三丁基锡对罗氏沼虾卵黄蛋白原（VTG）表达和性腺发育的影响

将罗氏沼虾成虾浸浴于含三丁基锡（Tributyltin, TBT） (0.1、0.2、0.4mg/L）的水体中,研究TBT对其肝胰脏和性腺中卵黄蛋白原(VTG)表达和性腺发育的影响。结果表明,罗氏沼虾在TBT中浸浴10d,TBT能够诱导雌虾的肝胰腺VTG基因表达,而对卵巢VTG基因的表达则表现为抑制作用;TBT对雄虾的肝胰腺VTG基因表达有抑制作用,而对精巢VTG基因的表达无明显影响。性腺组织切片显示,TBT浸浴能够促进罗氏沼虾精巢的发育,且随浸浴剂量的增加对精巢发育的促进作用逐步增强,但TBT对罗氏沼虾卵巢发育无明显影响。     

凡纳滨对虾和罗氏沼虾肠道微生物及抗生素抗性基因多样性分析

探究凡纳滨对虾和罗氏沼虾肠道微生物及抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes, ARGs)种类的差异。通过高通量测序和变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE)技术分析2种虾肠道微生物群落结构差异和微生物多样性,并运用PCR方法检测了2种虾肠道细菌常见38种ARGs的携带情况。结果显示,获得凡纳滨对虾和罗氏沼虾肠道细菌有效序列分别为42 795和40 713条,物种注释单元(operational taxonomic unit, OTU)数目分别为124和82,分类地位明确的细菌种类分别隶属5个门、17个属和5个门、16个属。凡纳滨对虾肠道细菌的优势类群为变形菌门,所占比例为75.45%,优势菌属为副球菌属(25.83%)和不动杆菌属(25.24%);罗氏沼虾肠道细菌的优势类群是厚壁菌门(49.74%),优势菌属为乳球菌属(49.01%)和弧菌属(29.98%)。凡纳滨对虾肠道细菌(2.19)Shannon指数高于罗氏沼虾肠道细菌(1.78),表明前者肠道细菌多样性大于后者。DGGE图谱的分析结果与高通量测序一致,2种虾肠道细菌种类差异很大。PCR结果显示,凡纳滨对虾肠道细菌携带15种ARGs,罗氏沼虾肠道细菌携带14种ARGs。本实验表明凡纳滨对虾肠道细菌的群落种类多样性、OTU丰富度、物种总数和ARGs种类均高于罗氏沼虾肠道细菌,为后续肠道微生物资源的挖掘提供了理论依据。     

北方地区凡纳滨对虾亲虾越冬及幼体培育技术初探

从广西地区引进5月龄和7月龄的凡纳滨对虾10000对,从中选出健康无病的成虾作为后备亲虾8000对,放入工厂化车间培育4个月,探索亲虾在北方地区越冬培育技术和性腺发育过程,分析理化因子对亲虾性腺发育的影响.此外,总结提出凡纳滨对虾幼体生产技术.     

滨州地区凡纳滨对虾苗种虾肝肠胞虫病的调查和分析

为全面、系统地了解滨州市地区凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)苗种携带虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei, EHP)及爆发情况,对滨州地区37家凡纳滨对虾养殖池塘随机采集对虾苗种样本,根据SC/T 7232-2020 《虾肝肠胞虫病诊断规程》采用套式PCR法进行对虾苗种虾肝肠胞虫的检测,检测结果表明滨州地区虾肝肠胞虫阳性检测率为4.84%,同时监测虾肝肠胞虫病发病池和未发病池的水质,发现发病池的水体中pH值、COD等指标并没有显著差异,说明虾肝肠胞虫病爆发并不是由于养殖池水质导致的。     

凡纳滨对虾原肌球蛋白基因表达模式与重组表达

根据相近物种的同类基因设计引物,从凡纳滨对虾Litopenaeus vannamei肌肉组织中克隆获得原肌球蛋白基因（TPMS）,长度为901bp,其中包含长度为852bp的完整开放阅读框,编码原肌球蛋白分子量为32．8kDa;RT—PCR结果显示,原肌球蛋白在心、肝胰腺、胃、鳃、肠和肌肉组织中均有表达,在肌肉中表达量最高,在鳃中表达量最低;将原肌球蛋白基因构建原核重组表达载体TPMS—pET30a,转化受体菌株BL21（DE3）并利用IPTG诱导后能够大量表达,蛋白分子量为38．2kDa;经优化,IPTG的最适诱导浓度为0．05mmol／L,最适诱导时间为4h;经过亲和纯化后,能够得到纯度90％以上的重组表达蛋白。     

