苎麻肉桂酰辅酶A还原酶基因cDNA序列的克隆与分析

根据苎麻转录组测序信息,利用RACE法克隆出2个肉桂酰辅酶A还原酶基因全长cDNA序列,对其进行生物信息学分析,并利用荧光定量技术对苎麻快速生长期、成熟期和成熟后期该基因在木质部和韧皮部的表达模式进行研究。结果表明,BnCCR1全长1056 bp,编码277个氨基酸,Blast比对BnCCR1基因与白桦、蓖麻CCR基因核苷酸序列相似性均为70%,推测的氨基酸与蓖麻CCR基因氨基酸序列相似度为77%,蛋白质预测显示其N端存在一个3 Beta-HSD/Epimerase/NAD-binding-10的保守域;BnCCR2基因全长1291 bp,编码248个氨基酸,Blast比对BnCCR2基因与毛果杨CCR基因核苷酸序列相似度为74%,推测的氨基酸与蓖麻、毛果杨CCR基因氨基酸序列相似度均为81%,蛋白质预测显示其N端存在一个3 Beta-HSD/Epimerase/NAD-binding-4的保守域;BnCCR1和BnCCR2基因编码蛋白三维模型与矮牵牛CCR基因相似度分别达30.68%、44.77%,建模结果可靠;荧光定量结果显示BnCCR1和BnCCR2基因具有时期表达差异性,不具有组织表达差异,但不同组织表达量具有差异。推测BnCCR1和BnCCR2基因是存在于苎麻木质素代谢中的两种CCR基因。     

甘蓝型油菜乙酰转移酶基因的克隆及功能验证

为探究乙酰转移酶基因对甘蓝型油菜脂肪酸代谢的影响,以低亚麻酸油菜20～35 d自交种cDNA为模板,克隆了乙酰转移酶基因(Acetyltransferase gene,AT)的2个拷贝(114和148),并进行生物信息学分析以及构建了过表达载体和干扰载体,并转化拟南芥,经潮霉素筛选T0种子,PCR鉴定抗性苗后,收获T1...     

油菜O-acetylserine (thiol) lyase isoform A(OASTL)基因的克隆及序列分析

植物OASTL蛋白是半胱氨酸生物合成过程中的关键酶,催化半胱氨酸合成的最后一步.克隆低镉积累基因型油菜中OASTL基因,为研究该基因在镉积累过程中的功能提供参考.本研究以镉低积累品种美国'油王88'幼苗为材料,采用同源克隆法PCR扩增OASTL基因,并对其进行生物信息学分析.克隆得到美国'油王88'OASTL基因cDN...     

甘蓝型油菜oleosin基因片段的克隆及序列分析

以油菜（Brassica napus）基因组DNA为模板,通过设计一对特异性引物,利用多聚酶链式反应（PCR）扩增获得oleosin基因片段。将其克隆到E.coli质粒上进行序列分析。结果表明,该基因由878个碱基组成,含一个内含子,编码193个氨基酸。不计附加的18 bp凝血酶切割序列,与已报道的序列相比较,核苷酸序列及推导出的氨基酸序列的同源性分别为79.20%和91.21%。推测的氨基酸序列构成的蛋白质具有oleosin的基本结构特点,包含3个结构区域：两性N末端区（an amphipathic N-terminal region）,中心疏水区（a central hydrophobic domain）,两性C-末端区（an amphipathic C-terminal domain）。     

马蔺V-ATPase c亚基基因家族的克隆及序列分析

植物V-ATPase在逆境条件下的应答功能对保证细胞的正常生命活动具有重要作用。本研究根据GenBank收录的外源V-ATPase c亚基,设计简并引物,以马蔺为材料,通过RT-PCR进行扩增,经测序该片段为471bp,包含V-ATPase基因家族的保守结构域,以该片段为靶序列进行5′-RACE延伸,将产物测序得到186bp的序列,将靶序列与5′-RACE产物进行拼接,根据拼接结果设计特异引物,克隆基因全长读码框。结果表明,得到马蔺VHA-c亚基家族的5个成员,片段全长632bp,包括137bp5′-UTR,开放读码框全长495bp,编码164个氨基酸,分子量约为16kDa,包含4个跨膜结构域。将该基因命名为IrlVHA-c1～c5。     

