外源基因在转基因植物中的遗传稳定性及其转育研究进展

利用基因工程方法获得的转基因植物是一种人工创造的新种质.外源基因在无性培养阶段和有性阶段的稳定性,直接影响着转基因植物的利用.外源基因拷贝数、整合位点、位置效应、外源基因丢失、甲基化、共抑制等均影响其在转基因植物中的稳定性;同时也影响外源基因在转育材料中的表现;最后简单讨论了外源基因鉴定方法的优缺点.     

棉花外源基因导入及转基因再生植株条件的研究

用５～６ｄ的棉花无菌苗下胚轴切段与农杆菌共培,菌株质粒中Ｇｕｓ基因为标记基因,ＮＰＴⅡ基因为选择基因。在含０．１ｍｇ·Ｌ－１２,４－Ｄ和０．１ｍｇ·Ｌ－１ＫＴ的ＭＳ培养基上共培４８ｈ,转移到添加头孢霉素５００ｍｇ·Ｌ－１,卡那霉素５０ｍｇ·Ｌ－１的ＭＳ培养基中诱导和筛选抗性愈伤组织,７０～８０ｄ时,进行ＧＵＳ检测,选择ＧＵＳ阳性愈伤组织,经体细胞分化生成转基因再生植株。     

转CpTI基因苹果种植地外源基因残留及对土壤微生物的影响

为研究转Cp TI基因苹果对土壤生态系统的影响,本研究分别提取8年生转基因嘎拉苹果植株根际土、根围土和表层土的DNA,PCR扩增检测土样中的外源Cp TI基因。结果显示：采集的转基因苹果根围土和根际土中均检测到外源Cp TI基因,两个株系的表层土检测到了外源Cp TI基因;含有外源基因的土壤分离培养的微生物中未检测到Cp TI基因,表明外源Cp TI基因在苹果种植地有残留,但在本研究条件下未发生向根系土壤可培养微生物的水平转移。进一步利用灭菌基质均匀喷洒微生物菌剂后移栽嘎拉、富士、王林转基因苹果植株的方法,研究转基因植株对土壤微生物的影响。结果表明：转基因苹果对根际土中的放线菌无明显影响;移栽30~60 d根际土中的细菌和真菌数量显著多于对照;随着移栽时间延长,差异程度减小,移栽90 d时,3个品种转化植株与对照根际土细菌含量以及转基因嘎拉和王林根际土真菌数量均无显著差异,说明转基因苹果对土壤微生物的影响非常有限。     

外源转入基因CBF1在转基因草莓中的遗传分析

以5个独立的转CBF1(C-repeat binding factor)基因草莓株系80、83、94、104和10-5-5为材料,套袋自交和正反交,通过对其后代种子中外源基因的卡那霉素筛选,PCR和Southern杂交,并统计数据,数据采用卡方检测.实验结果发现外源目的基因能够稳定遗传,并且是非细胞质遗传;在自交F1代中5个独立的转基因株系中,只有一个表现为基因互作,其余4个株系表现为一定的遗传分离模式;在自交F2代中,由于单果采收进行分析,发现既有3:1、15:1和35:1的分离模式,同时也出现基因互作等.转基因草莓中的外源基因的遗传是比较复杂的.     

来源于外源单体附加系萝卜单倍体植株的染色体配对

在芸苔和Raphanus两个属中，已得到了具有下述染色体数量的单基因组物种的单倍体：芜菁(2n=20，AA)、甘蓝(2n=18，CC)、黑芥(2n=6，BB)、B．torrmefortii(2n=20，DD)、R．sativus(2n=18，RR)。从这些物种基因组进化的综合研究分析，推测在单基因组芸苔物种和萝卜(Raphanus sativus)中涉及一个基因组原型(x=6)。从进化和植物育种的观点     

基因枪法转化马铃薯及转基因植株的获得

应用基因枪法将携带有FMDV P1全长基因的质粒pBI131SP1导入马铃薯茎段，通过在抗性培养基上严格筛选，获得了马铃薯再生植株。PCR检测及PCR—Southern杂交分析表明，已成功地将目的基因导入马铃薯基因组中。     

