定。分析表明该基因全长为1246bp,其中编码区长960bp,共编码319个氨基酸,与已登陆的ACC氧化酶基因(AF319166)核苷酸序列和氨基酸序列的同源性分别为99%和98%,表明成功的克隆了ACC氧化酶基因。经生物信息学分析,推测该蛋白的分子式为C1626H2542N420O485S12,相对分子质量为36.12kDa,等电点为5.27;该蛋白为亲水性非分泌型蛋白,无信号肽存在;其蛋白质二级结构以α-螺旋、β-折叠和无规卷曲为主,是一个紧凑型球状结构域。     

鸡Muslin cDNA克隆与序列分析

基于电子延伸序列,本试验克隆并分析了鸡Muslin基因。肌肉组织提取总RNA,利用设计的引物进行RT-PCR,PCR产物与pMD19-T连接后转化E.coliDH5α,检测阳性克隆并测序;克隆的Musclin基因与人、大鼠、小鼠同源性分别为74%,73%,70%,推测的氨基酸序列同源性分别为58%,54%,50%,氨基酸序列含有"KKKR"结构和与小鼠ANP,BNP,CNP蛋白的同源性区域。试验成功克隆了鸡Musclin基因并注册GenBank(EF551041)。     

一个陆地棉半胱氨酸蛋白酶全长cDNA的克隆及其序列特征分析

植物体内的半胱氨酸蛋白酶（CP）在一系列重要的生理代谢途径中发挥作用,在种子萌发过程中它们与许多贮藏蛋白的降解有关[1],它们可能催化大多数蛋白前体向成熟蛋白转化过程中的翻译后加工过程[2,3],从而为幼苗的生长发育提供营养物质;……     

虹鳟Hepcidin cDNA的克隆及序列分析

为了从虹鳟肝脏中扩增出Hepcidinc全长DNA序列,预测出氨基酸序列,并进行序列分析。通过RT-PCR和RACEPCR的方法,从虹鳟肝脏中克隆获得了Hepcidin全长cDNA序列,利用在线工具和软件包分析。结果表明:虹鳟Hepcidin全长cDNA序列(GenBank登录号HQ711993)为883bp,5’端非翻译区211bp,3’端非翻译区为405bp,以及一段267bp的编码序列,编码88个氨基酸,由信号肽(24个氨基酸)、原肽(39个氨基酸)和成熟肽(25个氨基酸)组成,成熟肽C端含有Hepcidin类抗菌肽的8个半胱氨酸保守性结构,可形成4个分子内二硫键。与已报道的鲑形目大西洋鲑Hepcidin氨基酸序列的一致性为93%,与其他鱼类Hepcidin氨基酸序列的一致性为44%~88%,是Hepcidin家族的新成员。     

番茄ACC氧化酶基因cDNA的克隆及三种植物表达载体构建

乙烯在植物生长发育过程中发挥着重要的作用.ACC氧化酶是乙烯生物合成途径的限速酶.通过反义基因工程调控ACC氧化酶基因的表达,进而起到调控乙烯的生成是乙烯研究的主要途径.本研究采用RT-PCR方法获得番茄ACC氧化酶基因cDNA序列1 018 bp,构建该基因的正义、反义、RNAi表达载体,通过电转化法导入农杆菌LBA4404中.     

莲多酚氧化酶基因的克隆及序列分析

多酚氧化酶是一类普遍存在于植物、真菌、昆虫的质体中,由核基因编码能与铜相结合的金属蛋白酶。它是许多果蔬等农产品酶促褐变的主因,也在植物的光合作用、抗病虫害、生长发育以及花色的形成中起一定作用。用RT—PCR方法,从中国莲（Nelumbo nucifera）幼叶RNA中成功扩增出ppo的部分序列,经克隆测序,得到长度在978-1057bp的序列共7个,编码326～352个氨基酸。与其他物种PPO进行比较,其核苷酸序列相似性为83％-85％,氨基酸序列相似性为84％99％。莲ppo的成功克隆为抑制莲藕的酶促褐变,提高莲的抗虫抗病性等的研究打下了良好的基础。     

香蕉MuMA DS2的克隆、序列分析和表达分析

根据抑制缩减文库获得的一个MADS-box基因片段,从香蕉果实cDNA文库中,采用RT-PCR技术分离获得一个全长cDNA,经序列测定和同源性分析表明,该cDNA含705bp的完整的开放阅读框,编码234个氨基酸残基的MADS-box蛋白,将其命名为MuMADS2。MuMADS2具有植物MADS-box基因家族中特有的M、I、K和C四个结构域,与芦笋、风信子、蝴蝶兰和百合的MADS-box基因的氨基酸序列存在很高的一致性（82%、78%、77%和75%）。将MuMADS2与其它植物来源的MADS-box基因进行序列比较发现,MuMADS2属于MADS-box基因的AGAMOUS亚族的D世系。RT-PCR分析表明,MuMADS2仅在生殖器官（花和果）中表达,在营养器官（根、茎和叶）中不表达。进一步分析发现MuMADS2仅在雄花和雌花的子房、由雌花发育而成的果实中表达,而在雄花和和雌花的柱头和花柱都不表达。推测MuMADS2可能在果实的发育和成熟过程中起作用。     

