鸡白痢沙门氏菌与鸡伤寒沙门氏菌基因组消减文库的构建

为了解鸡白痢沙门氏菌与鸡伤寒沙门氏菌的基因组差别,筛选鸡白痢沙门氏菌特有的序列,利用SSH对鸡白痢沙门氏菌C79-13(实验方)与鸡伤寒沙门氏菌Sg9(驱动方)基因组进行了比较。选择四碱基内切酶Rsa I将C79-13与Sg9基因组DNA酶切,酶切的C79-13基因组DNA分成两份,分别与接头1和接头2R连接,然后进行两轮杂交和两轮PCR,得到消减混合物,将其与PCR 2.1克隆载体连接,转化感受态E.coli DH5α建立消减文库。结果共获得400个阳性克隆;筛选240个克隆制备质粒进行PCR检测,均扩增出100～2000 bp大小的片段。差异DNA消减文库的构建为进一步筛选、克隆鸡白痢沙门氏菌特异的未知新基因、建立分子鉴别新体系奠定了基础。     

茄子温敏单性结实抑制差减文库的构建与分析

 【目的】构建茄子单性结实差减文库,分离获得茄子单性结实相关基因,研究茄子单性结实形成的分子机制。【方法】以茄子单性结实品系D-10低温条件下无籽的子房和果实,以及适温条件下有籽的子房和果实为材料,采用抑制差减杂交（SSH）技术构建正向和反向差减文库。对阳性克隆测序、BLAST比对分析、GO（gene ontology）功能注释及分类和荧光定量PCR分析。【结果】正反向文库共获得了2 347个阳性克隆;测序、序列拼接后,共获得1 248个高质量的unigenes;将其与非冗余数据库BLAST比对后,有1 109个unigenes找到同源序列,139个unigenes无同源序列为新基因。1 248个unigenes中527个在GO数据库中有功能注释,其中细胞组分、分子功能和生物过程的unigenes分别为206、445和361条,分析表明,茄子单性结实果实的差异主要发生在细胞内部,单性结实性状的表达可能受到一些因子和激酶的调控。【结论】成功构建了茄子单性结实不同时期果实的抑制差减文库,获得3个可能与茄子单性结实相关的unigenes,包括MADS-box基因、雌蕊伸展相关蛋白和果实膨大相关基因。     

鸡白痢沙门氏菌的分离与鉴定

[目的]探索20日龄雏鸡出现有关节肿胀、拉白色稀粪和少量死亡等症状的疾病病因,为鸡场的疾病诊断和防治提供建议和有效措施。[方法]采集病鸡样品并进行了细菌学检验。通过细菌分离、PCR、生化试验和回鸡试验鉴定出5株鸡白痢沙门氏菌。[结果]用分离株感染SPF雏鸡,能复制出与自然感染一致的病例。[结论]鸡白痢沙门氏菌是造成鸡场该次疾病的主要病原。     

鸡伤寒白痢沙门氏菌灭活菌苗的研制

由鸡沙门氏菌株C79-13和C79-20及新疆分离株AS97-19和AS96-4四株菌,经自制的改良硫代硫酸钠培养基,通气搅拌培养,甲醛灭活制成氢氧化铝佐剂苗,经免疫接种健康鸡,免疫后21d抗体水平达到最高,经ANAE方法和T淋巴细胞E花环方法检测,免疫组的细胞免疫水平明显高于非免疫对照组,差异极显著,10LD剂量强毒株攻菌试验,死亡保护率达94.7%,免疫组分离菌率为3.1%。表明该苗具有良好的安全性和免疫效果。     

