抗性和敏感小菜蛾谷胱甘肽-S-转移酶和谷胱甘肽的比较

研究了抗性和敏感小菜蛾谷胱甘肽 - S-转移酶 ( GSTs)在不同发育期的变化及有机磷类杀虫剂对虫体谷胱甘肽 ( GSH)质量摩尔浓度的影响 .结果表明 :抗性和敏感小菜蛾 GSTs比活力在各发育期中变化不大 ,但虫体 GSTs总活力随虫体生长发育而显著增加 ,在 4龄和蛹期达到最大值 .抗性小菜蛾 GSTs活力明显高于敏感小菜蛾 .甲胺磷和水胺硫磷对敏感小菜蛾幼虫 GSH影响不明显 ,但可导致抗性小菜蛾 GSH质量摩尔浓度的显著降低 .因此可以认为 ,GSTs活力增高和 GSH的结合作用应是小菜蛾对有机磷类杀虫剂抗性的重要机制 .     

一个水稻谷胱甘肽-S-转移酶启动子的特性分析

从水稻基因组文库中筛选得到1个水稻谷胱甘肽-S-转移酶基因,命名为OsGSTL1。为了研究OsGSTL1启动子在植物体内的表达特性,将OsGSTL1起始位点5′-端上游不同长度的调控序列与报告基因GUS融合,并在洋葱表皮瞬间表达和拟南芥中稳定表达。研究表明:在洋葱表皮细胞中,160 bp及更长的上游调控序列均能启动GUS基因的表达;而在转基因拟南芥中,含有2 155 bp的上游序列的PGL2.1::GUS具有时空表达的特性,在转基因的早期幼苗中GUS基因在子叶中特异性表达,但在根中没有表达;而在幼苗生长的后期,根、茎、叶中都有少量的表达。但包含1 224 bp的上游序列的PGL1.2::GUS却表现为组成型表达的特性。由此推测,OsGSTL1启动子启动的基因表达可能与幼苗的营养代谢相关;而OsGSTL1启动子的时空表达相关元件可能位于GST起始位点5′-端上游-2 155 bp~-1 224 bp范围内。     

一个橡胶树谷胱甘肽-S-转移酶基因的克隆和表达特性分析

 【目的】从橡胶树中克隆Glutathione-S-transferase（GST）基因的cDNA和基因组DNA,进行序列、结构和系统进化分析,研究胁迫条件和激素处理下的表达谱。【方法】利用产排胶机理课题组构建的胶乳EST数据库,通过PCR技术克隆橡胶树GST基因的cDNA和基因组DNA;在线预测蛋白质保守功能域和亚细胞定位,构建系统进化树,利用实时荧光定量PCR分析割胶、伤害、低温、激素和死皮病等因素对该基因表达的影响。【结果】从橡胶树胶乳中克隆到1个GST基因的全长cDNA（793 bp）,编码25.4 kD（219aa）蛋白,命名为HbGSTU1;克隆了HbGSTU1的基因组DNA（1 313 bp）,包含1个内含子（520 bp）和2个外显子。HbGSTU1属于GST Tau家族,推测是一种无信号肽的细胞质蛋白,其N端结构域包含结合GSH的G位点,C端结构域包含特异结合底物的H位点;HbGSTU1与一个蓖麻GST蛋白的亲缘关系最近,氨基酸序列的一致性为85%;HbGSTU1的表达受割胶、伤害、低温、2,4-D、乙烯利和死皮病等因素调控,但对JA、SA和ABA处理的应答不明显。【结论】HbGSTU1是一个典型的GST Tau家族蛋白,可能在橡胶树抗逆过程中起作用,可作为橡胶树抗逆分子育种的靶标基因。     

藏药喜马拉雅紫茉莉谷胱甘肽-S-转移酶基因的克隆及表达分析

谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione-S-transferase,GST)是参与谷胱甘肽催化反应的关键酶,在生物解毒、应激耐受和次级代谢等多个方面发挥生物学功能.本研究以藏药喜马拉雅紫茉莉为材料,基于前期转录组数据,从cDNA中克隆出谷胱甘肽-S-转移酶(GST)基因MhGSTL3,该基因开放阅读框(ORF)全...     

