VEGFR1基因特导性siRNA的筛选

[目的]筛选血管内皮生长因子受体(VEGRF)基因特异性小干扰RNA(Small Interference RNA,siRNA),为肿瘤等疾病的基因治疗寻找一种新途径。[方法]以高表达VEGFR1的人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)为模型,采用RNA干扰技术,化学合成了3条针对血管内皮生长因子受体1(VEGFR1)的特异性siRNA,用Lipofectamine2000TM转染HUVEC细胞株,通过Real time RT-PCR技术检测HUVEC细胞VEGFR1基因mRNA的表达。并对效果最好的VEGFR1 siRNA-2进行siRNA的浓度梯度效果检测。[结果]结果表明,与对照组相比,所设计的3条siRNA均能不同程度地抑制VEGFR1 mRNA的表达,其中siRNA-2号最有效,浓度为50 nmol/L时抑制率达到95%左右。在浓度梯度试验中,VEGFR1 siRNA-2转染浓度为50 pmol/L时,对VEGFR1基因的沉默效果还能达到50%左右。[结论]所设计的siRNA能有效抑制VEGFR1基因的表达,为RNAi用于靶向VEGFR1的基因治疗提供了非常有效的siRNA序列。     

VEGFR1基因特异性siRNA的筛选

[目的]筛选血管内皮生长因子受体(VEGRF)基因特异性小干扰RNA(Small Interference RNA,siRNA),为肿瘤等疾病的基因治疗寻找一种新途径。[方法]以高表达VEGFR1的人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)为模型,采用RNA干扰技术,化学合成了3条针对血管内皮生长因子受体1(VEGFR1)的特异性siRNA,用Lipofectamine2000TM转染HUVEC细胞株,通过Real time RT-PCR技术检测HUVEC细胞VEGFR1基因mRNA的表达。并对效果最好的VEGFR1 siRNA-2进行siRNA的浓度梯度效果检测。[结果]结果表明,与对照组相比,所设计的3条siRNA均能不同程度地抑制VEGFR1 mRNA的表达,其中siRNA-2号最有效,浓度为50 nmol/L时抑制率达到95%左右。在浓度梯度试验中,VEGFR1 siRNA-2转染浓度为50 pmol/L时,对VEGFR1基因的沉默效果还能达到50%左右。[结论]所设计的siRNA能有效抑制VEGFR1基因的表达,为RNAi用于靶向VEGFR1的基因治疗提供了非常有效的siRNA序列。     

慢病毒介导的靶向Vegfr2 shRNA干扰对血管内皮细胞生长的影响

为评价慢病毒介导的Vegfr2 shRNA干扰对内皮细胞中VEGFR2的沉默效应,及对血管内皮细胞生长的影响,构建靶向大鼠Vegfr2基因的shRNA干扰慢病毒载体,并感染血管内皮细胞。通过RT-PCR和Western blot检测Vegfr2的mRNA及蛋白表达水平,评价所建慢病毒载体对靶基因的干扰效率;通过BrdU增殖试验、划痕试验和基质胶-管形成试验,评价对血管内皮细胞生长、迁移的影响。结果表明:靶向Vegfr2基因的重组慢病毒,能显著抑制大鼠血管内皮细胞中Vegfr2的mRNA和蛋白表达,抑制率均达70%。对内皮细胞的增殖、迁移及管形成有极显著抑制作用。这一研究提示慢病毒介导的靶向RNA干扰能有效沉默血管内皮细胞中VEGFR2的表达,显著抑制内皮细胞的生长和体外管样结构的生成。     

