北美鹅掌楸LtuHMGS基因的克隆与生物信息学分析

[目的]研究北美鹅掌楸LtuHMGS基因的结构特性、亚细胞定位及表达模式,为从分子水平探究北美鹅掌楸萜类合成途径提供理论基础.[方法]从北美鹅掌楸转录组数据库中鉴定出一条HMGS基因序列,采用RACE技术克隆其全长cDNA,将其命名为LtuHMGS.对LtuHMGS基因的ORF进行生物信息学分析,探究其理化性质及与同源...     

圆齿野鸦椿YABBY基因家族鉴定及功能分析

YABBY基因家族在叶片、花器官、果实等生长发育方面具有调节功能。为了明确圆齿野鸦椿YABBY基因家族成员的基本特征,利用生物信息学手段对圆齿野鸦椿YABBY基因家族进行鉴定及功能分析。结果表明：在圆齿野鸦椿基因组中共鉴定出9个YABBY基因,非均匀分布在5条染色体上,通过系统发育树将其划分为5个亚族：FIL/YAB3、INO、YAB2、YAB5和CRC,多数基因有8个内含子。圆齿野鸦椿YABBY基因家族的主要扩增方式为片段复制。圆齿野鸦椿YABBY基因家族的表达具有组织特异性,EkYABBY3、EkYABBY7和EkYABBY8分别在胚胎、雌蕊和雄蕊进行了高表达,EkYABBY9在花蕾和花瓣+萼片上进行了低表达,在其他组织进行了高表达。YABBY基因启动子2 000 bp处含有多个非生物胁迫响应和激素响应元件,如光响应元件、赤霉素响应元件。圆齿野鸦椿种子发芽率低且具有深休眠现象,研究发现INO类基因和YAB2类基因在其种子发育过程中发挥重要作用,本研究结果为进一步深入研究YABBY基因家族对圆齿野鸦椿种子发育的生物学功能提供科学依据。     

北美鹅掌楸LtCHS基因的克隆及生物信息学与组织表达特征分析

【目的】鹅掌楸属花色种间差异较大,是研究木本植物花色形成与调控机制的较理想材料。查尔酮合成酶基因( CHS)是黄酮类化合物生物合成途径中的关键基因,与植物花色形成密切相关,同时又是研究科以下系统发育的理想基因,种间进化差异较大,因此 CHS基因用于研究鹅掌楸属花色差异形成机制有较强的可行性。本研究克隆北美鹅掌楸的查尔酮合成酶基因,并对其进行生物信息学及组织表达分析,以期为鹅掌楸属树种花色的形成和调控机制研究提供参考。【方法】以北美鹅掌楸的花芽为材料,采用同源克隆和 RACE 技术克隆查尔酮合成酶基因( LtCHS),并进一步扩增该基因的基因组序列。对该基因进行生物信息学分析。采用半定量 RT-PCR 方法分析 LtCHS基因在鹅掌楸属种间及不同组织中的表达水平。【结果】获得2个查尔酮合成酶基因： LtCHS1与LtCHS2。LtCHS1基因的 cDNA全长875 bp,包含1个702 bp的ORF,其基因组DNA ( gDNA)只含有1个外显子,没有内含子,编码233个氨基酸,蛋白质分子量为71.88 kDa,等电点为5.09。LtCHS2基因的 cDNA 全长1457 bp,包括1个1185 bp的 ORF,其 gDNA含有2个外显子和1个内含子,编码394个氨基酸,蛋白质分子量为120.0 kDa,等电点为4.97。2个基因的组织表达分析结果显示,LtCHS 基因不仅在同一树种不同组织间存在差异,而且在种间也存在表达差异。LtCHS1基因仅在北美鹅掌楸中表达,LtCHS2基因在鹅掌楸中表达,在杂交鹅掌楸中二者均有表达。【结论】获得的2个 LtCHS基因属于同一基因家族,但执行不同功能。二者在种间表达存在差异可能与鹅掌楸属花色形成有关。结合鹅掌楸属种间花色特征,可初步推测,LtCHS1基因与 LtCHS2基因可能分别调控不同类型花青素的合成。     

望春玉兰WRKY基因家族生物信息学分析

WRKY超级转录因子基因家族,参与植物生长、发育、非生物胁迫以及次生代谢产物的调节.该文鉴定了药用植物望春玉兰全基因组WRKY基因,并采用生物信息学方法,分析了该基因家族成员的蛋白理化性质、亚细胞定位、系统进化、保守结构域、顺式作用元件,以及在不同组织中的表达模式.在望春玉兰全基因组中共鉴定56个WRKY基因;根据进化...     

