内生解淀粉芽孢杆菌TB2液体发酵条件的研究

采用单因素试验和正交试验对具有广谱拮抗作用的内生解淀粉芽孢杆菌TB2菌株的摇瓶发酵培养基和发酵条件进行优化。结果表明,最佳培养基组份为:玉米淀粉1.0%、豆粉1.0%、(NH4)2SO40.5%、MgSO4·7H2O0.1%、FeSO4·7H2O0.03%、K2HPO4·3H2O0.02%、KH2PO40.01%;培养条件为:初始pH值为7.5,温度35℃,接种量3%,装液量50mL/250mL三角瓶,摇床转速200r/min,发酵周期22～26h。优化条件下发酵水平活菌数达到8.52×1010cfu/mL。     

内生枯草芽孢杆菌BS-2防治荔枝霜疫病及其生化机理

研究内生枯草芽孢杆菌BS-2(Bacillus subtilis)菌株对荔枝采后果实霜疫病的防治效果,及其对体内活性氧代谢(SOD、POD、CAT、MDA、超氧阴离子自由基的产生速率)和病程相关蛋白(β-1,3葡聚糖酶活性、几丁质酶活性)等的影响。结果表明,BS-2菌株对荔枝霜疫病具有较好的防治效果,接种处理后6d,其防治效果为37.83%;经内生细菌处理的荔枝果皮的β-1,3葡聚糖酶活性、几丁质酶活性、CAT和SOD酶活性均比病菌处理的高,而POD、PPO酶活性以及膜透性、MDA含量与超氧阴离子自由基的产生速率却比病菌处理的低。当接种后6d,经内生细菌处理的荔枝果皮的β-1,3葡聚糖酶活性、几丁质酶活性和SOD酶活性分别比病菌处理的高70.73%、30.76%和297.43%;而POD、PPO酶活性和超氧阴离子自由基的产生速率却分别比病菌处理的低15.11%、4.96%和28.95%。     

玉米内生细菌-解淀粉芽孢杆菌Y19-RifM在玉米根部定殖能力的研究

采用逐步提高LB平板中利福平浓度的方法,从具有促生长和防病潜力的玉米内生细菌解淀粉芽孢杆菌Y19中筛选出获得抑菌活性不变的抗利福平(250μg/m L)突变菌株Y19-Rif M,研究Y19-Rif M在玉米根部定殖能力。结果表明,玉米出苗后25、30、35、40、45、50、55 d,从根际、根表、根内均能回收到抗性菌落。根际、根表的回收菌量保持在1×103~1×104CFU/g的水平,根内保持在1×103CFU/g的水平,灭菌土中回收到的菌落数量高于自然土中菌落数量。     

内生解淀粉芽孢杆菌TB2内切β-1，4-葡聚糖酶基因的克隆和原核表达分析

以内生解淀粉芽孢杆菌TB2菌株基因组为模板,克隆了该菌的β-1,4-内切葡聚糖酶基因的ORF.测序结果表明该ORF全长1 500 bp,编码499个氨基酸,分子量为55．07ku,等电点为7．83.Blast同源性分析结果表明,该序列与GenBank登录的1株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis M28332)纤维素酶核苷酸序列的同源性最高(98％),其氨基酸同源性也达98％,已被GenBank收录(Accession number).用BamH I和Xho I双酶切目的片段和表达载体pET-29a( )后相连接,构建重组表达载体pET-glu,并导入BL21细菌中表达.酶学特性表明:SDS-PAGE电泳在59 ku左右有融合蛋白带,该酶的最适反应温度为50℃,最适反应pH为6．4,为中性纤维素酶.实验结果为进一步研究内生解淀粉芽孢杆菌TB2纤维素酶的功能和应用打下了基础.     