转基因小麦外源品质基因1Dx5表达的遗传研究

转基因小麦B72-8-11b中外源品质基因1Dx5表达量是内源相应基因表达量的6倍。利用小麦转基因品系为父本，常规品种鄂麦12、鄂麦18和日喀则8号分别为母本，配置3个杂交组合。采用SDS—PAGE技术，检测各组合亲本、F1、F2代的HMW-GS组成，研究转基因小麦B72-8-11b中外源品质基因1Dx5表达的遗传。结果表明：外源1Dx5基因有功能拷贝整合在1个位点，如同内源品质基因，遵从孟德尔遗传模式。这对育种选择策略的制订具有指导意义，也表明了基因枪转化法能够使得外源基因有功能拷贝整合在1个位点并能稳定传递。     

外源基因在油菜改良中的应用

我国是世界上最大的油菜籽生产国。应用生物技术改良油菜特性的研究正在广为进行。外源基因在油菜中的应用主要包括以下几个方面:(1)改变油菜的农艺性状;(2)改进油料的组成和提高产量;(3)改变储藏蛋白成分,提高饲料品质;(4)增加对生物和非生物胁迫的忍耐性;(5)雄性不育和自交不亲和性方面。从其他生物中分离克隆的外源基因主要有AroA基因、几丁质酶、反义napin基因、反义Cruciferin基因、Barnase和AtNHX基因等。转化方法则以农杆菌介导为主,基因枪以及显微注射法等方法也有所应用。     

Y 系山定子 AP1同源基因的克隆及序列分析

以Y系山定子为试材研究AP1基因,试图为缩短果树童期提供理论依据。根据已登录的苹果AP1基因保守序列设计引物,以Y系山定子的基因组DNA为模板进行PCR扩增,获得1010 bp的基因片段;PCR产物纯化后,将其连接到pMD18-T载体上,连接产物转化大肠杆菌DH5α菌株感受态细胞,通过蓝白斑筛选、质粒长度和酶切鉴定,获得重组质粒并测序。测序结果表明,该序列有2个外显子、1个内含子及2个内含子的一部分,编码区共编码81个氨基酸;对氨基酸序列保守性分析发现,第13～81个氨基酸为MADS-box基因家族特有的K区域;其氨基酸序列在GenBank中同源性检索表明,Y系山定子与其他植物AP1同源基因的氨基酸序列同源性为67．9％～100％。研究结果为揭示Y系山定子早花现象的分子机制奠定了基础,对果树育种具有重要的理论价值和实际意义。     

接种和检测苹果潜隐病毒

通过试管微嫁接，分别将苹果褪绿叶斑病毒和苹果茎沟病毒接种到小金海棠组培苗上，并用PAS—ELISA法检测其带毒率。结果表明：接穗小金海棠苹果褪绿叶斑病毒的带毒率为60．0％，其苹果茎沟病毒带毒率为73．3％，从而证明用此方法可以对组培苗进行快速病毒接种而得到带毒的实验材料。     

黄瓜授粉后外源基因直接导入技术研究

以黄瓜（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ Ｌ．）栽培品种津研四号为受体,以质粒ｐＢＩ１２１为供体进行授粉后外源ＤＮＡ直接导入技术的研究,建立起高效的黄瓜子房注射转化系统,获得了不同的转基因植株。试验表明,子房注射法的坐果率和结种率最低,但其转化率最高;黄瓜授粉后１２ｈ注入外源基因的转化率最高;外源ＤＮＡ溶液的浓度、ｐＨ值及ＤＮＡ溶液注射体积是影响黄瓜坐果结实及基因转化率的重要因素。ＧＵＳ组织化学染色结果以及Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ印迹杂交表明,标记基因ＮＰＴⅡ和ＧＵＳ基因均转化到黄瓜植株中。     

转Bar基因玉米基因漂移的研究

转基因植物发生基因漂移可能引起的生态环境安全性问题已经引起广泛关注,本试验采用转Bar基因抗除草剂玉米为试材,进行了外源基因遗传漂移距离和频率的研究。结果表明,转基因玉米的漂移率与距离成正相关,最大漂移频率为37.78％,隔离距离以150 m以上为好。     