鹅掌楸LcPAT8基因的克隆及功能初步分析

【目的】基于前期鹅掌楸生长性状与EST-SSR分子标记关联分析结果,克隆分离与鹅掌楸生长性状相关联的SSR位点相对应的基因,通过分析其序列特征、结构特征、与其他物种同源基因的亲缘关系和表达特性,初步了解该基因在鹅掌楸生长发育过程中的作用。同时,利用遗传转化技术对分离的基因进行功能研究,以期为鹅掌楸生长发育的分子机制研究及功能基因挖掘奠定基础。【方法】以鹅掌楸叶芽为材料,借助其叶片转录组数据库,采用RT-PCR和RACE技术克隆分离与鹅掌楸生长性状相关联的642号位点对应的EST序列相关基因,对其进行生物信息学分析。通过实时荧光定量PCR检测该基因在鹅掌楸花芽、盛花期的叶芽、叶片、花瓣、雄蕊、雌蕊中的相对表达量。利用Gateway技术构建该基因的植物过表达载体,使用农杆菌GV3101介导的花絮浸染法转化拟南芥,获得T2代转基因植株,直接观察转基因植株表型。【结果】克隆获得与鹅掌楸生长性状相关联的642号位点相对应的基因,该基因全长1 968 bp(GenBank登录号:KU883608),开放阅读框为1 269 bp,编码422个氨基酸。生物信息学分析表明该基因编码的蛋白序列含有1个典型的DHHC-CRD结构域,属于DHHC型锌指蛋白家族成员,与其他植物预测的蛋白质棕榈酰基转移酶(PAT)高度相似,并根据与NCBI中拟南芥PAT基因的比对结果,将其命名为LcPAT8。组织表达分析表明,LcPAT8基因在鹅掌楸花芽、叶芽等6个组织中均有表达,在雌蕊中表达量最高,花瓣和叶片中的表达量高于叶芽和花芽,而在雄蕊中的表达量最低。利用Gateway技术,成功构建了鹅掌楸LcPAT8基因的植物过量表达载体,获得T2代转基因拟南芥。与野生型拟南芥相比,过表达LcPAT8基因的拟南芥植株的莲座叶片数目以及抽薹时间没有发生明显变化,而野生型植株大部分角果成熟、叶片枯黄掉落时,转基因植株依然生长旺盛,叶片鲜绿并且还有大量花絮,在野生型植株干枯死亡后,转基因植株还有大量侧枝生长、开花。【结论】鹅掌楸LcPAT8基因在雌蕊中表达量最高,其次是花瓣,可能参与花瓣的扩展、心皮及胚的发育;在拟南芥中过表达LcPAT8基因,明显延长了植株的生长期。因此,鹅掌楸LcPAT8基因可能在植物生长发育过程中起着重要的调控作用。     

杜仲ARF基因家族全基因组鉴定和表达分析

【目的】杜仲是我国特有的传统药用和胶用木本植物,其生长发育相关基因研究对杜仲育种有重要意义。生长素响应因子(ARF)是生长素信号转导途径中重要的转录因子,了解ARF在杜仲器官发育中的作用具有重要的理论和实际应用价值。【方法】利用杜仲全基因组测序数据鉴定杜仲ARF基因,并对这些基因进行生物信息学分析;根据杜仲EuARFs与拟南芥、水稻和欧美杨ARF蛋白的序列比对,构建系统进化树;根据转录本全长测序数据分析杜仲叶片不同生长时期的ARF基因表达谱,并利用qRT-PCR分析杜仲ARF基因与调控ARF基因的miRNA在不同器官不同发育时期的表达模式。【结果】共鉴定出18个杜仲ARF基因,根据系统进化树可以将EuARFs分为5类; miRNA靶位点分析表明eu-miR160s调控Ⅱ亚族的EuARFs,eu-miR167s调控除了EuARF8.2的V亚族的EuARFs。表达谱结果显示EuARFs在叶片不同生长时期的表达不同,其中V亚族EuARFs与Ⅵ亚族EuARF19.2在3 cm长的生长叶和完全展开的幼叶中表达量较高。qRT-PCR试验结果显示,EuARFs在正常生长条件下不同发育阶段(幼嫩和成熟)的器官(根、茎和叶)中均有表达,在根中表现为在成熟阶段上调表达,叶和茎段中表现为在成熟的器官中下调表达; eu-miR160s主要在幼嫩的根中表达,eu-miR167s则主要在成熟的叶片中表达。【结论】共鉴定出18个杜仲ARF基因,这些EuARFs在正常生长条件下不同发育阶段(幼嫩和成熟)的器官(根、茎和叶)中均有表达,根据表达量可以预测V亚族的EuARFs对幼苗的生长发育具有调控作用,EuARF19.2对杜仲叶片生长具有重要调控作用。     

