擎天凤梨泛素基因的克隆与序列分析

鉴于泛素与植物受高温等环境胁迫下产生的一些诱导型蛋白降解有关,本研究根据擎天凤梨Ostara早期花器的全长cDNA文库,经大规模随机测序及重叠群（contigs）内EST序列的拼接,获得了擎天凤梨多聚泛素基因全长cDNA序列（GenBank登录号：GQ890686）,序列长1896bp,开放阅读框长1323bp,编码441个蛋白氨基酸残基,蛋白质分子质量为49.3kD,等电点pI为6.59。蛋白二级结构预测显示,该蛋白主要由随机卷曲、延伸链、α螺旋和β-转角组成;系统进化树分析表明与拟南芥推定的多聚泛素UBQ10（gi｜23397122｜gb｜AAN31845.1｜）亲缘关系最近;经推断它是由5个单体泛素组成的多聚泛素。本研究有助于进一步探讨该基因在低温胁迫下的反应机理以及如何采用分子调控手段增强擎天凤梨的耐低温能力。     

小麦谷胱甘肽S-转移酶基因的克隆及原核表达

为了进一步研究小麦谷胱甘肽-S-转移酶基因(TaGST)的功能,采用RT-PCR方法分离了小麦谷胱甘肽-S-转移酶基因(TaGST)的ORF全长c DNA,并进行了生物信息学分析。结果表明:小麦TaGST基因的ORF全长690 bp,编码229个氨基酸;TaGST蛋白分子质量为25.81 k Da,p I为5.29。系统进化分析表明,该基因编码蛋白与水稻OsGST蛋白的氨基酸同源性最高,与已知植物GST家族成员的氨基酸序列聚类分析将TaGST聚为Phi类GST。构建原核表达载体p ET32-TaGST,对TaGST基因进行原核表达,SDS-PAGE结果表明,其所表达蛋白与预期蛋白大小一致。为进一步研究该基因的特性和功能奠定了理论基础。     

蜻蜓凤梨FLD同源基因的克隆及表达分析

FLOWERING LOCUS D(FLD)是植物自主开花途径花发育基因,在植物营养生长向生殖生长转变的过程中起重要的调控作用。本研究利用同源基因克隆法结合RACE技术克隆了蜻蜓凤梨(Aechmea fasciata)花发育基因FLD的类似基因AfFLD。序列分析比对表明,AfFLD所推测的氨基酸序列包含有LSD1-LIKE亚家族两个高度保守的结构域:SWIRM结构域和胺氧化酶结构域,该蛋白与玉米、拟南芥的FLD蛋白的同源性分别为72%和73%。利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术分析了乙烯处理不同时间FLD基因的表达模式,结果表明乙烯处理不同时间的各组中,处理后1d时FLD的表达量达到最高值,其中表达量最高为0h的2.5倍。本结果为开花自主途径中相关基因对乙烯处理后的响应机理的研究提供理论基础。     

花生溶血磷脂酸酰基转移酶基因的克隆与表达分析

溶血磷脂酰基转移酶(LPAT)是植物油脂合成途径的一个关键酶,在植物油脂品质改良和提高种子含油量方面具有重要的应用价值。本研究通过构建花生种子全长cDNA文库,结合大规模EST测序和功能注释,从花生中克隆了溶血磷脂酸酰基转移酶基因,命名为AhLPAT。该基因cDNA全长1 629 bp,对应的基因组序列5 531 bp,由11个外显子和10个内含子组成,内含子剪接方式符合GT-AG剪接规则。根据编码区预测AhLPAT编码一条387个氨基酸组成的多肽,预测分子量为43.2 kD,等电点为9.42。AhLPAT蛋白含有一个典型的酰基转移酶保守功能结构域以及溶血磷脂酰基转移酶相似的保守区域。该蛋白的氨基酸序列与已报道的其他物种LPAT蛋白序列有较高的一致性。AhLPAT与旱金莲、油菜、海甘蓝、蓖麻和拟南芥的LPAT蛋白氨基酸相似性依次为90%、89%、89%、88%和87%。系统进化分析表明,AhLPAT与拟南芥AtLPAT2亲缘关系较近,且同属于内质网型LPAT蛋白。RT-PCR分析表明,AhLPAT基因在花生根、茎、叶、花、果针和种子中均有表达,在花生开花后50~60 d,果针和种子中的表达量最高,且AhLPAT的表达量与花生种子含油量积累速率变化一致,二者显著相关(r=0.63,P<0.05)。推测AhLPAT基因在花生种子油脂合成中起重要作用。     