凡纳滨对虾核自身抗原精子蛋白基因克隆及其表达

利用cDNA末端快速扩增技术克隆出凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)核自身抗原精子蛋白(NASP)基因,NASP基因c DNA全长2258 bp,其中包括92 bp 5′端非编码区,147 bp 3′端非编码区及2019 bp开放阅读区,编码673个氨基酸,预测分子量为74.18 k D。该序列已提交至Gen Bank,序列号为KT274811。在NCBI上进行序列比对后发现,其与斑节对虾(Penaeus monodon)NASP序列相似性最高,为90%。采用荧光定量PCR方法测定了不同发育时期卵巢与肝胰腺中NASP m RNA相对表达水平,结果表明,NASP在卵巢中的表达量高于肝胰腺中的表达量,且在Ⅱ期表达量最高,Ⅲ期表达量最低。此外,通过构建系统进化树比较了凡纳滨对虾NASP与其他物种间的遗传距离。实验结果为进一步研究该基因在凡纳滨对虾卵巢发育中的作用提供了依据。     

常规PCR、实时定量PCR检测传染性皮下及造血器官坏死病毒的效果分析

对虾传染性皮下及造血器官坏死病毒(IHHNV)可感染世界各地养殖对虾,给对虾养殖业造成严重经济损失。本实验首次采用实时定量PCR法对广西地区的84份凡纳滨对虾样品进行检测,同时以常规PCR检测作对照。实时定量PCR检测阳性率为79·8%,常规PCR检测阳性率为40·5%,表明广西地区养殖的凡纳滨对虾IHHNV的感染率较高。将二者检测均呈阳性的30份样品扩增产物进行序列分析测序,测序结果通过DNA STAR软件包进行分析,并通过NCBI Blast与GenBank中的序列进行比对。结果证明,测定的是IHHNV序列。30份样品的IHHNV序列很保守,可以分为4种类型,仅有两个碱基的位置发生变异。实时定量PCR检测IHHNV,快速、灵敏、准确,特异性好,可以作为检测对虾感染病毒的有效方法。     

实时荧光定量PCR技术及其在水生动物病毒病定量检测中的应用

聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction, PCR)是美国科学家Mullis于1983年发明的一种在体外快速扩增特定基因的方法,其最早的应用报道是Saiki等[1]1985年应用于β-珠蛋白基因的扩增和镰状细胞性贫血的诊断分析.     

基于TaqMan qPCR检测凡纳滨对虾样品中虾肝肠胞虫并样检测方法的评价

对山东海阳和潍坊的2个养殖凡纳滨对虾群体取样,采用TaqMan qPCR逐尾检测肝胰腺中的虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei, EHP)载量,再将提取的DNA样品按5并1(5∶1)、25并1(25∶1)、50并1(50∶1)、100并1(100∶1)和150并1(150∶1)进行并样,检测并样的EHP载量。设定不同临界循环数为假定灵敏度,定性判断各单尾检测阳性及并样组阳性,比较不同并样模式与检测阳性率、诊断灵敏度、诊断特异性等之间的关系以及定量的准确性。结果表明,检测灵敏度过低,会降低高并样率检测的准确性;阳性率在30%以上时,高并样率的检测结果与单样品检测相符性很好;高载量感染的阳性率不低于6.7%时,50∶1以内的并样能准确得出检测结果;低载量感染的阳性率不低于16%时,25∶1以内的并样能得出较好结果;高载量感染的1.3%阳性率和低载量感染的8%阳性率可能导致所有并样出现假阴性结果;各种并样模式均有很好的诊断特异性,50∶1并样的诊断灵敏度与OIE标准推荐的5∶1并样的接近;各并样检测的EHP载量与单样品检测平均值之比在0.27~2.83范围,二者存在极显著相关性,各种并样模式的定量检测结果在数量级水平能大致反映样品的平均EHP载量。本研究为水生动物疫病诊断和流行病学调查的样品检测提供了参考依据。     

虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei)实时荧光定量PCR检测方法的建立及对虾样品的检测