不同繁殖季节牦牛睾丸组织VEGF及其受体分布比较

【目的】探索VEGF及其受体(VEGFR2)在繁殖期和繁殖间期成年牦牛睾丸组织中的分布特点并进行比较分析.【方法】应用免疫组织化学SP法检测VEGF及其受体(VEGFR2)分布特征并通过IPP图像分析软件进行定量统计.【结果】免疫组织化学显示,成年牦牛睾丸中,VEGF表达于各级生精细胞以及Sertoli细胞和Leydig细胞,强表达于长形精子,小血管内皮细胞见强阳性表达,肌样细胞未见表达;其受体VEGFR2表达于各级生精细胞及Sertoli细胞,且Leydig细胞内强表达,小血管弱表达;性成熟牦牛睾丸组织中VEGF和VEGFR2的表达繁殖期高于繁殖间期,但无显著统计学差异(P0.05).【结论】VEGF及其受体在性成熟牦牛睾丸组织中表达丰富,表明其参与精子发生及局部微环境的调节,不同繁殖期有一定的表达差异,提示其表达与牦牛发情活动密切相关.     

三氧化二砷对人宫颈癌HeLa细胞凋亡及其血管内皮生长因子表达的影响

目的了解三氧化二砷（As2O3）对人宫颈癌HeLa细胞凋亡及其血管内皮生长因子（VEGF）表达的影响。方法用不同浓度的As2O3作用于HeLa细胞不同时间段后,光镜和电镜观察细胞形态改变,MTT法测定细胞生长抑制情况,流式细胞术检测细胞凋亡率,Western blotting方法检测VEGF的表达。结果不同浓度的As2O3处理HeLa细胞不同时间后,能抑制宫颈癌Hela细胞的体外生长,诱导宫颈癌Hela细胞凋亡,并呈浓度和时间依赖性（P〈0.01）。As2O3还下调VEGF的表达。结论 As2O3可抑制体外人宫颈癌HeLa细胞增殖及VEGF的表达。     

合成的新茶氨酸衍生物茶双溴香酰胺 对人乳腺癌细胞生长的抑制作用

为提高茶氨酸的活性,开发新型抗肿瘤药物,合成了新的茶氨酸衍生物茶双溴香酰胺(DTBr C),比较茶氨酸和茶双溴香酰胺对高转移的人乳腺癌MDA-MB-231细胞生长的抑制作用与其分子机制。采用MTT方法检测不同浓度的DTBr C对MDA-MB-231细胞生长的影响,应用蛋白质印迹法检测解析MDA-MB-231细胞中与凋亡和生长密切相关蛋白的表达和药物可能的作用靶点。结果表明,DTBr C抑制MDA-MB-231细胞生长的活性超过其母体化合物茶氨酸多倍;DTBr C显著减少抗凋亡蛋白Bcl-2水平,大大提高促凋亡蛋白Bax表达,从而减少Bcl-2/Bax比率;此外,DTBr C明显抑制血管内皮生长因子受体VEGFR2和蛋白激酶Akt的表达及磷酸化,DTBr C对这些蛋白的作用活性强于茶氨酸。DTBr C作用机制可能与抑制MDA-MB-231细胞VEGFR2-Akt信号传导通路相关。本研究结果提示,DTBr C可能具有广泛应用于临床治疗和(或)辅助治疗高转移乳腺癌的潜力。     

羊膜移植抑制碱烧伤后角膜血管内皮生长因子表达的实验研究

目的探讨羊膜移植对角膜内血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)及角膜新生血管形成的影响,方法12只兔(24眼)被建立角膜碱烧伤动物模型,行羊膜移植的左眼为实验组,右眼为对照组,分别采用免疫组化染色检查VEGF蛋白的表达,宏观测量新生血管长度及生长速度,显微镜下微血管计数方法研究角膜新生血管形成及抑制情况,结果与对照组比较,实验组兔眼角膜的VEGF蛋白表达下降,新生血管生长速度变慢,微血管数量减少(P＜0．01),VEGF主要表达在角膜受损区的炎性细胞胞浆内,其出现时间及位置与角膜新生血管一致,结论VEGF是一种重要的角膜内新生血管形成因子,其变化与角膜新生血管平行;羊膜移植可抑制碱烧伤角膜内VEGF的表达及角膜新生血管的形成.     