软腐病菌诱导的大白菜抑制差减杂交文库构建及分析

利用抑制差减杂交技术构建了软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora subsp.carotovora)侵染诱导的结球白菜叶片cDNA文库。文库质量检测表明,差减杂交效率较高,质量较好。随机挑取单克隆进行单向测序,获得1 107条长度大于100 bp、质量较好的ESTs序列。利用DNAstar5.0对上述ESTs进行聚类,共获取753个非冗余EST,包括有564个为单拷贝序列(Singletons)和189个重叠群(Contigs)。所获得的编码功能已知的EST有508个,将这些EST进行功能分类,可以看出所代表的基因参与植物体内的各种代谢反应,其中参与初级代谢和能量代谢的最多(33.3%),其次是参与抗病/防卫反应(12.6%)、再次为参与信号传导(11.4%)和蛋白质合成与加工(9.4%),参与细胞的结构与生长发育、物质运输、转录调控等过程的基因相对较少。RT-PCR分析结果表明,MAPK、SA、ROS等信号通路参与软腐病菌诱导的大白菜抗病防卫反应。     

鸡白痢沙门氏菌的分离与鉴定(英文)

[目的]探索20日龄雏鸡出现有关节肿胀,拉白色稀粪和少量死亡等症状的疾病病因,为鸡场的疾病诊断和防治提供建议和有效措施。[方法]采集病鸡样品并进行了细菌学检验。通过细菌分离、PCR、生化试验和回鸡试验鉴定出5株鸡白痢沙门氏菌。[结果]用这些分离株感染SPF雏鸡,能复制出与自然感染一致的病例。[结论]鸡白痢沙门氏菌是造成该养殖场本次疾病的主要病原。     

鸡白痢和鸡伤寒沙门氏菌的PCR-RFLP分子鉴别

根据鸡白痢沙门氏菌和鸡伤寒沙门氏菌fliC基因可变区两端的保守序列设计1对引物,PCR扩增出约600bp的产物,用Hin6I对PCR产物进行酶切,经RFLP分析区分鸡白痢沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌的生物型。利用该技术对6株鸡白痢沙门氏菌标准株及2株鸡伤寒沙门氏菌标准株进行分子鉴别,得到的结果与预计的RFLP模式相符,证明该方法可行。在此基础上对我国不同地区、不同年代的191株鸡沙门氏菌进行分子鉴别,191株中有185株分离株符合鸡白痢沙门氏菌的RFLP模式,6株分离株符合鸡伤寒沙门氏菌的RFLP模式,其中有176株PCR—RFLP鉴定结果与生化特性符合率达100％,另有15株根据生化特性不能鉴别。     

叶锈菌诱导的小麦叶片抑制差减杂交文库构建及其分析

 【目的】研究叶锈菌诱导小麦叶片的基因表达情况,从分子水平阐明小麦的抗病机制。【方法】以小麦抗叶锈病近等基因系TcLr41为材料,利用抑制差减杂交技术,构建叶锈菌诱导的小麦叶片cDNA文库,随机挑取文库中的阳性克隆测序,并对测序结果进行功能注释和分类。【结果】成功构建了叶锈菌诱导的小麦叶片抑制差减杂交文库,共获得3 456个阳性克隆。挑取165个阳性克隆进行测序,获得160条高质量EST。对EST序列进行聚类后,共获得107条非重复序列（Unigene）,与GenBank进行BLASTx和BLASTn同源比对,其中70条非重复序列与已知基因同源性很高,占全部非重复序列的65.4%。已知功能的EST涉及植物的能量代谢、信号转导、转录调控及抗病防卫等多方面。【结论】通过对功能已知的基因分析,推测促分裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase）、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（serine/threonine protein kinase）、GTP结合蛋白（GTP-binding protein）、钙网蛋白（calreticulin）、过氧化氢酶（catalase）、谷胱甘肽-S-转移酶（glutathione-S-transferase）、多聚泛素基因（polyubiquitin）、锌指蛋白（zinc-finger protein）、肉桂醇脱氢酶（cinnamyl alcohol dehydrogenase）、转脂蛋白（lipid transfer protein）、类甜蛋白（thaumatin-like）、几丁质酶（chitinase）等可能参与了小麦与叶锈菌的非亲和互作过程。     