根据GenBank中公布的虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei) (EHP) SSU rDNA序列设计1对特异性引物,建立并优化了EHP的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR (qPCR)检测方法.结果显示,该方法在60℃的退火温度时扩增效果最好,产物的熔解曲线为1个单峰,构建的方法对8.3×101-8.3×108 copies/μ1的EHP SSU rDNA片段的检测响应具有良好的线性关系,扩增产物阈值循环数(Ct)与模板起始量的对数[log(Sq)]的关系为Ct=-3.369 log(Sq)+39.364 (R2=0.992),扩增效率为98.1％,检测灵敏度下限为8.3× 10(1) copies/μ1,在线性范围内具有良好的组内和组间重复性.对实际样品的检测表明该方法比已报道的套式PCR的检测灵敏度约高4倍.利用本方法对采集自江苏、海南和山东的3批凡纳滨对虾样品的肝胰腺组织DNA (HpDNA)中的EHP SSU rDNA进行了qPCR检测,结果显示,EHP的载量指数与对虾生长速率呈负相关关系,肝胰腺中EHP载量在103 copies/(ng HpDNA)时代表了较高的风险水平.本研究建立的qPCR方法具有特异、灵敏、快速、定量的优点,所建立的方法及检测数据可为EHP的防控提供技术参考.     

添加嗜酸乳杆菌对凡纳滨对虾生长、酶活性及相关酶mRNA表达的影响

本实验旨在研究饲料中添加嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)幼虾生长、非特异性免疫酶活性、抗病力和相关酶m RNA表达的影响。选取840尾初始均重为(0.58±0.01)g的凡纳滨对虾幼虾为研究对象,分为7个处理,每个处理3个重复。投喂添加不同比例(0%,0.1%,0.2%,0.4%,0.6%,0.8%,1.0%)嗜酸乳杆菌的饲料,养殖期8周。结果显示:添加不同比例嗜酸乳杆菌对凡纳滨对虾的成活率无显著影响(P0.05)。增重率与特定生长率随添加量的增加呈先上升后下降的趋势,但均显著高于对照组(P0.05),在0.4%组达到最大值;当添加0.2%时,饲料系数最低,其他各组显著低于对照组(P0.05),而蛋白质效率的变化规律则与饲料系数相反。血清酚氧化物酶(phenoloxidase,PO)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP)和酸性磷酸酶(acid phosphatase,ACP)活性随添加量的增加先升高后降低,分别为0.4%、0.1%和0.2%时,达到最大值。过氧化氢酶(catalase,CAT)、溶菌酶(lysozyme,LZM)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性,实验组均显著高于对照组(P0.05)。实验组过氧化氢酶(CAT)m RNA表达量和溶菌酶(LZM)m RNA表达量均显著高于对照组(P0.05)。哈维弧菌(Vibrio harveyi)攻毒96 h,对虾存活率随添加量的增加显著升高(P0.05)。以增重率(weight gain rate,WGR)为判断依据,根据折线模型得出,饲料中添加0.23%嗜酸乳杆菌可显著促进凡纳滨对虾生长,并提高非特异性免疫酶活性。     

南美白对虾和罗氏沼虾血细胞中酚氧化酶活力的比较

对比研究了不同化合物对南美白对虾和罗氏沼虾血细胞溶解上清液(HLS)中酚氧化酶原激活系统(pwPO系统)的激活效果.实验结果表明南美白对虾和罗氏沼虾HLS中proPO系统可以被多种化合物激活.其中实验用内源性激活剂以LPS的激活作用最强,Laminarin、Zymosan A、β-1,3-1,6-glucan和Peptide的激活效果次之;外源性激活剂中SDS对2种虾都有显著的激活作用,而Trpsin对南美白对虾的激活作用不显著,对罗氏沼虾激活作用显著;金属离子Ca2+和Mg2+对proPO系统都有激活作用,对南美白对虾HLS中PO活力,Ca2+的激活作用随着Ca2+浓度的增加而增强,Mg2+在100 mmol/L时激活作用最强,而对罗氏沼虾HLS中PO活力,Ca2+和Mg2+均在20 mmol/L时激活作用最强.     