亚麻糖基转移酶基因LuUGT72E1的克隆与表达分析

以亚麻茎部组织总RNA为模版,通过反转录PCR获得糖基转移酶Lu UGT72E1基因的全长开放读码框序列。序列分析结果表明:开放读码框全长1 476bp,共编码491个氨基酸。通过多氨基酸比对发现,该蛋白与亚麻UGT72N2蛋白亲缘关系最近,相似度达99%,与毛果杨、巨桉、木薯、雷蒙德氏棉及拟南芥UGT72E1蛋白的氨基酸序列相似性在58%~51%。分子进化分析表明,该蛋白与拟南芥UGT72E1~3聚为一类,推测该蛋白参与木质素单体的糖基化修饰过程。基因表达谱结果表明,该基因被BR、Brz诱导下调表达。本研究为亚麻的纤维品质改良提供了候选基因。     

天然棕色棉葡萄糖苷转移酶基因Gh3GT的克隆与表达分析

本研究以发育18d的天然棕色棉及相同发育时期的白色棉近等基因系纤维细胞为材料,采用抑制性差减杂交结合RACE技术分离得到了一个葡萄糖苷转移酶基因的全长cDNA,命名为Gh3GT(GenBank登录号eu921265)。序列分析发现:该基因编码一条有450个氨基酸残基组成的多肽,含有葡萄糖苷转移酶C-端所特有的保守的信号序列PSPG基序,属于植物中特有PSPG基序的UGT家族成员。推断的Gh3GT编码产物与其它糖苷转移酶同源性比对和系统发生分析表明:该糖苷转移酶与玫瑰Rh3GT(Rosa hybrida)、矮牵牛(Petunia hybrida)PhF3GT以及葡萄VvUFGT(Vitis vinifera)的相似性分别为51.30%、46.94%和45.85%,而与已知的陆地棉糖苷转移酶基因GhUGT1和GhUGT2一致性较低,仅为25.37%和12.14%。半定量RT-PCR分析表明:该基因在棕色棉纤维中的表达量明显高于其它组织及其近等基因系白色棉品种,且其在纤维中的表达规律与棕色棉的色素形成过程一致。     

蜻蜓凤梨AfAP2-1基因的克隆与表达载体构建

通过对蜻蜓凤梨转录组数据的分析,我们获得一个跟拟南芥AP2同源片段,基于此设计引物,利用RACE技术首次从蜻蜓凤梨中克隆到完整的Af AP2-1序列,其c DNA全长2 185 bp,开放阅读框全长1 404 bp,编码467个氨基酸。保守结构域分析其含有两个AP2结构域,属于AP2亚家族。系统进化树分析发现该蛋白与拟南芥的AP2 RAP2.7亲缘关系较近。通过在CDS序列两端分别引入XbaⅠ和KpnⅠ限制性内切酶酶切位点,我们成功构建了Ca MV35S-Af AP2-1-GUS过表达载体。利用农杆菌介导法转化拟南芥植株后,再通过GUS染色和RNA水平鉴定发现Ca MV35S-Af AP2-1-GUS已转入拟南芥中并且能正常表达。本研究可为Af AP2-1的功能鉴定奠定基础,对深入研究凤梨科植物开花调控的分子机理具有重要意义。     

果子蔓凤梨Actin基因的克隆与序列分析

持家基因Actin常被用作定量、半定量PCR试验的内参,以确定目标基因的相对表达量。基于前期从全长cDNA文库中获得Actin基因的EST单克隆,进行Primer Walking测序,获得一个Actin基因的全长cDNA序列,序列长1625bp,ORF为1131bp,可编码377个蛋白氨基酸,命名为Goactin1(GenBank登录号:HQ184438)。蛋白质理论分子质量为41.7kD,等电点pI为5.31,包含一个Actin superfamily保守区,二级结构主要由随机卷曲、Alpha螺旋、延伸链和Beta转角组成。此外以2BTF A链为基础建立起了Goactin1蛋白的三级结构图。系统进化树分析表明Goactin1蛋白与马铃薯、棉花、烟草、短柄草、拟南芥等的Actin蛋白聚为一类,它们的亲缘关系最近。     

杜仲EuGT2基因的克隆及表达分析

糖基转移酶(glycosyltransferase,GT,EC 2.4.x.y)是植物次生代谢过程中一类重要的结构修饰酶,可参与催化受体分子进行糖基化修饰.本研究以杜仲为材料,基于前期构建的杜仲转录组数据设计杜仲糖基转移酶编码基因EuGT2克隆引物,克隆得到全长为285 bp的EuGT2片段,序列分析表明,该基因可编码...     