狼尾草对3种常用除草剂的耐受性

采用盆栽方法,测定了狼尾草(Pennisetum alopecuroides)对2,4-D丁脂、草甘磷和精奎禾灵的耐受性.结果表明,3种除草剂对狼尾草的生长速度和分蘖均有不同程度的影响,其中以2,4-D丁脂的影响最小,草甘磷的影响最大,并且随着除草剂用量的增加,其对狼尾草生长速度的抑制越明显;3种除草剂对狼尾草的药害程度不同,其中以草甘磷的药害最严重,精奎禾灵次之,2,4-D丁脂最小;草甘磷最早对狼尾草分蘖产生抑制,精奎禾灵在低剂量下处理后12 d狼尾草才停止产生分蘖,除草剂剂量越大对分蘖的抑制越早.     

5种除草剂对核盘菌生长的初步测定

在实验室条件下研究了不同浓度莠去津、百草枯、农达、2．4-D丁酯和灭草松对核盘菌菌丝生长、菌核萌发和菌核生长的影响。结果表明：5种化学除草剂均不抑制或促进核盘菌菌核的萌发；核盘菌在含有生产上推荐使用浓度的莠去津、农达和2．4-D丁酯的基本培养基上菌丝生长速度与对照相比差异不显著，而在含有推荐使用浓度的百草枯和灭草松的基本培养基上菌丝生长速度与对照相比受到极显著的抑制；推荐浓度的农达、莠去津和百草枯不影响菌核成熟，推荐浓度的2．4-D丁酯完全抑制菌核生长，而推荐浓度的灭草松部分抑制菌核生成。认为在杂草综合治理中，若使用核盘菌作为生物除草剂，可以配合使用农达和莠去津。     

斑马鱼不同发育时期血管内皮生长因子受体2基因表达的实时定量PCR分析

[目的]探讨血管内皮生长因子受体2（VEGFR2-）基因在斑马鱼不同发育时期的表达。[方法]分别从12、24、48、72和96 h的斑马鱼胚胎和仔鱼中提取总RNA,用实时定量RT-PCR方法检测VEGFR2-基因表达,采用2^-△△Ct法进行数据分析。[结果]VEGFR2-基因表达量在12-72 h呈上升趋势,在96 h有所下降。12 h表达量最低,72 h表达量最高,与其他发育期均有显著差异。[结论]斑马鱼血管发育至72 h达成熟阶段。血管发育成熟前,VEGFR2-基因表达水平逐步增长;血管发育成熟后,VEGFR2-基因表达水平下降。     

大蒜胚性细胞悬浮系的建立

以中牟 5号大蒜根尖为外植体 ,在 1 1种固体培养基上诱导愈伤组织 ,筛选出最佳培养基MS + 2 ,4-D 0 .5mg/L和MS + 2 ,4-D 2 .0mg/L +KT 0 .5mg/L。愈伤组织形成后在上述1 1种培养基上继代 3～ 4次 ,获得胚性愈伤组织后再转至液体培养基中 ,经强化培养 3个月后获得胚性细胞悬浮系。试验结果表明 :缩短换液时间 (每隔 3～ 4天换液 1次 ) ,可加快胚性细胞悬浮系的建立     

大泷六线鱼鳍、吻端和肾脏组织原代培养的研究

应用组织块培养法,研究了大泷六线鱼Hexagrammos otakii鳍、吻端和肾脏细胞在含有体积分数为20％胎牛血清(FBS)的L-15、DMEM和DMEM/F12 3种培养基中的生长情况,以及人碱性成纤维细胞(bFGF)、硫酸软骨素、Ⅰ型胰岛素样(IGF-Ⅰ)3种生长因子对细胞贴壁率和迁出率的影响.结果表明:大泷六线鱼鳍、吻端和肾脏细胞适宜的体外培养体系为DMEM/F12培养基+20％ FBS,pH为7.2,温度为25℃;在最适培养基中分别添加5.0 ng/mL bFGF、20 μg/mL硫酸软骨素、40 ng/mL IGF-Ⅰ时,3种组织的贴壁率和细胞迁出率均最高;鳍、吻端和肾脏组织分别经培养21、15、18 d后长满单层,主要为成纤维样细胞;采用低渗滴片法制备染色体,3种组织原代细胞的染色体数目为48条.本研究为大泷六线鱼鳍、吻端和肾脏组织细胞系的构建和生物学特性的研究奠定了基础.     