罗氏沼虾开放和闭锁核心育种群生长和存活性能分析

开放核心育种体系可增加核心群体的选择强度,进而增加育种目标性状的遗传进展。本研究以罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)为研究对象,向闭锁核心群(closed nucleus population,NP)内引入扩繁群(multiplier population, MP)个体,构建两个杂交群体(正交群体NP/MP,反交群体MP/NP),并以闭锁核心群(NP/NP)为对照,应用线性混合效应模型(linear mixed effects model, LME)和广义线性混合模型(generalized linear mixed model, GLMM)对不同群体收获体重和存活率的估计边际均值进行比较,评估在虾类选择育种中构建开放核心育种体系的可行性。结果显示:(1) NP/NP、MP/NP和NP/MP群体的收获体重估计边际均值分别为45.83 g、49.57 g和46.62 g;与NP/NP群体相比, MP/NP和NP/MP群体分别提高了8.16%和1.72%。(2) NP/NP、MP/NP和NP/MP群体的存活率估计边际均值分别为72.92%、68.04%和66.55%;与NP/NP群体相比,MP/NP和NP/MP群体分别降低了6.69%和8.74%。综上所述,在罗氏沼虾核心群中引入扩繁群个体,构建开放核心育种群体,可以有效地增加收获体重的遗传进展;同时在制定选择指数时,应加大存活性状的权重,选择生长和存活性能均优良的家系生产扩繁群体,导入闭锁核心育种群,构建生长和存活性能均优良的开放核心育种群。     

水解单宁对凡纳滨对虾生长性能和肠道微生物的影响

为分析水解单宁对凡纳滨对虾生长及其肠道微生物菌群结构的影响,以基础饲料为空白组,在基础饲料中分别添加0.1%、0.2%和0.3%的水解单宁作为实验组,进行为期60 d的养殖实验后,统计生长性能,并取其肠道内容物提取DNA,用Illumina MiSeq测序平台进行16S rDNA基因V3～V4区高通量测序,检测对虾肠道内菌群结构及变化情况。结果表明:(1) 3个水解单宁添加组的增重率、特定生长率和肥满度与对照组相比均显著升高(P0.05),肝体比均显著降低(P0.05)。(2)4组样品中共获得206192条优化序列,操作分类单元(OUT)总数达542个。对照组凡纳滨对虾肠道微生物以变形菌门和蓝细菌门为主,其次是放线菌门和拟杆菌门;试验组肠道主要菌群为变形菌门、软壁菌门。试验组与对照组相比,蓝细菌门、放线菌门和拟杆菌门的比例降低,变形菌门、软壁菌门和厚壁菌门比例增加。(3)Rank-Abundance曲线和多样性指数结果可见,实验组的物种丰度和均匀度大体上均高于对照组。PCoA分析发现, 0.1%和0.3%添加组的微生物群落较为接近,而与0.2%添加组差别较大,结合生长性能指标可知,饲料中水解单宁的最适添加量为0.1%。以上研究表明,饲料添加水解单宁可显著改变对虾肠道的微生物组成,提高对虾生长速度,影响凡纳滨对虾的生长性能。     

用焦磷酸测序技术检测凡纳滨对虾组织蛋白酶基因单核苷酸多态性

焦磷酸测序是一种新型的DNA测序技术,近年来开始应用于单核苷酸多态性(SNPs)检测.组织蛋白酶基因(Cathepsin-L,CTSL)在对虾的蜕皮周期中起重要的作用.本研究利用焦磷酸测序技术,对96个凡纳滨对虾的CTSL基因序列(GnBank登录号:AY366355)的C681G SNP位点进行检测分型.结果发现C/C、C/G和G/G基因型,频率分别是0.81、0.16和0.03,频率分布符合Hardy-Weinberg平衡.统计分析结果表明在该群体中C681G SNP和体重关系不显著(P>0.05).研究结果显示焦磷酸测序技术是一种高效的SNP检测技术,可以在对虾的遗传研究中发挥重要作用.     

源于凡纳滨对虾血蓝蛋白的化学合成肽段的免疫调控活性

以源于血蓝蛋白化学合成肽段B1为研究对象,运用蛋白质组学、分子生物学等策略分析其对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)的免疫调控活性。结果显示,与对照组比,对虾在受到肽段B1刺激后,血浆中2条分子量分别为65 kD和35 kD的蛋白条带(分别命名为p65和p35)表达水平显著上调。经质谱和Western blot鉴定, p65、p35与包括对虾β-1,3-葡聚糖结合蛋白、葡聚糖模式识别脂蛋白、血蓝蛋白等在内的13个蛋白具有高度同源性,其中p65与兔抗血蓝蛋白抗体呈明显的阳性反应。实时荧光定量PCR检测显示,肽段B1刺激对虾24 h后, 5个质谱鉴定免疫相关基因:血蓝蛋白大亚基、血蓝蛋白小亚基、谷氨酰胺转氨酶、α2巨球蛋白亚型2、葡聚糖模式识别脂蛋白在肝胰腺、鳃和血细胞等组织中mRNA的表达水平显著性(P0.05)或极显著性(P0.01)上调。由此推测,源于凡纳滨对虾血蓝蛋白的化学合成肽段B1对包括血蓝蛋白在内的多种免疫因子的表达具有一定的调控作用。     