牛BMP-15基因cDNA的克隆和序列分析

BMP-15基因主要在哺乳动物卵巢中表达,对卵泡的发育和分化起重要作用,克隆了牛BMP-15成熟肽编码区的cDNA序列并进行序列分析,旨在为BMP-15在牛繁殖性能方面的进一步研究奠定理论基础。根据其他物种BMP-15基因的保守序列设计特异性引物,扩增牛的cDNA序列。从牛卵巢中提取总RNA,采用RT-PCR技术扩增出牛BMP-15cDNA序列。将此片段克隆到PMD18-T载体中,经菌落PCR鉴定和DNA序列测定分析验证,证实所克隆序列BMP-15为骨形态发生蛋白,符合骨形态发生蛋白基因的特征。序列分析表明,该cDNA包含有1 185 bp组成的开放读码框(ORF),该ORF编码394个氨基酸,与绵羊、猪、人、小鼠等动物氨基酸序列比对发现同源性分别为98.5%,87.6%,74.0%,69.4%。     

芒果 ANS 基因的克隆及其序列分析

为了研究芒果果实中ANS基因的功能。利用同源克隆方法从芒果果实中克隆得到了一个ANS基因,该基因的cDNA长度为1252 bp,开放阅读框的长度为1056 bp,编码351个氨基酸。通过系统发育分析,发现该基因编码的蛋白与荔枝、葡萄、可可豆、桑树等聚在一类。通过序列对比分析表明,已经成功得到芒果ANS基因,并对其生物信息进行了分析,为下一步芒果ANS基因的功能研究打下了基础。     

无核白葡萄多酚氧化酶基因的克隆与序列分析

为获得无核白葡萄中多酚氧化酶(PPO)的基因序列,以无核白葡萄果实为试材,进行基因同源克隆,得到多酚氧化酶基因CDS全长序列,其完整的编码框为1 824 bp,编码607个氨基酸(GenBank登陆号为KP271928);系统进化分析可知,其与葡萄科植物PPO基因同源性最高;生物信息学方法发现该蛋白分子量为67 392.44 Da,等电点为6.42,具典型的酪氨酸家族结构域,无信号肽结构,但有一个跨膜结构域,为亲水性蛋白;二级结构预测发现,PPO具有CuA与CuB两个结合区,分别嵌入蛋白活性腔中。该研究为进一步从分子水平探讨多酚氧化酶与褐变的关系奠定理论基础。     

香蕉ACC氧化酶反义基因植物表达载体的构建及其转化烟草的研究

用限制性内切酶Xba Ⅰ和Sac Ⅰ从克隆载体pUCm-ACO上切下约1.2 kb的香蕉ACO基因,将其定向连接在经相同酶切的质粒载体pBI-121上,构建成植物表达载体pBI-aACO.在此基础上用EcoR Ⅰ和HindⅢ从在pBI-aACO上切下大小约2.3 kb的目的基因35Sp-aACO-NOSt,将其连接在质粒载体pCAMBI-A2301载体上,构建成香蕉ACO反义基因植物表达载体pCB-aACO.采用直接转化法将pCB-aACO导入根癌农杆菌菌株EHA105,采用该菌株转化普通烟草.在Kanamycin选择压力下获得的烟草转化不定芽和完整植株,经过GUS组织化学法检测、以及PCR和RT-PCR方法鉴定,验证了该植物表达载体的报告基因,选择基因和目的基因都得到了表达,证明该植物表达载体构建成功.此项研究为下一阶段用该反义基因转化香蕉品种以改良香蕉果实耐贮运性打下基础.     

无花果ACC合成酶基因克隆及序列分析

为进一步利用基因工程手段调控无花果乙烯的合成,以无花果果肉为材料提取基因组DNA,根据已报道的无花果ACC合成酶基因序列设计引物,采用PCR技术扩增得到一条约600 bp的特异片段,将该片段克隆到pGM-Teasy vector上经PCR、酶切和测序鉴定。序列分析结果表明,基因全长590 bp,编码196个氨基酸,该序列与GenBank上已登陆的Masui Dauphine-ACS1的cDNA序列同源性达99%,氨基酸同源性达98%。结果表明,成功克隆到了无花果ACS基因片段。     