应用正交设计建立三岛柴胡愈伤组织快速繁殖体系

[目的]建立三岛柴胡愈伤组织快速繁殖体系。[方法]采用正交优化设计的方法,以细胞平均增长量为参考指标,对三岛柴胡愈伤组织的基本培养基、初始pH值、6-BA、NAA及2,4-D的添加量进行筛选优化。[结果]5种因素对试验结果的影响均达到显著水平。基本培养基中,N6对试验影响最大;初始pH值为5.6有利于细胞的生长;3种激素中,2 mg/L 6-BA和0.5 mg/L NAA以组合的方式加入培养基中时,可获得了较高的细胞鲜重。通过对试验结果的分析比较,得出三岛柴胡愈伤组织细胞生长最有利的培养基配方为:N6+6-BA 2 mg/L+NAA 0.5 mg/L,pH为5.6;2,4-D对三岛柴胡愈伤组织的生长有一定的抑制作用。[结论]该研究结果为三岛柴胡愈伤组织的进一步扩大培养和悬浮体系的建立提供了试验数据和理论支持。     

几种理化因子对青钱柳悬浮细胞生长的影响

为了利用细胞悬浮培养技术生产青钱柳细胞及其代谢物质以解决青钱柳资源稀缺问题,采用单因素和正交试验优化青钱柳细胞悬浮培养条件。结果表明,在供试的WPM、MS、1/2MS、B5、N6、DKW、White7种培养基中,WPM、MS、B5均有利于悬浮细胞的生长;有利于悬浮细胞生长的碳源是果糖和蔗糖;2,4-D是影响青钱柳悬浮细胞生长的关键因子,对细胞生长影响极显著,最佳激素组合为0.4mg/L 2,4-D+0.4mg/LNAA+0.4mg/L KT+0.4mg/L 6-BA;通过L9(34)正交试验得出几种物理因子对悬浮细胞生长的影响效应排序为接种量>装液量>转速>pH,最佳条件组合为接种量80g/L、装液量40%、摇床转速115r/min、pH 5.0。     

Influences of Plant Growth Regulators,Basal Media and Carbohydrate Levels on Cell Suspension Culture of Panax ginseng

A cell suspension culture of Panax ginseng which may be continuously subcultured has been established.Embryogenic callus derived from clutured young leaves was used to initiate the culture,Plant growth regulators,basal medium formula and carbohydrate levels were examined to determine their various effects on suspension culture cell growth and development ,The best selection of plant growth regulator,basal medium and carbohydrate level is 2mg/L 2,4-D:0.5mg/L KT,MS and 3% sucrose respectively.     