欧李Dof基因家族鉴定及非生物胁迫表达分析

【目的】探究欧李Dof(DNA-binding with one zinc finger)锌指蛋白在非生物胁迫条件下的功能，为ChDof基因的研究与利用奠定基础。【方法】基于欧李全基因组和转录组数据对Dof基因家族进行鉴定，并利用实时定量PCR分析Dof基因在非生物胁迫下的表达情况。【结果】欧李共有23个Dof基因家族成员，其编码区CDS序列长度为226～515 bp，相对分子质量为24 227.52～55 368.21，理论等电点为4.78～9.36，且其在欧李的8条染色体上都有分布。在构建欧李和拟南芥的系统进化树中发现，欧李共分为9个亚组，同一亚族成员中的基因结构和蛋白保守基序均具有较高的相似性，且欧李Dof基因家族成员主要分布在D1亚组中。在对其亚细胞定位时发现，绝大多数ChDof基因主要分布于细胞核中。对欧李Dof家族成员启动子区域顺式调控元件的预测结果表明，其启动子区存在着至少1个激素调节及逆境胁迫反应元件。qRT-PCR分析结果表明，绝大多数的ChDof基因在盐、高温和低温胁迫下的表达量均上调，而ChDof11、ChDof12、ChDof17基因在盐、渗透（PEG）、高温和...     

珙桐DiZF-CCCH1基因的克隆及表达分析

【目的】珙桐Davidia involucrata有性生殖能力弱是限制其自然更新的主要原因。为研究珙桐种子发育的分子机制,本课题组前期完成了珙桐种子转录组分析,筛选到1个编号为c37849.graph_c0的转录本,其在正常种子中高量表达,而在发育异常的种子中表达量很低,差异表达显著,因此将其作为研究目标。【方法】使用PCR克隆该转录本的全长序列,并利用在线分析工具对其编码氨基酸的序列特征、蛋白结构和系统进化等进行生物信息学分析预测,采用qRT-PCR检测目标基因在珙桐不同组织部位以及种子不同发育阶段中的表达情况。【结果】序列分析确定目标基因为一个编码CCCH型锌指蛋白转录因子的基因,将其命名为DiZF-CCCH1,该基因开放阅读框全长为711 bp,编码236个氨基酸,无内含子,相对分子量26.74 kDa,为不稳定蛋白,其氨基酸序列含有植物特有的RR-TZF结构域,与来源于甜橙Citrus sinensis的CCCH蛋白同源性最高。基因表达模式分析显示,DiZF-CCCH1在种子发育前期的表达量最高,后期表达量降低,在其他组织中仅有微量表达,推测其可能在种子发育过程中发挥重要作用。【结论】对珙桐DiZF-CCCH1基因进行了克隆与初步生物信息学分析,发现其编码的蛋白属于RR-TZF型锌指蛋白,且DiZF-CCCH1可能是珙桐种子发育过程中的重要调控基因,为进一步探索该基因在珙桐生殖发育过程中的功能奠定基础。     

毛竹铵态氮转运蛋白的分子特征及基因表达模式

【目的】氮素是植物生长发育必需的大量元素,铵态氮是根系可利用的主要氮源形式之一,铵态氮转运蛋白(AMT)在铵态氮的获取和运输中发挥着重要作用。速生是毛竹最主要的特点,鉴定其中的AMT基因,并对其结构和表达模式进行系统分析,为深入研究毛竹AMT家族基因在快速生长和环境适应性中的功能奠定基础。【方法】采用生物信息学方法鉴定毛竹AMT家族基因成员,对其系统发育、结构特征、组织表达特异性以及对激素和非生物胁迫应答进行分析,通过q PCR方法验证关键基因在干旱处理下的表达模式。【结果】在毛竹基因组中共鉴定出13个AMT家族基因,命名为PeAMT1-PeAMT13,其编码蛋白长度为408～497个氨基酸,亚细胞定位预测显示所有PeAMTs均定位于质膜上。系统发育分析表明,PeAMTs分为2个亚家族,不同亚家族之间具有各自的特异基序,但全部PeAMTs的Motif 2都包含了铵转运蛋白的典型保守序列。共线性分析结果表明,有8对PeAMTs存在共线性,而且11个PeAMTs与8个Os AMTs存在共线性,在进化过程中PeAMTs经历了纯化选择。PeAMTs具有组织表达特异性,多数在毛竹根部和叶片的表达水平最高,其次是发育初期的笋,在发育后期木质化程度较高的笋中表达水平较低。PeAMTs启动子中包含多种激素和非生物胁迫应答元件,GA3、油菜素内酯(BL)和干旱处理能引起多数PeAMTs表达量的显著变化,NAA和低温处理也能引起6个PeAMTs表达量的显著变化。筛选关键基因PeAMT1、PeAMT2和PeAMT3进行干旱处理下的q PCR验证,结果表明三者的表达变化均达到显著水平。【结论】毛竹中具有13个编码完整AMT的基因(PeAMTs),它们在结构特点和组织表达特异性方面均存在一定的差异,其表达受到激素和非生物胁迫的影响。PeAMTs可能通过在根部高表达协助毛竹从土壤中获取铵盐,在叶片中高表达对铵盐进行转移和回收,保证毛竹快速生长过程中充足的氮供应;同时可能在提高毛竹抗逆性中发挥铵解毒的功能。     