凡纳滨对虾EST微卫星标记初步筛选

对161 075条凡纳滨对虾dbEST(database of “Expressed Sequence Tags”)的数据进行SSR序列筛选,搜索参数为二~六核苷酸重复6次以上(包括6次),共获得含SSR的EST序列12 600条,占整个凡纳滨对虾dbEST数据库的7.8%,其中二核苷酸重复10 104条,占总ESTSSR序列的80.2%; 三核苷酸重复2 036条(16.1%),四核苷酸重复336条(2.7%),五核苷酸重复35条(0.3%),六核苷酸重复89条（0.7%）。大部分发现的微卫星序列为完美型(perfect)的重复序列。在二核苷酸所获得的SSR重复单元中,AG/CT是优势重复单元,共分布4 820条,占二核苷酸各重复单元的47.8%;其次是AC/GT重复,共分布3 584条,占二核苷酸各重复单元的35.4%;最后是AT/TA 和CG/GC,分别占二核苷酸各重复单元的16.6%和0.2%。通过对凡纳滨对虾EST序列中SSR位点信息的发掘分析,共设计77对微卫星引物,在10个个体中成功扩增的引物有54对,成功扩增率为70.1%。其中多态性丰富的引物28对,多态率为51.9%。等位基因数为2～5,PCR产物大小为140～600 bp。本研究筛选的ESTSSR标记将为凡纳滨对虾的分子遗传学研究、种质鉴定等提供可靠的工具。     

凡纳滨对虾在氯化物型盐碱水养殖环境下不同家系间生长、存活性能分析

本研究以凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)61个家系为材料,开展了为期50 d的氯化物型盐碱水混合养殖测试,分析了各个家系的生长和存活性能。研究结果显示,凡纳滨对虾家系在氯化物型盐碱水养殖环境下的体重和存活率均存在显著差异,且家系间体重和存活率差异较大,变异系数分别高达36.26%和46.82%;凡纳滨对虾家系的绝对增重率均值和特定增重率均值分别为0.09g/d和1.82%/d,绝对增重最快的家系比绝对增重率均值高7.54个百分点,比增重最慢家系高12.95个百分点;凡纳滨对虾家系存活率范围为1.00%~63.33%,家系平均存活率为26.61%,家系最高存活率比家系最低存活率高了62.33个百分点,比家系存活率均值高了36.72个百分点。本研究结果表明:凡纳滨对虾家系在氯化物型盐碱水养殖条件下生长、存活存在较大差异,具有较大的遗传改良空间和选育潜力,本研究结果可为下一步的凡纳滨对虾盐碱水选育工作提供数据支持。     

罗氏沼虾养殖群体表型性状间的相关性及类群差异分析

为研究罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)养殖群体表型性状间的相互关系及不同类群间的性状差异,本研究对人工养殖的罗氏沼虾雌、雄及“老头虾”3个类群共490个个体的体重、体长、全长等12个表型性状进行了相关分析、形态性状对体重影响的通径分析等。结果表明, 3个类群除上、下额刺数2个可数性状外,其他9个可量形态性状与体重都呈极显著的正相关(P<0.01);影响体重的关键形态性状在3个类群中各不相同,但体长、头胸甲长、第二步足长在3个类群中均是影响体重的关键指标;分别建立了各类群体重与关键形态性状的多元回归方程。聚类分析和主成分分析结果表明,雌、雄2个类群表型上更为相似,“老头虾”与雌性个体的差异最大。腹部轮廓特征(包括腹长、腹宽、腹高)、全长、体长及第二步足长对3个类群的差异贡献较大。雌性个体腹部发达,“老头虾”则第二步足尤为发达。本研究结果可为罗氏沼虾的选择育种、基础生物学及行业标准的制定提供数据资料。