甜瓜乙烯受体基因Cm-ETR2的克隆及其在果实发育成熟过程中表达特性的分析

为研究Cm-ETR2基因在甜瓜果实发育成熟过程中的作用机理,根据已报道的甜瓜(Cucumis melo)品种Cantalupensis的Cm-ETR2基因序列,设计特异性引物,通过RT-PCR技术从甜瓜品种河套蜜瓜(Cucumis melo L.cvHetao)成熟果实中克隆得到了乙烯受体基因Cm-ETR2 cDNA,序列分析显示,序列长度为2 304 bp,编码767个氨基酸。利用实时荧光定量RT-PCR方法,对其在河套蜜瓜果实发育成熟过程中的表达特性进行了分析,Cm-ETR2基因在15DAP至30DAP表达基本没有变化,35DAP表达量开始上升,上升趋势一直持续至45DAP,且45DAP表达量为15DAP的9倍。     

葡萄VvMSA基因的克隆及表达特性分析

为了解VvMSA基因的功能,以抗性葡萄品种Vidal Blanc组培苗为试材,克隆得到VvMSA基因,对其序列进行了生物信息学分析,并利用实时定量PCR分析了其组织表达特性和多种非生物胁迫和信号应答表达特性。结果表明,VvMSA基因片段大小为450 bp,编码149个氨基酸序列。生物信息学分析结果显示,VvMSA蛋白分子量约为16.703 k Da,等电点为5.68,不稳定系数为41.71,推测为不稳定蛋白。VvMSA含有65个氨基酸组成的ABA/WDS保守结构域。在进化上属于单独一个分支,它和已报道过的番茄Le ASR1分别属于同一个祖先进化出的2个分支。实时荧光定量PCR分析显示,VvMSA在葡萄不同组织中均有表达,花中表达量最高。多种逆境胁迫因子如盐、干旱和低温等能诱导VvMSA不同程度的上调表达,盐胁迫3 h时诱导表达量最高。同时,VvMSA受逆境胁迫信号分子NO和H_2S不同程度诱导表达上调,而SA则抑制VvMSA表达。激素ABA、GA_3、IAA和ET均能不同程度诱导VvMSA表达上调,并且VvMSA盐处理下的表达模式与ABA诱导的类似。综合以上结果推断VvMSA可能通过调控ABA信号途径来调节葡萄对盐胁迫应答。     

七叶一枝花糖基转移酶基因的克隆及表达分析

糖基转移酶处于重楼皂苷生物合成途径的最后一步,催化薯蓣皂苷元或偏诺皂苷元的糖基化形成各种重楼皂苷,具有重要的研究价值。本研究通过对七叶一枝花进行转录组高通量测序、表达谱结合含量关联分析,筛选得到1条可能参与重楼皂苷生物合成的糖基转移酶(glycosyltransferase, GT)候选基因。通过克隆,获得Pp-GT全长基因(GenBank登录号:MW208819),长度为1 443 bp,就Pp-GT的蛋白质序列及进化等进行了生物信息学分析,并对其基因表达模式进行了研究。该研究为下一步重楼皂苷合成途径的阐明和Pp-GT基因的功能验证提供了科学依据。     

莲雾乙烯受体基因保守序列的克隆及分析

用莲雾的叶片提取基因组DNA作为模板,根据乙烯受体基因的保守序列设计引物,进行PCR扩增,得到长度约1.5kb的目的片段,将其克隆到pGEM T-easy载体转化大肠杆菌,提取质粒,进行限制性内切酶图谱分析及序列测定.结果表明,该目的片段全长为1400bp,与栽培稻(Oryza satzva)的osers基因组DNA可比对序列的一致性为98.68%.在所应用的12个内切酶中,该片段内部没有切点,根据序列特征和与其他乙烯受体基因序列比较,推测该片段有2个内含子和3个外显子片段组成,外显子总长为972 bp,编码324个氨基酸,其中第197～324氨基酸残基与组氨酸蛋白激酶的磷酸基团接受域有同源性.     