苹果MdSBP20基因抗非生物胁迫的研究

为获得苹果砧木逆境胁迫相关转录因子,以QZ1(平邑甜茶(Malus hupehensis Rehd.)×柱型苹果株系CO(Malus domestica Borkh.)和M26为试材,利用同源克隆法克隆得到苹果SBP基因cDNA的全长序列,命名为MdSBP20。对扩增得到的cDNA序列进行生物信息学分析,结果表明,该序列全长1 362 bp,包含完整开放阅读框1 362 bp,编码454个氨基酸,具有明显的SBP结构域,包含2个锌指结构Zn-1、Zn-2和双向核定位信号区NLS。系统进化树分析,结果表明MdSBP20与白梨(XM_009339726.1)和苹果(XM_008376435.1)亲缘关系较近。实时荧光定量分析结果表明,MdSBP20基因在低温、干旱、盐害中发挥一定功能,推测QZ1的耐寒性、耐旱性及耐盐性均强于M26。研究表明,MdSBP20基因在苹果响应非生物逆境胁迫中具有重要调控作用。     

动物饲料中植物源性外源转基因成分的检测

针对宠物饲料、奶牛饲料和浓缩饲料等不同类型饲料的特点,采取相应的不同DNA提取方法,通过对组成饲料的所有作物成分相应内源基因的检测,确定待测饲料样品的作物组成成分,并建立了各类饲料中转基因成分的检测技术。有针对性地论述了饲料检测中可能出现的问题、技术难点和关键技术,为实际检验工作提供可借鉴的建议。     

导入AGPase基因的转基因可育水稻及其经济性状的研究

以农杆菌介导法将淀粉合成关键酶AGPase(腺嘌呤二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶）基因导入云南地方优质水稻合系35，38，39，41，42中，获得了大量的可育转基因植株。PCR扩增检测，外源基因已稳定整合进水稻基因组中。大量的农艺性状及淀粉含量研究表明，转基因水稻种子的千粒重比对照明显提高，但总淀粉含量没有显著变化。     

适宜苹果组培苗总RNA提取方法的研究

利用CTAB_异硫氰酸胍法、改良CTAB法和RNAplant试剂盒法,从富含多糖和酚类物质的苹果组培苗继代苗中提取总RNA。结果表明CTAB_异硫氰酸胍法对苹果组培苗总RNA的提取有较好的效果,所得RNA的A260/A230大于2.0,A260/A280为1.8~2.0,产率在16.95μg/g左右。改良CTAB法和RNAplant试剂盒法提取的RNA均有少量DNA污染,但RNAplant试剂盒法比CTAB法更快捷,简便。     

外源ABA对低温胁迫下玉米幼苗内源激素含量及Asr1基因表达的调节

脱落酸(ABA)是低温逆境下的重要信号因子,为了探讨外源ABA对低温胁迫下玉米幼苗的生长调节作用,以耐低温玉米品种久龙5号为试验材料,采用不同浓度(5、15、25、35 mg L–1)ABA于玉米三叶一心时喷雾于叶片,并进行低温梯次处理。分析处理后玉米叶片相对电导率、抗氧化酶活性及内源激素ABA、IAA的含量变化,并采用Real-time PCR明确Asr1基因表达水平变化。结果表明,低温胁迫下不同浓度外源ABA处理的玉米叶片相对电导率整体呈上升趋势,SOD和POD活性加强,15 mg L–1和25 mg L–1ABA处理的SOD活性均显著高于未应用ABA处理,玉米內源ABA和IAA合成水平上升,应用ABA后Asr1基因相对表达水平上调,其中5、15和25 mg L–1浓度处理基因表达上调显著。相关分析表明,ABA含量与Asrl基因相对表达量、SOD活性均表现为极显著正相关,与POD活性显著正相关。说明Asr1基因表达受ABA的介导调控,Asr1基因表达量的提升,也促进了内源ABA的合成,抗氧化酶活性加强,提升了应用ABA后玉米的抗低温能力。但外源ABA的介导调控具有一定浓度效应,表现为低促高抑。