芒果 CCR 基因的克隆及其序列分析

为了研究芒果CCR基因在芒果对芒果树抗性的功能。采用传统的RT-PCR和RACE方法从芒果的枝梢中克隆得到了1个参与木质素生物合成的肉桂酰辅酶-A还原酶基因（ CCR）的全长cDNA序列,进而对得到的序列采用TMHMM、DNAMAN等软件进行生物信息学分析,发现芒果CCR基因包含编码区、3′和5′非翻译区的长度为1292 bp的cDNA序列,编码305个氨基酸;对跨膜结构域进行了预测,发现该基因无跨膜结构域;蛋白二级结构元件以无规则卷曲和β-螺旋为主;聚类分析发现,该基因与美洲山杨木、油茶等植物的亲缘关系较近,而与百合、橡胶树等亲缘关系较远。从芒果中克隆得到了一个CCR基因,并对其生物信息学进行了分析,为后续转基因工作打下了基础。     

植物肉桂酰辅酶A还原酶(CCR)基因的研究进展

植物体内通过公共苯丙烷途径而进入木质素特异途径来合成木质素,这条代谢途径涉及到许多酶的参与,其中肉桂酰辅酶A还原酶(cinnamoyl-CoAreductase,CCR)是木质素特异途径的第一个关键酶,可催化3种羟基肉桂酸的CoA酯的还原反应,生成相应的肉桂醛。因此人们认为此酶可能对木质素合成途径的碳流具有潜在的调控作用,对木质素单体的生物合成起着重要作用。本文主要综述了CCR在木质素生物合成途径中的地位、CCR的分布、酶的提取和基本特性、CCR基因的克隆进展、CCR基因的转录特点、CCR启动子研究情况、转基因植物中表达抑制CCR基因的生物学效应等,并展望了CCR基因研究对于植物木质素研究、植物抗病和抗逆性研究、作物品质改良以及植被保护研究的意义。     

稗草磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCase)基因的克隆与分析

为揭示C₄野生植物稗草（Echinochloa crusgalli）PEPCase的结构和功能特点,探索改善作物高光效新途径,本研究首次克隆了稗草（E. crusgalli）磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(ppc)的cDNA全长,测序及同源性比较分析结果证实,稗草ppc的cDNA全长为2 886 bp,编码961个氨基酸（GenBank登录号：AY251482）;核苷酸序列与谷子(Setaria italica)C₃型、高粱(Sorghum bicolor) C_3-2型、玉米(Zea mays) C_3-2型、水稻(Oryza sativa)C₃型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的同源率分别达94.8%、93.2%、93.0%和89.7%。推导的氨基酸序列中C末端第771位氨基酸是丙氨酸（A）,表明是一个C₃型基因。与其他植物几种不同形式PEPCase进行的多重序列比对与系统进化分析结果也证实,此基因的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列与所有参与对比的C₃型序列的同源性均远远高于与C₄型的同源性。与玉米、高粱C_3-2型PEPCase的同源性分别高达到96.5%、96.4%,与高粱、玉米的C_3-1型PEPCase的同源性分别为84.3%、83.8%,而与谷子、玉米、甘蔗和高粱的C₄型PEPCase的一致性相对较低,分别为82.2%、79.1%、77.1%、76.6%。因此进一步推论新克隆的稗草ppc基因属于C_3-2型。对其编码的蛋白序列进行了结构域、活性位点和功能位点预测。     

Comparisons of Isozyme Patterns in Resynthesized Amphihaploid Rapeseed (Brassica napus) and Their Parental Species Brassica campestris and Brassica oleracea

Resynthesized rapeseed plants produced by embryo culture and the progeny of their selfed parents from Brassica oleracea and Brassica campestris were analyzed by starch gel electrophoresis staining of enzymes GPI, LAP and SDH. In at least one unequivocal case it could be proved for each enzyme system studied that the alleles of both parents arc independently expressed in the newly synthesized individuals and that in the pattern of the dimeric enzyme GPI interlocus bands of the homoeologous loci arc visible. Comparisons with enzyme patterns in cultivated B. napus leads to the conclusion that in general active enzyme loci of both parental genomes are present. This is of great significance in estimating slide frequencies, degree of heterozygosity and other genetic parameters of B. nupus populations/cultivars.     