溴氰菊酯在罗非鱼组织中的累积及对谷胱甘肽-S-转移酶的影响

以罗非鱼Tilipia为试验鱼类,研究了其暴露于不同浓度溴氰菊酯后其组织中溴氰菊酯的含量和谷胱甘肽-S-转移酶GST活性的动态变化。结果表明,罗非鱼肌肉和肝脏组织中的GST的正常值分别为(4.39±0.2)U.mg.prot-1和(13.3±0.3)U.mg.prot-1。采用不同浓度的溴氰菊酯处理罗非鱼25 d,除了1.0μg.L-1浓度组罗非鱼体内无明显累积,GST与对照组相比无显著差异外,其余各浓度组均有一定的累积,同时GST发生了明显的变化。GST的变化规律为先升高后降低,即溴氰菊酯对罗非鱼体内的GST是先诱导后抑制,且这种变化幅度肝脏比肌肉大。2.0￣10.0μg.L-1浓度组经15￣20 d可在肌肉和肝脏中达到累积-释放的动态平衡,最大累积系数分别为1.85和2.20。溴氰菊酯在罗非鱼组织中达到累积平衡时,其累积量与GST活性呈较明显的负相关。研究表明,1.0μg.L-1以下的溴氰菊酯对罗非鱼没有生化毒性影响,罗非鱼组织中的溴氰菊酯累积量和GST可用来评价农药对鱼类的毒性效应。     

木纳格葡萄谷胱甘肽-S-转移酶VvGST1基因克隆与序列分析

【目的】克隆木纳格葡萄果实中谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione-S-transferase, GST)基因VvGST1全长并研究其序列特征,为该基因在葡萄果实抗病作用和功能的研究奠定基础。【方法】根据已有的基因序列,设计3’和5’端RACE引物,利用RT-PCR和RACE技术克隆VvGST1基因cDNA全长。【结果】该基因序列全长719 bp,均为开放阅读框(ORF),共编码221个氨基酸。该基因编码蛋白相对分子质量为25.55 kDa;理论等电点pI值为6.32;分子式为C₁₁₇₈H₁₇₉₉N₂₉₃O₃₂₁S₁₁;不稳定指数为39.22;该蛋白质是稳定的亲水性蛋白,不含跨膜结构域,没有预测到信号肽,可能存在于细胞基质中,是典型的基质蛋白。VvGST1氨基酸序列与棉花、桃、西梅、樱桃、李子、板栗等植物聚为一类,其中与棉花属亲缘关系最近。【结论】获得了木纳格葡萄谷胱甘肽-S-转移酶VvGST1基因全长编码序列,探明了该序列的结构特征。     

A型流感病毒PB1-F2蛋白的原核表达、纯化及鉴定

对A型流感病毒PB1-F2蛋白进行了原核表达及纯化,获得了谷胱甘肽硫转移酶(GST)-PB1-F2融合蛋白,以用于研究流感病毒PB1-F2蛋白的功能及分子作用机制。以RT-PCR方法扩增PB1-F2基因,将其克隆至原核表达载体pGEX-6P-1上。重组质粒pGEX-6P-1-PB1-F2转化大肠杆菌(Es-cherichia coli)菌株BL21,并诱导表达,利用谷胱甘肽-Sepharose 4B亲和柱进行纯化,所得产物进行SDS-PAGE、Western blot试验鉴定。结果显示,大肠杆菌细胞经诱导,表达出了相对分子量约为36kDa的蛋白,与GST-PB1-F2融合蛋白大小相符;Western blot鉴定显示,该融合蛋白能够被抗GST的抗体特异性识别。试验在大肠杆菌表达系统中成功表达纯化了GST-PB1-F2融合蛋白,为深入研究PB1-F2蛋白的功能奠定了基础。     

植物谷胱甘肽-S-转移酶在植物修复中的作用

谷胱甘肽-s-转移酶在植物抗逆性中发挥着重大的作用,简述了谷胱甘肽-s-转移酶在各种胁迫下的响应机制及其在植物修复中的研究进展。     

肉鸡谷胱甘肽S-转移酶A3基因的克隆及蛋白的表达和纯化

[目的]谷胱甘肽S-转移酶A3(GSTA3)是GSTs超家族中α家族的一员,具有解毒功能,同时还参与抗氧化应激引起的信号通路调节,另外在类固醇和前列腺素的合成中也必不可少。[方法]本试验采用RT-PCR方法扩增肉鸡GSTA3基因,连接pZeroBack/blunk克隆质粒,再与表达载体pET-28a连接,并转入E.coli BL21(DE3)中获得pET-28a-GSTA3重组表达质粒,使用IPTG诱导其蛋白的表达,应用镍柱亲和层析法纯化蛋白,并对其进行SDS-PAGE鉴定,使用谷胱甘肽-S转移酶活性测定试剂盒对重组蛋白进行活性检测。[结果]试验成功构建重组表达质粒pET-28a-GSTA3,并在大肠杆菌中成功表达,其大小为29.6 kDa,与预期一致,并且表达的重组GSTA3蛋白具有生物活性。[结论]本试验成功获得高纯度的可溶性GSTA3融合蛋白,为其在家禽领域的进一步研究奠定了基础。     