白粉病菌诱导的小麦抑制差减文库构建与杂交点阵膜制备

 以本实验室培育的抗白粉病品系“百农 32 17×Mardler”BC5F4为材料 ,构建了一个白粉病菌诱导的抑制差减杂交cDNA文库。建库过程质量分析表明 ,差减杂交效率较高 ,文库质量较好。文库滴度为 4 .2× 10 9cfu·ml-1;插入片段平均为 30 0bp左右。挑取文库阳性克隆 96 0个 ,扩增插入片段 ,将其制备成高密度杂交点阵膜。通过探针杂交检测表明 ,本研究制备点阵膜的方法简便可靠 ,获得的点阵膜可用于抗病相关基因的筛选研究     

金鱼头瘤形成相关基因差减文库的构建与分析

采用差减抑制杂交技术(SSH)以1龄红狮头金鱼(Carassius auratus)的头瘤组织为检测子(Tester),40日龄红狮头金鱼幼鱼的头顶上皮组织为驱动子(Driver),构建金鱼头瘤相关基因的差减cDNA文库。以鲫管家基因α-tubilin为参照检测差减效率,结果表明该文库差减效率达210倍,效率较高。随机挑选阳性克隆进行接头特异引物的PCR检测,结果表明插入片段均在0.1~2.0kb之间。利用斑点杂交对PCR检测结果为单一条带的阳性克隆进行筛选并测序,获得高差异性的有效序列93条。通过生物信息学方法对文库序列进行比对、分类和注释,发现若干结缔形成基因和原癌/抑癌基因等与金鱼头瘤形成相关的功能基因,表明cDNA文库构建成功。     

多花水仙花瓣抑制消减杂交cDNA文库的构建及分析

采用抑制消减杂交(SSH)技术,以多花水仙的栽培品种‘黄花水仙2号’黄色花瓣和‘金盏银台’白色花瓣的cDNA分别作为测试子和驱动子,建立正、反向抑制消减杂交cDNA文库.随机挑选正、反向文库各216个阳性克隆测序,对已知功能的uniESTs进行基因本体论(GO)分类分析,荧光定量PCR检测部分可能参与色素形成的uniESTs.结果表明:水仙花色差异表达正、反向消减文库经检验质量可靠,为分离花色形成相关基因奠定了基础;GO功能分类分析显示,水仙花色差异可能受到多个代谢途径的影响;经初步筛选得到11个与水仙花色形成相关的uniESTs,为进一步克隆基因全长和功能验证提供参考.     

抑制性消减杂交技术在植物基因克隆中的应用

抑制性消减杂交(SSH)技术是近十年来才发展起来的一种克隆差异新基因的快速、高效的技术。本文通过与其他几种目前主要的差异基因分离技术的比较,介绍了SSH技术基本原理、基本过程及优缺点,并对SSH技术在植物基因研究应用上的最新进展进行评述。     

仿刺参体壁创伤修复消减文库的构建与分析

应用抑制性消减杂交技术(SSH),构建了仿刺参Apostichopus japonicus(体质量为65 ～90 g)正常体壁及创伤修复(24、48、72、96、120 h后)体壁的消减cDNA文库,利用PCR和斑点杂交技术对文库进行筛选,随机挑取的768个克隆中发现292个阳性克隆,对其中信号强度较强的224个阳性克隆进行测序,得到208个有效EST序列.经BlastX工具对获得的EST与GenBank数据库进行比对分析,结果有171个EST序列与数据库中的基因同源(e≤0.001,相似性＞40％),其中153个为未知基因,18个为已知功能或已命名基因,包括在创伤及修复的体壁中上调表达的β微管蛋白、微管蛋白α-1链、肌动蛋白、肌动蛋白ike 7B类似物、细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ、tRNA假尿苷合成酶A、GTP酶、细胞分裂周期2类似蛋白、有丝分裂原活化蛋白激酶、homeobox蛋白、延伸因子1A、核糖体蛋白L30、核糖体蛋白L17、60S酸性核糖体蛋白PO、26S蛋白酶调节亚基、泛素特异性肽酶24、大肠癌血清抗原3、清道夫受体蛋白12等.本研究结果可为探讨刺参体壁再生过程和分子机理,以及筛选刺参体壁创伤修复过程中相关功能基因的研究提供基础依据.     