白菜型冬油菜RuBisCo蛋白亚基基因rbcL和rbcS的克隆及其在干旱胁迫下的表达

应用双向电泳结合液相色谱-质谱联用(LC-MS)分析, 筛选得到干旱胁迫下白菜型冬油菜与光合作用相关差异蛋白质RuBisCo小亚基。根据已发表白菜型油菜(Brassica rapa) RuBisCo亚基rbcL和rbcS保守序列设计引物, 采用RT-PCR扩增陇油7号的cDNA, 获得rbcL和rbcS基因开放阅读框, 长度分别为1095 bp和549 bp, 编码364和181个氨基酸的蛋白质。生物信息学分析结果显示, rbcL与大白菜(Brassica rapa subsp. chinensis)的蛋白质同源性达到99%以上, 其保守序列属于RuBisCo Large超家族, 该蛋白质理论相对分子量及等电点分别为40.29 kDa和6.70, 不稳定指数(instability index, II>40为不稳定蛋白质)为41.67, 属于不稳定蛋白; 脂融指数(aliphatic index)为83.63, 平均亲水性值(grand average of hydropathicity)为-0.232, 属于亲水性蛋白质; 二级结构包括38.74% α-螺旋(alpha helix)、10.99%延伸链(extended strand)及50.27%自由卷曲(random coil); 三级结构具有5个不同的活性口袋。rbcS与甘蓝(Brassica oleracea)蛋白质同源性达到99%, 其保守序列具有rbcS超家族和RuBisCo Small Like超家族, 理论相对分子量为20.32 kDa, 理论等电点为8.23, 不稳定指数为33.66, 属于稳定蛋白质; 脂融指数为74.86, 平均亲水性值为-0.142, 属于亲水性蛋白质; 二级结构包括16.02% α-螺旋、28.73%的延伸链及55.25%自由卷曲; 三级结构具有4个不同的活性口袋。实时荧光定量和半定量分析显示, 干旱胁迫下, 白菜型冬油菜叶片rbcL和rbcS基因表达量下调是光合作用下降的原因。并且, 冬油菜叶片P_n下降与RuBPCase表达抑制和活性降低有关, 非气孔限制是P_n下降的主要因素。     

甘蓝型黄籽油菜主要性状的通径分析

以7个不同遗传来源的甘蓝型黄籽品系配制的完全双列杂交组合作为样本，对甘蓝型黄籽油菜主要性状进行通径分析。主要结果为：全株有效果数和株高对单株粒重有最大正向作用，通径系数分别为0.514和0.535。皮壳率对黄籽度有直接的最大负效应，通径系数为-0.798。     

白菜型油菜DFR基因的克隆与序列分析

By using RACE (rapid amplification ofcDNA ends) based homologous cloning strategy, we have successfully isolated the genomic and full-length cDNA sequences of a gene encoding typical DFR (dihydroflavonol-4-reductase) from black-seeded Brassica campestris L. var. oleifera DC.. The gene, designated BcDFR here, is 1 722bp in length and harbors 5 introns with typical splice sites of plant DFR genes. BcDFR cDNA is 1311bp in length with a 1 158bp ORF as well as a 25bp 5‘ UTR and a 128bp 3‘ UTR. The encoded BcDFR protein is 385 aa with a calculated Mw of 42.85kD and a pI value of 5.55. The nucleotide and amino acid sequences of this gene share extensive homologies to plant DFR genes of wide origins especially high similarities to Cruciferous DFR genes. Sequence analyses such as phylogenetic analysis, conserved domain search and substrate specificity region detection all indicated that BcDFR gene is a quite potentially biofunctional gene. Its cloning enables us to further dissect the possible relatedness between DFR gene and Brassica seed coat color traits and to create transgenic novel yellow-seeded rapeseed germplasm through antisense- or RNAi-suppression of DFR gene expression in black-seeded elite cultivars.     

白菜型冬油菜铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)基因的克隆及其在低温条件下的表达分析

超氧化物歧化酶(SOD)是一种逆境条件下清除细胞内活性氧的关键酶,而铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)是该酶系中最主要的活性氧清除剂,与植物的抗逆性关系密切。本研究根据已发表的十字花科植物Cu/Zn-SOD基因的编码区设计引物,采用RT-PCR克隆超强抗寒冬油菜陇油7号Cu/Zn-SOD的cDNA序列,该基因全长459 bp。生物信息学分析表明,该基因与甘蓝型油菜(Brassica napus) Cu/Zn-SOD基因同源性高达99%,编码1个亲水性稳定蛋白,无跨膜结构域和信号肽,具有胞质Cu/Zn-SOD超基因家族特有的序列特征和保守结构区域。半定量RT-PCR以及SOD酶活性分析表明,低温诱导条件下Cu/Zn-SOD基因差异表达,在白菜型冬油菜适应低温胁迫过程中发挥重要作用。超强抗寒冬油菜陇油6号品种低温诱导蛋白的SDS-PAGE分析以及蛋白串联质谱技术鉴定表明Cu/Zn-SOD是受低温诱导表达的抗逆基因。     