石斑鱼虹彩病毒主要衣壳蛋白的表达及其生物学功能分析

【目的】明确石斑鱼虹彩病毒（Singapore grouper iridovirus,SGIV）主要衣壳蛋白（Major capsid protein,MCP）的生物学功能,为阐明SGIV感染致病机理及研发抗病毒产品提供理论依据。【方法】使用实时荧光定量PCR检测SGIV感染过程中MCP基因的转录时序及其在SGIV感染石斑鱼脾脏、肝脏、肾脏、肠道、胃和鳃组织中的表达水平;将SGIV MCP基因分别克隆至真核表达载体pEGFP-N3和pcDNA3.1上,构建重组质粒pEGFP-N3-MCP和pcDNA3.1-MCP,然后以重组质粒pEGFP-N3-MCP转染石斑鱼脾细胞（Grouper spleen cell,GS）进行亚细胞定位分析,同时以重组质粒pcDNA3.1-MCP转染胖头鲤细胞（Fathead minnow cells,FHM）构建能稳定表达MCP蛋白的FHM细胞系（FHM-MCP）,用于分析MCP蛋白对宿主细胞生长增殖及SGIV感染压力下细胞存活率和病毒复制的影响。【结果】在SGIV感染8 h后即可检测到MCP基因的特异性转录,即MCP基因是一个晚期基因。在SGIV感染24 h后,MCP基因在石斑鱼脾脏中的相对表达量最高,其次是在肝脏、肾脏和肠道组织中,而在胃和鳃组织中的相对表达量较低,提示胃和鳃组织并非SGIV感染的主要靶器官。SGIV的MCP蛋白主要定位于细胞核附近的胞质中。细胞生长增殖曲线和细胞计数结果均证实,MCP蛋白能调节细胞生长及促进细胞分裂增殖。在SGIV感染后24和48 h,FHM-MCP细胞的存活率均显著高于FHM-Vector细胞（真核表达载体pcDNA3.1转染FHM细胞）,其存活率分别是FHM-Vector细胞的1.12和1.15倍。此外,FHM-MCP细胞在SGIV感染24和48 h后,其病毒滴度均高于FHM-Vector细胞,即MCP蛋白能促进SGIV病毒复制。【结论】SGIV的MCP基因是一个晚期基因,其编码蛋白主要定位于细胞核附近的胞质中,通过促进宿主细胞分裂增殖及病毒复制,最终提高SGIV的病毒滴度和感染力。     

胡杨悬浮细胞系的建立

[目的]建立快速稳定生长的胡杨(Populus euphratica Oliver)细胞悬浮系,为进一步制备胡杨原生质体及林木抗旱耐盐体细胞杂交育种研究奠定基础.[方法]以胡杨胚性愈伤组织为材料,建立胡杨悬浮细胞系,利用正交试验法优化悬浮细胞系的培养条件,在优化培养条件下测定细胞的生长特性.[结果]以胡杨胚性愈伤组织成功地建立了胡杨悬浮细胞系,正交优化试验表明:MB+0.1 mg/L 2,4-D+0.2 mg/L 6-BA+50 g/L蔗糖+300mg/L CH+146 mg/L Gln为最优培养基组合,接种量为30 g(FW)/L时,干重增长速率最高,达 2.44 g/(L·d).胡杨悬浮细胞系生长曲线基本呈S形,生长周期为10 d,其中3～7 d为对数生长期.在一个生长周期内,培养液pH变化趋势是先下降,后上升并逐渐趋于平稳.[结论]在上述优化培养条件下,胡杨悬浮细胞系干重增长速率最快,细胞生长状态最佳.     

Regulation of expression of the interleukin-2 receptor on hematopoietic cells by interleukin-3

Remarkable similarities in the intracellular and genetic events occur when lymphoid and hematopoietic cells are exposed to their specific growth factors. The interleukin-2 (IL-2) receptor, whose cell-surface expression is an absolute requirement for the growth and differentiation of lymphoid cells, was detected on various nonlymphoid hematopoietic cell types in this study. Cell lines consisting either of granulocyte-macrophage precursors or mast cells, which are dependent on interleukin-3 (IL-3) for their growth, expressed high levels of the IL-2 receptor on their surface. Analysis of the binding characteristics of these receptors with 125I-labeled recombinant IL-2 revealed that only receptors with low affinity for IL-2 were present on these cells. Addition of purified recombinant IL-3 to these cell lines led to an increase in IL-2 receptor gene expression within 1 hour in isolated nuclei. This IL-3--induced increase in the number of IL-2 receptors on the cell surface is maximal within 24 hours. Addition of 10,000 units of IL-2 to these cells had no apparent effect on their growth or differentiation. The presence of the receptor with only low affinity for IL-2 on hematopoietic cells and the regulation by IL-3 suggest that this receptor is involved in some important metabolic event in hematopoiesis.