鸡白痢沙门氏菌的分离鉴定及耐药性分析

采集菏泽地区发病鸡场疑似鸡白痢病鸡的泄殖腔棉拭子,进行细菌分离,并对分离细菌进行生化鉴定、血清型鉴定和药敏试验.结果显示,分离得到32株鸡白痢沙门氏菌,其中16株O9、10株O1、6株O12,分别占50％、31.25％、18.75％;分离株对头孢噻肟、丁胺卡那霉素、多黏菌素B表现出高敏感性,敏感菌株的比率分别为93.8％、90.6％、84.4％,对四环素、磺胺嘧啶、诺氟沙星表现出高的耐受性,耐受菌株的比率分别为100％、78.1％、71.9％.可见,头孢噻肟、丁胺卡那霉素、多黏菌素B可作为菏泽地区养鸡场防治鸡白痢沙门氏菌病的首选药物,其他药物须减少或暂停使用.     

甘蓝型油菜种子不同发育期基因差异表达cDNA文库构建

以授粉后27 d的种子mRNA为目标群体,授粉后7 d的种子mRNA为对照,构建甘蓝型油菜种子发育期基因差异表达文库.文库包括560个克隆,经菌落PCR检测,456个菌落含有插入片段,占全部克隆的91.2 %,片段大小200～600 bp.对PCR阳性克隆进行斑点杂交,得到201个上调的阳性斑点杂交阳性克隆,对其进行测序,得到有效ESTs序列198个.BLASTN结果显示,134个ESTs序列没有同源序列,可能是新基因,另外64个ESTs序列在油菜或拟南芥核酸数据库中存在同源序列.这64个ESTs序列和已知功能(主要是能量代谢、物质代谢、基因调控、衰老及抗性等)的蛋白有高度相似性.     

应用抑制消减杂交技术克隆鼻咽癌转移调控基因

目的：分离并鉴定高低转移表型不同的人鼻咽癌细胞株差异表达cDNA序列,了解鼻咽癌转移抑制基因或具有抑制活性的核苷酸序列。方法：以具有高低转移潜能不同的人鼻咽癌细胞株为研究对象,应用抑制消减杂交技术（suppression subtractive hybridization,SSH）和T／A克隆法构建差异表达cDNA消减文库,对差异表达的cDNA进行测序和生物信息学分析。结果：成功构建人鼻咽癌细胞克隆株差异表达cDNA消减文库,从随机测序10个克隆中获得6个在低转移鼻咽癌细胞株中高表达cDNA序列,它们都与已知的人类基因片段具有高度同源性。结论：应用抑制消减杂交技术,从一对具有高低转移表型差异的鼻咽癌细胞株中获得6条可能与肿瘤转移抑制相关的cDNA序列,它们可能在维持肿瘤细胞的稳定和抑制肿瘤转移中起重要作用。     

抑制消减杂交在热带作物研究中的应用

介绍了抑制消减杂交(SSH)技术的原理和步骤以及在热带作物发育、逆境胁迫或人为诱导条件下不同组织中差异基因表达和突变等研究方面的应用。     

不同微生态制剂对雏鸡实验感染鸡白痢沙门氏杆菌的影响

以不同微生物制剂饲喂１日龄雏鸡,连喂７ｄ,在雏鸡３日龄时经口接种白痢沙门氏杆菌,３０日龄检测雏鸡消化道菌群,统计育雏成活率,结果表明,给雏鸡早期饲微生态制剂对感染白痢沙门氏杆菌有预防作用。