RNAi沉默转基因油菜fad2基因表达的种子特异性分析

为研究RNAi沉默转基因油菜fad2基因表达的效果及其器官特异性,实时荧光定量PCR法分析比较了转基因油菜W-4与非转基因对照Westar开花后第7天、第14天、第21天、第28天的种子以及越冬期油菜根、茎、叶器官中的fad2基因的相对表达量。结果显示:对照Westsr种子中fad2基因的相对表达量随开花后的天数呈逐渐增加的趋势,但W-4种子中fad2基因的相对表达量在开花后第21天、第28天较对照Westar显著下降,降幅达到60%。说明转基因油菜W-4在种子发育过程中表达的fad2基因的dsRNA干扰了fad2基因表达。W-4与Westar在越冬期根、茎、叶器官中fad2基因的相对表达量基本一致,无显著性差异。脂肪酸组成分析结果显示:W-4种子中油酸平均含量达到81.5%较Westar增加了近15%,而多不饱和脂肪酸平均含量为5.25%,较Westar下降了近70%;但根、茎、叶中的脂肪酸含量二者无显著差异;结果表明转基因油菜中RNAi干扰fad2基因表达具有种子特异性,不干扰其它器官的fad2基因表达。研究还发现转基因油菜fad2基因表达下降的时期与napin基因表达时期同步,均始于开花后21d左右,表明目标基因的表达受napin启动子的准确控制。     

转基因甘蓝型油菜向其近缘种的基因漂移之研究进展

从甘蓝型油菜的生活周期出发,概述了甘蓝型油菜及其近缘种的开花习性、甘蓝型油菜与其近缘种的杂交亲和性、杂种及其回交后代的育性和适应性,评价了在中国环境条件下甘蓝型油菜中的外源基因向其近缘种漂移而导致生态风险的可能性。认为在中国环境条件下,转基因甘蓝型油菜向其野生杂草近缘种的基因漂移风险较小,而如何防止转基因向白菜型油菜（Brassica rapa）和芥菜型油菜（B.juncea）转移应作为中国转基因甘蓝型油菜基因基因漂移风险控制的关键。     

黑龙港流域不同白菜型冬油菜品种的农艺性状评价分析

以16个白菜型冬油菜品种为试验材料,在黑龙港流域特殊的干旱气候条件下,对白菜型冬油菜品种间农艺性状的变化进行了方差分析、相关性分析和聚类分析,筛选出适宜河北省低平原地区种植的冬油菜品种,为地下水超采区域内旱作雨养和轮作休耕制度下农业种植结构调整及冬油菜品种的种植选择提供理论依据。结果表明:在黑龙港流域,选择株高较高(146.1~152.7 cm)、一次分枝数(14.5~14.9)和主花序角果数(60.7~63.1)较多、二次分枝数较少且越冬率为95%~100%的油菜品种进行种植,可以获得较高的产量。参试品种中综合性状较好的品种为‘陇油16’、‘天油1358’、‘冬油-2’,适宜在本地区及气候条件相似地区种植。     

国内外甘蓝型油菜种质SSR标记遗传多样性分析

用SSR分子标记对国内外48份甘蓝型油菜品种进行遗传多样性分析,结果表明：筛选出的45对引物共扩增出326个位点,多态位点281个,多态性比率为86.2%;平均每对引物扩增的条带数和多态性条带数分别为7.2和6.2。多态性信息含量（PIC）在0.374~0.856,平均为0.699。遗传相似系数在0.48~0.79之间,参试材料差异较大;以0.51为阈值将48份参试材料划分为冬性、半冬性和春性三大类群,三大类群间相对独立又有一定程度的渗透,说明材料之间存在不同程度的亲缘关系。主成分分析与聚类分析结果一致。说明SSR标记能够较全面地反应种质材料的遗传多样性,能够为种质的保存提供帮助,同时可以用来分析育种材料的遗传多样性,对育种工作有重要的参考意义。