毛竹微管蛋白的分子特征及PeTUA3的功能

【目的】微管蛋白是植物细胞骨架的重要组成部分,在植物细胞分裂与生长、细胞形态维持、细胞内物质运输和细胞壁的生物合成等过程中均发挥着重要作用。为全面了解毛竹微管蛋白的分子特征,开展了毛竹微管蛋白全基因组鉴定与分析,并初步研究了Pe TUA3基因的功能,以期为揭示微管蛋白在毛竹生长发育过程的作用提供参考依据。【方法】采用生物信息学的方法开展毛竹中微管蛋白基因的全基因组分析,利用转录组数据和实时荧光定量PCR技术分别分析微管蛋白基因的组织表达模式及其随笋高度增加的表达变化,通过在拟南芥中异位表达及表型观察初步研究Pe TUA3基因的功能。【结果】在毛竹基因组中共获得18条微管蛋白基因序列,编码蛋白具有完整的保守结构域,蛋白长度为430～634 aa,分子量为48.31～69.89 k Da。在与水稻、拟南芥微管蛋白构建的系统进化树中,被聚类到2个亚家族(TUA和TUB),且毛竹各微管蛋白成员与水稻的亲缘关系更近,这些基因分别命名为Pe TUA1-Pe TUA6和Pe TUB1-Pe TUB12。亚细胞定位预测显示PeTUAs均定位在细胞质中,而PeTUBs均定位于细胞核中。基于转录组数据的基因组织特异性表达分析表明,不同微管蛋白基因在毛竹7个不同组织中的表达量存在着一定的差异,如Pe TUA3、Pe TUA6、Pe TUB2和Pe TUB3在各个组织中均有较高的表达,而Pe TUA2和Pe TUB12在各组织中表达量均较低。实时荧光定量PCR结果显示,随着毛竹笋高度的增加,6个TUA亚家族成员基因的表达均呈现上调趋势,而TUB亚家族成员基因中有8个呈现上调趋势,4个表现为波动变化,表明它们在笋的不同发育阶段可能发挥着不同的作用。在拟南芥中正义表达Pe TUA3促进了转基因植株的生长,尤其是对主根的伸长有明显促进作用,而转反义Pe TUA3则抑制转基因植株的生长,主根生长明显受到抑制。【结论】从毛竹中鉴定了6个TUA基因和12个TUB基因,各基因的分子特征存在着一定的差异,并且各基因在毛竹不同组织以及不同发育阶段笋中呈现出不同的模式,说明它们在不同组织以及同一组织的不同生长发育阶段可能发挥着不同的功能;过量表达Pe TUA3能够影响转基因拟南芥的生长,说明Pe TUA3对毛竹的快速生长可能具有重要的作用。     

小兰屿蝴蝶兰R2R3-MYB转录因子分析

[目的]本研究为了探讨在植物发育和抗逆过程扮演着重要角色的MYB转录因子的潜在功能。[方法]利用拟南芥MYB转录因子家族蛋白序列(At MYBs)和已报道的蝴蝶兰R2R3-MYB转录因子家族蛋白序列(Pe MYBs),采用本地化软件BLASTP对小兰屿蝴蝶兰全基因组数据库进行搜索,并利用Pfam数据库验证MYB结构域,获得小兰屿蝴蝶兰MYB转录因子家族编码序列(Pe MYBs)125条,包含1R-MYB结构域的Pe MYBs蛋白序列27条,R2R3-MYB结构域96条,R1R2R3-MYB结构域2条。重点对96条R2R3-MYB结构Pe MYBs蛋白序列特点进行生物信息学分析。[结果]依据拟南芥的分类标准将小兰屿蝴蝶兰R2R3-MYB类转录因子划分为20个亚群,预测获得同源性较高的直系和旁系同源基因;各基因在四种器官(花、叶、根、茎)中的表达情况各异,39个Pe MYBs基因在4种器官中均表达,48个基因在不同器官中有特异性不表达现象,一些基因呈现器官特异性表达特点,推测其可能参与相应组织特定发育时期的调控。[结论]预测获得125条Pe MYBs蛋白序列,并对部分Pe MYB转录因子可能的调控功能进行了预测,将为细致研究蝴蝶兰MYB转录因子调控植物生长发育和逆境胁迫响应的分子机理提供一定的数据基础。     