狗头枣GSTU基因的克隆及其序列分析

为探索红枣GSTU类基因在红枣抗逆中的分子作用机制,本研究以狗头枣枣树叶片的DNA为模板,根据枣GSTU基因的序列(HM345954.1)设计引物,采用PCR方法获得GSTU基因序列,并利用生物信息学手段对其所对应蛋白的结构域、功能域、理化特性、跨膜区、二级结构及亚细胞定位等进行分析。结果表明:克隆到的DNA序列全长838 bp,具有2个外显子和1个内含子,内含子在292~460 bp碱基处,该序列与GenBank中枣的GSTU核苷酸序列和氨基酸序列的同源性分别为99.85%和100%,表明成功的克隆了狗头枣的GSTU基因。该序列编码222个氨基酸,分子量为25.268 kD,理论等电点(pI)为6.10;亲水性的平均数为-0.242,表明该蛋白是亲水性蛋白。二级结构主要以α-螺旋为主,其次是无规则卷曲,不存在信号肽,表明该蛋白可能为非分泌性蛋白,该蛋白可能位于内质网(膜)和质膜上。本研究获得的狗头枣GSTU基因在基因结构上含有1个内含子,在核酸序列及氨基酸序列上与GenBank中枣的GSTU基因同源性高,并对其理化性质、结构等进行了预测与分析,为进一步研究红枣抗逆分子机制提供理论基础,同时为红枣品种的选育提供理论支持。     

烟夜蛾幼虫中肠类钙粘蛋白基因cDNA片段的克隆与序列分析

类钙粘蛋白位于昆虫中肠刷状缘膜囊泡上,该蛋白作为Bt毒素的受体可以与其结合导致昆虫死亡,因此,昆虫对Bt毒素的抗性与类钙粘蛋白有密切关系。本研究以烟夜蛾五龄幼虫中肠的总RNA为模板,根据已经克隆的其他昆虫的类钙粘蛋白基因序列设计引物,利用RT-PCR技术扩增出了烟夜蛾类钙粘蛋白基因的cDNA片段,将其连接到pMD18-T载体,转化大肠杆菌后筛选阳性克隆并进行序列测定,测序得到的1 335 bp的片断编码444个氨基酸残基。序列分析表明,该氨基酸序列与棉铃虫和烟芽夜蛾类钙粘蛋白的一致性分别为95%和86%。研究结果对进一步研究昆虫对Bt毒素产生抗性的机制以及发展分子技术快速检测并监测田间昆虫抗性基因的产生奠定了基础。     

玉米BADH基因的克隆与序列分析

Betaine was accumulated as a nontoxic and protective osmolyte in water-dificit and salt-stressed plants. Betaine aldehyde dehydrogenase for glycine betaine synthesis is an important enzyme. The BADH gene of Maize was cloned by RT-PCR and RACE. The gene is 1 762 bp in length, including an open reading frame of 1 515 bp.Its nucleotide sequence shares 95% with the the partial cDNA of BADHI from Sorghum bicolor. Its deduced amino acid sequence contains the conserved domain sequence “VTLELGGKSP“ of ALDH, and a tripeptide SKL at its C-terminal, a signal targetting to the microbodies. The phylogenetic tree of 20 BADHs was constructed,which corresponds to the classical botanical division of plant, the BADH of maize is closest to the one of Oryza Sativa.     

绵羊显性白位点基因（KIT）cDNA的克隆与序列分析

显性白位点基因座位编码一种跨膜蛋白-----肥大细胞生长因子受体,这种受体对黑色素细胞的形成、成熟及增殖迁移有重要作用。本研究克隆了绵羊KIT基因的部分编码序列,首次获得绵羊KIT基因的cDNA序列。并与其它动物相应区域作了同源性比较,结果表明：绵羊KIT基因exon11-19 cDNA长1003bp,编码含331个氨基酸残基的蛋白;蛋白质同源性比较显示,绵羊与牛、羊、猪、人、马等的同源性大于94%;通过对绵羊该蛋白进行结构域及结构分析,为进一步研究KIT基因与绵羊毛毛色的关系奠定了一定的理论基础。     

芒果 CCR 基因的克隆及其序列分析

为了研究芒果CCR基因在芒果对芒果树抗性的功能。采用传统的RT-PCR和RACE方法从芒果的枝梢中克隆得到了1个参与木质素生物合成的肉桂酰辅酶-A还原酶基因（ CCR）的全长cDNA序列,进而对得到的序列采用TMHMM、DNAMAN等软件进行生物信息学分析,发现芒果CCR基因包含编码区、3′和5′非翻译区的长度为1292 bp的cDNA序列,编码305个氨基酸;对跨膜结构域进行了预测,发现该基因无跨膜结构域;蛋白二级结构元件以无规则卷曲和β-螺旋为主;聚类分析发现,该基因与美洲山杨木、油茶等植物的亲缘关系较近,而与百合、橡胶树等亲缘关系较远。从芒果中克隆得到了一个CCR基因,并对其生物信息学进行了分析,为后续转基因工作打下了基础。     

莲膨胀素基因的克隆及其序列分析

膨胀素是一类存在于植物细胞壁上,并能快速缓冲张力,使植物细胞壁松驰的蛋白质。以中国莲幼叶总RNA反转录所得的cDNA为模板,设计简并引物,用PCR方法成功扩增出expansin部分序列,经克隆测序,得到长度在531-532bp的序列共3个,编码177个氨基酸,而且均存在expansin的保守区域。与其它物种,如杂交杨树、烟草、杂交葡萄、野马铃薯、樱桃等物种的expansin相比,核苷酸相似性为84％-85％,氨基酸序列相似性为86%-99％。莲expansin的成功克隆为研究莲的生长发育以及莲品种的改良等打下了良好的基础。