日本血吸虫谷胱甘肽硫转移酶原核表达载体的构建及序列分析

为构建带有组氨酸标签(his-tag)的日本血吸虫谷胱甘肽硫转移酶(sjGST)表达载体。以载有sjGST基因的载体PGEX-KG为模板,PCR扩增sjGST基因,并在进行酶切和基因测序后将其克隆到pET28a载体上。运用生物学软件与具有代表性的血吸虫GST基因进行比对并对可能的表达产物进行分析。结果表明,PCR产物与3种sjGST基因有99%的同源性。重组载体构建成功。     

人胎盘谷胱甘肽S-转移酶的快速分离纯化

将人胎盘组织粗匀浆、超速离心、GSH-Sepharose6B亲和纯化,再经DEAE52纤维素离子交换层析,分离纯化了人胎盘谷胱甘肽S-转移酶(GST-π).纯化的酶比活力为66.94 μmol*min-1*mg-1,纯化倍数为515倍,人GST-π的最适pH值为7.5;冷冻干燥后,在-20℃可保存1年.体外实验表明,酶在37℃保温90 min,酶活性下降80%.     

兰州地区NDV的分离鉴定及M蛋白的原核表达

为了分离出兰州地区鸡群新城疫病毒(NDV,Newcastle disease virus)并将M蛋白进行原核表达。通过鸡胚尿囊腔接种培养分离得到的兰州地区NDV,采用血凝及血凝抑制实验和Western bolt对病毒进行鉴定。利用分子克隆方法将NDV M蛋白进行原核表达,用Western blot技术分析其反应原性。根据NCBI发表的NDV M基因构建进化树。结果表明,成功分离的NDV悬液经RT-PCR技术扩增出M基因片段,重组菌p ET-M经SDS-PAGE分析,在约42 k Da处有一明显的蛋白条带,Western blot技术证明其具有良好的反应原性。M基因进化树分析,分离毒株与La-Sota具有极高同源性。本研究成功分离出兰州地区NDV并将M蛋白进行原核表达,同时确定分离毒株与La-Sota毒株的同源性极高。为后续针对兰州地区新城疫流行病学调查和综合防控技术提供实验依据。     

越橘谷胱甘肽巯基转移酶基因的克隆及表达

以越橘(Vaccinium L.)品种"北陆"为试材,采用反转录PCR克隆技术成功克隆越橘谷胱甘肽巯基转移酶基因c DNA全长序列,获得一个完整的编码区c DNA序列,长为690 bp,编码229个氨基酸,将其命名为VcGSTU1(Gen Bank登录号KT601064)。经与谷胱甘肽巯基转移酶家族其他成员的氨基酸序列比对和系统进化分析,初步确定VcGSTU1属于谷胱甘肽巯基转移酶Tau家族。生物信息学分析表明,该蛋白不稳定指数为28.80,属于稳定蛋白。预测该蛋白分子量为25.499 ku,等电位点为5.68。蛋白质序列同源比对发现其含有完整的GST-N-Tau和GST-C-Tau结构域。利用反转录PCR和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)2种方法分析谷胱甘肽巯基转移酶的表达模式,该基因在越橘的根、茎、叶芽、叶、花芽、绿果、粉果、蓝果、蓝果果皮、蓝果种子中均有表达,且在蓝果种子中相对表达量最高。     

增效磷对昆虫体内还原型谷胱甘肽及谷胱甘肽转移酶的影响

增效磷(SV_1)对敌百虫在棉铃虫、粘虫、二化螟及小白鼠4种测试动物上均表现增效作用,增效比值为2～3.本试验用增效磷进行昆虫体壁或小白鼠口投处理,体内谷胱甘肽(GSH)含量在5小时后明显下降。离体状态下,二化螟6龄幼虫中肠谷胱甘肽转移酶(GST)被增效磷抑制,当增效磷浓度为5.1×10~(-8)molL~(-1)时,抑制率可达68.3%。体内抑制试验表明,用 SV_1预处理5小时后,GST活性首先增大,以后慢慢降低,24小时后,又被抑制43.0%。初步认为,SV_1影响参与降解敌百虫的 GSH—GST 体系的作用,也是对敌百虫产生增效作用的一个机制。     

鼻咽癌患者血清谷胱甘肽S-转移酶-π的表达及意义

研究谷胱甘肽Ｓ－转移酶－π在鼻咽癌患者血清中的表达及意义。方法用酶联免疫吸附法分别测定了３１例鼻咽癌患者疗前后,２５例正常人血常清谷胱甘肽Ｓ－转移酶－π的表达。结论提示血清ＧＳＴ－π可作为鼻咽癌患者的标志酶。     