光皮桦BlBLH1基因的克隆、表达及互作蛋白筛选

【目的】BLH基因家族是广泛存在于植物中的转录因子,其与KNOX等转录因子的互作被认为在植物的次生壁发育中起重要调控作用。本研究拟克隆光皮桦BlBLH1基因,分析其表达模式,并筛选能与其互作的蛋白。【方法】利用Blast等软件在光皮桦基因组序列中鉴定获得BlBLH1序列,克隆验证后对其进行多序列比对、系统进化等生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR分析BlBLH1在光皮桦不同组织、器官和应拉木形成中的表达模式;通过酵母双杂交技术筛选BlBLH1互作的蛋白,并采用双分子荧光互补实验(BiFC)进一步验证其与部分蛋白在拟南芥细胞内的互作。【结果】BlBLH1基因序列全长为2 128 bp,开放阅读框(ORF)为1 830 bp,编码609个氨基酸,具有SKY、BEL和HD 3个保守结构域。系统进化分析显示,BlBLH1与拟南芥BLH1有最近的同源关系。表达分析显示BlBLH1在雄花序中的表达量最高;在木质化茎段中的表达量次之;在应拉木诱导过程中,BlBLH1在应拉木中的表达量均显著高于对照。通过酵母双杂交筛选获得结构蛋白、酶、转录因子等47个与BlBLH1互作较强的蛋白;BiFC验证结果表...     

麻疯树AP2/ERF基因家族孤儿基因Soloist的克隆与原核表达分析

【目的】含有AP2结构域的AP2/ERF蛋白是与植物抗逆性密切相关的转录因子家族,Soloist是AP2/ERF家族中的孤儿基因,大部分植物只有1个。克隆麻疯树该基因编码框的全长c DNA序列,并对其理化性质、基因结构、启动子区域调控元件、表达特性及蛋白原核表达进行分析,为深入开展麻疯树Soloist基因的功能鉴定及其在麻疯树遗传改良中的应用提供依据。【方法】利用AP2结构域的隐马尔可夫模型结合拟南芥与水稻的Soloist蛋白序列对麻疯树蛋白质数据库进行相似性检索,经过Pfam与CDD在线工具的验证获得麻疯树AP2/ERF基因家族成员。利用不同的工具对Soloist基因进行生物信息学对比分析。通过实时荧光定量PCR检测该基因在麻疯树不同器官及低温处理下的相对表达量。通过双酶切构建该基因的原核表达载体,并转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株进行IPTG诱导表达,分别收集不同诱导时间段的菌液,SDS-PAGE检测融合蛋白的表达情况。【结果】共鉴定到119个麻疯树AP2/ERF家族基因,其中包含1个Soloist基因,命名为Jc Soloist。序列分析显示,麻疯树Jc Soloist基因编码框长度为699 bp,编码232个氨基酸,预测分子量为26.3 k Da,理论等电点为9.65,包含6个外显子与5个内含子。在其基因启动子序列中鉴定到TATA框、CAAT框,以及赤霉素、水杨酸及干旱等应答元件。表达分析显示,麻疯树Jc Soloist基因在麻疯树各器官中都有表达,但表达水平具有器官特异性,在根中表达量较高,而在叶片中表达量相对较低,同时,在叶片与根中都属于低温诱导表达基因,分别在低温胁迫3 h与24 h达到最大表达量,较对照提高34.38倍与3.83倍。构建了p ET-32a-Jc Soloist重组载体,且在原核细胞中稳定表达,SDS-PAGE结果显示融合蛋白分子量为46.0 k Da,与预期大小一致。【结论】麻疯树AP2/ERF基因家族鉴定到1个Soloist基因,包含由3条反平行β-折叠与1条α-螺旋组成的AP2结构域,与其他物种的报道一致。基因启动子区域鉴定到赤霉素、水杨酸等顺式作用元件,暗示该基因在麻疯树激素信号转导中发挥重要作用。Jc Soloist基因在麻疯树叶片与根中受低温诱导表达显著,说明该基因参与麻疯树低温响应过程以及低温信号转导途径,也成为麻疯树抗冷新品种选育的候选基因。     