茶树茉莉酸羧基甲基转移酶基因(CsJMT1)的克隆与表达分析

茉莉酸羧基甲基转移酶(jasmonic acid carboxyl methyltransferase, JMT)在茉莉酸类介导的植物生长发育以及防御调控中发挥着重要作用。本研究以茶树品种‘黔茶1号’为材料,利用RT-PCR方法克隆了一个JMT基因并将其命名为CsJMT1。该基因编码区全长1 077 bp,编码358个氨基酸,含有一个Methyltransf_7功能结构域,属于SABATH家族成员。进化树分析显示其与柑橘和雷公藤的JMT序列亲缘关系最近,序列相似性分别为73.7%和72.7%。以CsJMT1的全长开放阅读框(ORF)序列构建GFP融合蛋白表达载体,基于拟南芥原生质体的亚细胞定位分析显示其定位在细胞质。原核表达和蛋白纯化显示在破碎的细胞上清中可以检测到目的蛋白的表达。对外源JA、SA和Me SA处理以及茶尺蠖取食后‘黔茶1号’叶片中CsJMT1的表达进行荧光定量PCR分析,结果显示外源JA、SA处理后其表达均显著下调,但在JA处理后48 h其表达量又明显上调;而MeSA处理后2 h CsJMT1的表达量达到峰值,随后又显著下调,在处理后24 h又恢复到处理前水平;茶尺蠖取食则能够显著诱导其表达。对3个品种的茶叶鲜叶摊放(萎凋)处理不同时间后检测CsJMT1的表达情况则显示摊放(萎凋)处理诱导了其表达,但不同品种的诱导程度存在差异。本研究结果初步明确了CsJMT1能够参与茶树防御响应以及香气形成调控。     

大豆逆境诱导基因GmPRP的克隆与表达

通过对大豆吉林32未成熟胚表达谱的分析,利用RT-PCR技术从大豆中克隆了一个新的脯氨酸富集蛋白基因,命名为GmPRP。GmPRP的开放阅读框长396 bp, 其分子量13.79 kD,具有131个氨基酸残基,等电点8.96,其DNA序列无内含子。GmPRP蛋白序列N端含有一段信号肽,中间为脯氨酸富集区,C端为半胱氨酸富集区。该蛋白与四季豆和木豆的PRP同源性最高, 具有较近的亲缘关系。GmPRP的683 bp启动子序列含有10种与逆境相关的顺式作用元件,分别为ABRE-like、G-box、W-box、GT-1、MYB、MYC、BIHD10s、DPBF、SEBF和WRKY。实时荧光定量PCR分析表明, 该基因表达量在大豆的根和叶中最高,在茎和胚中其次,在花中最低,且受干旱、高盐、低温、机械伤害及SA(水杨酸)、ETH(乙烯)、ABA(脱落酸)、MeJA (茉莉酸甲酯)的诱导上调表达。     

马尾松PmCOMT基因的克隆及实时定量表达分析

在木质素生物合成里,咖啡酸-O-甲基转移酶(caffeic acid-O-methyltransferase, COMT)起重要作用。本论文以马尾松幼苗作为材料,并通过PCR技术以及RACE技术从马尾松材料中克隆出Pm COMT基因的cDNA全长。该cDNA全长为1660bp,其中预测完整ORF全长为1125bp,可编码374个氨基酸的蛋白。蛋白相对分子质量为41.81 kD;等电点(pI)为5.03,总平均亲水性为-0.311。通过生物信息学的方法对其进行分析表明,Pm COMT基因具有典型的甲基转移酶的保守结构域。通过实时荧光定量表达分析表明,COMT基因在马尾松的不同组织均有表达,其中在新梢中的表达量最高,树皮中表达量最低。     

大豆GmHKT6;2基因的克隆与表达特性分析

为探明大豆中HKT蛋白基因的耐盐作用机理,从耐盐大豆材料中克隆到GmHKT6;2基因完整的cDNA序列,GmHKT6;2基因的开放阅读框(ORF)全长1 644 bp,编码547个氨基酸。序列比对与进化树分析表明:GmHKT6;2是大豆中的一个新HKT蛋白基因;GmHKT6;2基因在大豆的根、茎及叶中均能表达,150 mmol/L NaCl处理后,该基因在大豆根、茎及叶中的表达被强烈诱导并高效表达。结构域分析结果表明:大豆GmHKT6;2基因拥有10个可能的跨膜结构域(TMD)和阳离子转运蛋白保守结构域,推测其是通过调节相关阳离子的转运来调控大豆的耐盐性。