犬细小病毒VP2基因原核表达条件优化与蛋白纯化

为了提高犬细小病毒VP2基因在大肠杆菌E.coli BL21（DE3）中的表达量,通过改变诱导温度、诱导时间及诱导剂浓度等条件对表达量产生影响,以SDS-PAGE电泳分析证明VP2基因蛋白表达的最佳条件,并通过Glutathione Sepharose 4B亲和层析柱法纯化目的蛋白。结果表明,重组质粒E.coliBL21（DE3）在35℃,1.0 mmol/mL IPTG诱导6 h时条件下蛋白表达量最高。SDS-PAGE电泳检测的纯化目的蛋白约为90 kDa,与预计大小一致。VP2基因融合蛋白的优化表达和纯化为研究犬细小病毒亚单位疫苗奠定了基础。     

GST-Dot4融合蛋白的表达·纯化及鉴定

[目的]为了提高Dotg蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达并获得较高纯度的蛋白。[方法]以pGEX—KG—Dot4重组质粒转化EcoliBL21后,用IPTG诱导重组菌表达GST—Dot4融合蛋白,采用SDS—PAGE及WesternBlot法鉴定表达产物,用GlutathioneSepharose4B亲和层析柱分离纯化。[结果]pGEX—KG—Dot4重组表达载体在大肠杆菌中获得高效表达;经GlutathioneSepharose4B亲和层析柱纯化获得了高纯度的Dot4融合蛋白;WesternBlot表明,该蛋白可与GST标签抗体反应,表明获得了目的蛋白。[结论]在大肠杆菌中表达纯化后得到较高纯度的GST—Dot4融合蛋白,为Dot4蛋白的结构、功能及作用机制研究奠定了基础。     

OsMAPK4基因的原核表达及蛋白纯化

构建OsMAPK4基因的原核表达载体,对表达产物进行鉴定和纯化,为转OsMAPK4基因植株后期的Western Blot检测提供抗原。用PCR方法从本实验室已构建的植物表达载体pUM4上扩增OsMAPK4基因,将其克隆至pET32b原核表达载体,构建重组载体pET32b-MAPK4。转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE分析。用Ni-NTA亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,用Western Blot进行蛋白鉴定。结果表明,原核表达载体构建正确;SDS-PAGE分析及Western Blot鉴定中,均出现了与DNAMAN预测的43.6 ku大小一致的蛋白条带;得到纯化蛋白。成功构建了OsMAPK4基因的原核表达载体,得到纯化蛋白,为转OsMAPK4基因水稻植株体内蛋白表达活性的检测提供了抗原。     

杜仲EuGT4基因原核表达及其编码蛋白纯化

为进一步研究杜仲糖基转移酶结构和功能提供科学依据,利用贵州省农业生物工程重点实验室构建的杜仲(Eucommia ulmoides Oliver)基因组数据库注释信息,从杜仲克隆得到1个全长为1 461bp的糖基转移酶(glycosyltransferase,GT)cDNA序列,将该基因命名为EuGT4;利用基因重组技术构建原核表达载体pET30a-EuGT4,遗传转化大肠杆菌BL21(DE3);在37℃条件下,以终浓度为0.2mM的异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导16h,并采用镍-亚氨基二乙酸(Ni-IDA)亲和层析柱纯化蛋白,以15%SDSPAGE凝胶电泳定性分析。结果表明:EuGT4重组蛋白以包涵体形式在BL21(DE3)中表达,经SDS-PAGE凝胶电泳检测和Western Blot鉴定,在相对分子质量约50kD处有1条特异性蛋白条带,确定为杜仲EuGT4蛋白。     

烟夜蛾谷胱甘肽S-转移酶基因的克隆与时空表达分析

用RT-PCR方法,从烟夜蛾(Helicoverpa assulta (Guenée))成虫腹部克隆获得了1个谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferases,GSTs)基因的完整开放阅读框cDNA序列.该基因的开放阅读框全长636 bp,编码211个氨基酸残基,推测编码蛋白的分子量为24.2 kD,等电点为6.66.将该基因推导的氨基酸序列与其他物种的GSTs进行同源性和系统发育分析,发现该基因编码的蛋白属于昆虫特异性Epsilon家族成员,将该基因命名为HaGSTe2(GenBank登录号:GQ856239).HaGSTe2在雌、雄虫触角、喙、去除触角和喙的头、胸、腹、足和翅中均有表达,而且在卵、幼虫和蛹中也有表达.