青杄MYB转录因子基因PwMYB20的克隆及表达分析

【目的】MYB转录因子家族是植物中最大的一类转录因子,在植物生长发育及抗逆调控网络中发挥重要作用。对青杄中MYB同源基因Pw MYB20的克隆与分析,有利于进一步探究Pw MYB20在植物生长发育及逆境响应中的功能,挖掘与利用青杄中的优质基因。【方法】采用RACE-PCR技术,从青杄c DNA文库中克隆得到Pw MYB20基因,并通过PCR技术克隆验证。利用Prot Param、Prot Scale、Fold Index等生物信息学软件对Pw MYB20理化性质进行分析预测。通过BLAST在线工具得到植物同源蛋白,并对其进行比对分析和进化树分析。采用实时荧光定量PCR技术分析Pw MYB20基因在不同组织中的表达性,以及干旱、低温、盐、ABA等非生物逆境胁迫处理后的表达变化。通过亚细胞定位及转录激活活性验证试验,揭示其生物学特性。【结果】通过RACE-PCR克隆得到Pw MYB20 c DNA全长966 bp,含675 bp的完整开放阅读框,编码225个氨基酸。Prot Param工具计算蛋白分子式为C1104H1740N340O330S8,分子质量为25.3 k Da,等电点为9.11;Protscale工具疏水性分析发现,Pw MYB20的疏水位点与亲水位点均匀分布,推测该蛋白为亲水蛋白;Signal P工具预测发现该蛋白没有信号肽结构域;利用Fold Index工具对蛋白质固有无序化进行分析,结果表明该蛋白固有无序化序列较多,推测在生理环境下蛋白的动态活性较大;TMHMM工具预测发现该蛋白没有跨膜结构域。通过对比分析发现Pw MYB20属于MYB家族基因,编码1个R2R3-MYB蛋白。进化树分析结果显示,青杄Pw MYB20与白云杉Pg MYB20聚为一簇。实时荧光定量PCR结果表明,Pw MYB20在种子中的表达量最高,其次是在针叶中,在花粉中的表达相对较少。Pw MYB20对干旱、4℃和ABA处理均有响应,而对Na Cl处理响应相对较弱。在干旱处理下,Pw MYB20表达量先上升后下降;4℃低温处理3 h和12 h时Pw MYB20的表达量上升,在4℃处理6 h时存在波动,呈现上升—下降—上升的趋势;Pw MYB20的表达受ABA处理持续诱导。亚细胞定位分析表明,Pw MYB20是一个主要定位于细胞核中的蛋白质。转录激活活性分析结果显示,Pw MYB20的C端存在转录激活活性,而Pw MYB20全长及其N端没有转录激活活性。【结论】青杄Pw MYB20,作为一个转录因子发挥作用,其转录激活活性位于C端;受干旱、低温和ABA诱导,普遍参与了植物应对逆境胁迫的响应过程。     

暴马桑黄SbLSD基因克隆及差异表达分析

【目的】暴马桑黄是一种重要的药用资源,三萜是其发挥药用功效的主要成分,但是目前获取大量三萜仍然非常困难。通过对暴马桑黄三萜合成途径中的羊毛甾醇14α-脱甲基酶(lanosterol 14-alpha-demethylase,LSD)基因进行克隆及差异表达分析,以期深入了解暴马桑黄三萜合成的调控机理,进而提高三萜产量。【方法】采用PCR扩增得到LSD基因cDNA序列全长,利用生物信息学软件对该基因编码的氨基酸序列进行分析;采取同源重组方法构建原核表达载体,转入大肠杆菌BL21(DE3)后诱导表达,SDS-PAGE检测;qRT-PCR技术分析LSD基因在暴马桑黄不同发育阶段转录水平差异。【结果】暴马桑黄LSD基因cDNA全长1 662 bp,编码553个氨基酸,相对分子量为62.26 kDa,命名为SbLSD(登录号为MN864180);跨膜区和亚细胞定位预测显示SbLSD蛋白是在内质网和高尔基体发挥作用的跨膜蛋白;系统进化树结果表明暴马桑黄和灵芝的LSD蛋白同源性最高,符合物种经典分类;SDS-PAGE结果证实在62.26 kDa附近出现目的蛋白条带,说明所获得的基因可以成功表达出蛋白;从荧光定量分析结果中可以看出SbLSD基因转录水平在不同发育阶段有差异性,并且在子实体阶段该基因转录水平最高,与羊毛甾醇合成的基因变化规律相吻合。【结论】通过对SbLSD基因的分子鉴定解析,为进一步揭示该基因在暴马桑黄三萜合成途径中的功能奠定基础。     

沙棘转录因子HrWRKY53基因分离及其参与抵御绕实蝇的作用分析

【目的】明确HrWRKY53基因的生物信息学及其参与沙棘抗绕实蝇功能,为解析沙棘等胡颓子科植物抗虫机制及分子育种奠定基础。【方法】基于绕实蝇危害前后沙棘果实转录组数据,挖掘HrWRKY基因家族成员中参与绕实蝇危害的关键差异表达基因HrWRKY53,进一步分析该基因的二级结构、亲疏水性及预测磷酸化位点等。利用BLASTP检索同源性高的其他物种蛋白序列进行比对并构建系统发育树;利用qRT-PCR检测该基因的组织表达特异性,绕实蝇危害前后以及脱落酸(Abscisic acid, ABA)、茉莉酸甲酯(Methyl jasmonate, MeJA)、乙烯(Ethylene, ETH)处理下的该基因表达模式;并进一步分析响应绕实蝇危害的茉莉酸(Jasmonic acid, JA)信号途径上关键基因HrJA2、HrLOX1、HrAOS和HrAOC的表达水平,分析其与HrWRKY53基因表达的相关性。【结果】基于沙棘转录组获得HrWRKY53的开放阅读框(Open reading frame, ORF)全长为1 302 bp,编码433个氨基酸残基的蛋白,该基因含有2个WRKY保守结构域和1个C     

油茶WRKY基因家族鉴定及逆境胁迫表达分析

【目的】WRKY转录因子在植物应对生物和非生物胁迫中起重要调控作用。油茶是我国南方丘陵地区重要的经济树种,常受各种逆境胁迫影响。深入挖掘油茶WRKY基因家族成员并探讨其应对逆境胁迫的表达调控模式具有重要意义。【方法】以油茶全基因组数据为参考,利用生物信息学方法,鉴定分析了CoWRKYs基因家族成员,并基于油茶逆境胁迫的相关转录组数据,明确CoWRKYs在低磷、干旱和低温等非生物胁迫下的表达模式,最后基于qRT-PCR方法解析CoWRKYs在不同逆境胁迫下的瞬时表达特征。【结果】CoWRKYs基因家族包含89个成员（CoWRKY1～CoWRKY89）。根据系统发育特征可将其分为3大类,I类、II类和III类的数量分别为20、55和14。保守基序分析表明,进化关系密切的CoWRKYs蛋白具有相同或相似的基序组成。CoWRKYs在低磷、干旱、低温等非生物胁迫下表达谱分析的结果显示,65个CoWRKYs呈现显著表达差异,其中17个CoWRKYs同时受三种非生物胁迫的调控,且大部分基因在逆境胁迫下表现为上调表达,推测这些CoWRKYs在油茶的非生物逆境胁迫中可能起正调控作用。qRT-PCR结果表...     

毛竹SQUAMOSA启动子结合蛋白SBP家族基因的鉴定及表达模式分析

【目的】SBP家族基因编码的一类转录因子可识别并结合MADS-box基因SQUAMOSA(SQUA)的启动子,参与植物营养生长和生殖生长的调控。系统地鉴定和分析毛竹SBP家族基因,有助于理解SBP家族基因在毛竹营养生长和生殖生长过程中的调控作用,为毛竹SBP家族基因功能分析奠定基础。【方法】利用已公布的毛竹基因组数据,通过生物信息学方法鉴定毛竹SBP家族基因。利用MEGA 6.0、DNAMAN、psRNATarget等生物信息学软件获得毛竹SBP家族基因基本生物学信息。通过实时荧光定量PCR分析SBP家族基因在毛竹根茎叶、花序发育不同时期和实生苗受到高盐胁迫时的表达模式。【结果】在毛竹基因组中共鉴定到18条SBP家族基因,这些基因都有单一且高度保守的SBP结构域,其中有10条SBP家族基因具有miR156靶位点。毛竹SBP结构域有74个氨基酸残基,包括2个锌指结构域和1个NLS结构域。毛竹SBP转录因子进化关系、基序分布和DNA结构结果表明,进化关系相近的毛竹SBP转录因子的Motif和基因结构均具相似性。对不同物种来源的SBP家族基因进行进化分析发现,毛竹SBP家族基因与水稻SBP家族基因进化关系较近。对SBP基因在毛竹根茎叶中的相对表达量进行研究发现,PeSBP11和PeSBP16表达量分别在茎和根中最高。在花序发育P1-P4期(P1:花序形成初期;P2:小穗的分化;P3:颖花的分化;P4:小穗的生长),有6个基因(PeSBP1,PeSBP2,PeSBP3,PeSBP7,PeSBP15和PeSBP17)表达量较低,且无明显的表达量变化;7个基因(PeSBP5,PeSBP9,PeSBP10,PeSBP12,PeSBP14,PeSBP16和PeSBP18)在P1-P2期表达量上升,其中PeSBP10与PeSBP14的高表达延续到P3期;7个基因(PeSBP6,PeSBP8,PeSBP9,PeSBP10,PeSBP14,PeSBP16和PeSBP18)在P3期表达值较高;5个基因(PeSBP4,PeSBP5,PeSBP9,PeSBP13和PeSBP16)在P4期表达值较高。在高盐胁迫环境下,随着高盐胁迫处理时间的延长,PeSBP2,PeSBP3,PeSBP4,PeSBP8,PeSBP10,PeSBP11,PeSBP12与PeSBP14相对表达量逐渐上升。【结论】毛竹SBP家族基因在进化上非常保守,在进化过程中毛竹基因组可能并未出现特异的SBP基因。实时荧光定量PCR分析显示毛竹SBP家族基因参与了毛竹的营养器官生长,而且在毛竹开花过程中也发挥了重要的作用。在逆境盐胁迫条件下,有4个毛竹SBP基因的表达量发生了明显上调,表明毛竹SBP家族基因可能参与了毛竹对高盐的响应。     

毛竹NIP基因的分子特征及应答胁迫的表达模式

【目的】膜内在水通道蛋白(NIPs)是细胞膜上运输水分子和一些小分子物质的膜蛋白,在植物生长以及抵御逆境胁迫等方面发挥着重要作用。温度和水分是影响竹子生长发育的重要环境因子,研究温度和干旱胁迫条件下毛竹NIP家族成员的表达模式,以揭示其在毛竹应答胁迫中的功能。【方法】利用生物信息学软件对毛竹基因组中NIP家族成员基因及其启动子序列进行系统分析,基于转录组数据分析基因在毛竹不同组织中的表达模式,并用实时荧光定量PCR(q PCR)技术检测基因在温度和干旱胁迫条件下的表达特征,构建2个NIP基因的酵母表达载体,分析它们的表达对酵母抗干旱和盐胁迫能力的影响。【结果】在毛竹基因组中共获得14个编码完整NIP蛋白的基因(Pe NIP1-1—Pe NIP1-6、Pe NIP2-1—Pe NIP2-4和Pe NIP3-1—Pe NIP3-4),含有3～5个内含子;在Pe NIPs启动子区域中含有多种与胁迫、激素相关的调控元件; Pe NIPs编码蛋白的氨基酸长度为235～297 aa,相对分子量为24.03～31.84 k Da;亚细胞定位预测显示所有PeNIPs均定位于细胞质膜上。共线性分析表明,有12个Pe NIPs与水稻8个NIP基因存在27对片段重复,它们的非同义对同义取代比(Ka/Ks)均小于1,表明毛竹Pe NIPs经复制后主要经历了较强的纯化选择。系统进化分析表明,来自毛竹和其他5个物种的NIP蛋白可分为3类(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ),毛竹在各类中的成员依次为6、4和4个。PeNIPs共包含10个保守基序,其中基序1、2和4为PeNIPs所共有。转录组表达谱热图分析表明,Pe NIPs在不同组织中的表达存在一定的差异,如Ⅰ类的Pe NIP1-3、Pe NIP1-4和Pe NIP1-5在根中表达,而在笋中几乎不表达;Ⅱ类的4个Pe NIP2s以及Ⅲ类的Pe NIP3-1和Pe NIP3-2在根和笋中表达量较高。q PCR结果显示,随着胁迫时间的延长,4℃处理下8个基因上调表达,2个基因下调表达; 42℃处理下,2个基因上调表达,4个基因下调表达;而干旱胁迫下3个基因上调表达。表达Pe NIP1-1和Pe NIP2-2的酵母在添加山梨醇或Na Cl培养基上的生长优于对照。【结论】从毛竹中共鉴定出14个NIP家族基因成员(Pe NIPs),各基因的分子特征、表达模式均存在着一定差异,说明它们在毛竹生长发育的不同阶段和响应环境胁迫中可能发挥着不同的作用;在酵母表达的Pe NIP1-1和Pe NIP2-2能够一定程度上提高酵母的抗干旱和盐胁迫能力,说明它们在毛竹应对逆境胁迫中可能发挥着重要作用。     

毛竹GRF转录因子的生物信息学及表达分析

通过生物信息学手段,对毛竹GRF(Growth-regulating factors, GRFs)转录因子基因家族成员展开研究。主要包括对毛竹转录因子家族成员的鉴定,基本信息的分析,进化分析,基因结构分析,保守基序分析,保守结构域分析,以及在不同组织中的表达分析。一共鉴定了18条毛竹GRF转录因子。根据拟南芥、水稻的系统进化树分析,将毛竹GRF转录因子划分为6个家族。利用Gene structure、NCBI和MEME在线分析软件,发现毛竹GRF转录因子的基因结构和氨基酸序列较为保守。表达量分析发现GRF转录因子普遍在花中表达丰度最高,其次在竹笋侧芽中表达丰度较高,而在叶片中表达量较低,表明GRF转录因子在毛竹花发育以及笋尖生长发育过程中发挥着重要的作用。