解淀粉芽孢杆菌B9601-Y2提高玉米生长和产量的效应

采用促进植物生长的解淀粉芽孢杆菌B9601-Y2拌、浸玉米种子和浇灌土壤后均能显著提高玉米生长速度和生物量。3×101～3×105 cfu/mL浓度菌液浸泡玉米种子1 h,播种后5 d苗高比对照(清水)提高119.88%～168.85%;浸种2 h,3×104 cfu/mL和3×105 cfu/mL处理则有抑制作用。采用1.6×108、6.2×107、3.9×107 cfu/mL菌液浇灌土壤,播种后7 d苗重比对照增加20.75%、27.36%和33.96%。以3.9×107～1.6×108 cfu/mL浓度菌液拌种处理,15 d苗龄的植株重量比对照增加4.03%～29.35%,在收获期株高增加6.00%～16.29%,产量增加5.76%～11.81%。高浓度处理促生长效果不如中浓度处理。     

解淀粉芽孢杆菌B9601-Y2对玉米叶际微生物群落的影响

为明确解淀粉芽孢杆菌B9601-Y2(Y2)对施用环境微生物的影响,采用Biolog-ECO板培养法研究其对玉米叶际微生物群落结构的动态变化。结果表明,喷施Y2菌液1、3和5 d后,玉米叶际微生物对碳源的代谢活性(AWCD值)均显著低于空白对照,9、12 d后代谢活性高于空白对照;药剂对照百菌清处理后的代谢活性均最低(7 d除外)。Y2对Shannon、Simpson和McIntosh指数的影响较小,百菌清处理对其的影响显著(前6次采样)。Y2与空白对照的叶际微生物存在相似的碳源利用种类(前4次采样),百菌清处理的叶际微生物有其独自利用的主要碳源,与其他处理间均存在很大差异。6次采样中,对PC1贡献率大的碳源种类主要为糖类,所占比例为31.25%~50%。玉米叶际微生物对外源物质反应敏感,喷施生防菌Y2和百菌清处理对其群落结构均产生影响;Y2影响远小于百菌清处理。     

解淀粉芽孢杆菌及其在防控花生黄曲霉毒素污染中的应用

本研究自全国不同产区的花生荚果上分离到细菌菌株680株。离体试验表明,66%以上的细菌菌株对黄曲霉具有抑制作用,且抑制作用最高可达90%以上;活体试验发现,拮抗菌对黄曲霉及其毒素污染有较强的抑制效果,对黄曲霉的抑制作用达73.1%～88.5%,对黄曲霉毒素污染的抑毒率达72.6%～80.8%,其中解淀粉芽孢杆菌菌株B53抑毒率和防效最高,分别达到88.5%和80.8%。田间试验结果显示,拮抗菌对花生上黄曲霉及其毒素污染均有显著的抑制作用,且促生作用明显,其中菌株B53效果最高,抑毒率和促生率分别达到80.5%和9.5%,其次为B84和B102,分别达到76.3%、71.3%和4.5%、6.2%,生防潜力巨大。拮抗菌代谢物对黄曲霉具有较强抑制作用,其中菌株B53代谢物抑菌作用最强,培养液、上清液和蛋白粗提物抑菌率分别可达95.8%、95.5%和90.2%。另外,拮抗菌B53在花生根部的定殖能力和存活力较高,且能够显著影响根际微生物的种群区系,提升作物对逆境胁迫的抵抗能力。     

解淀粉芽孢杆菌B235对花生根腐病的防治效果研究

利用功能微生物防治花生根腐病是一种环境友好、绿色高效的防控措施。本研究进行了盆栽及田间小区试验,观察花生根腐病的发病情况及解淀粉芽孢杆菌B235对镰孢菌的防治效果。病原菌接种试验结果表明：接种镰孢菌的花生种子出苗慢、主侧根短小、发病率高,出苗率最差的为混合F1和F2两株菌的处理,出苗率仅为28.2%。盆栽生防试验结果表明：与接种病原菌的处理组相比,接种生防菌B235后能显著提升花生的发芽率和出苗率,发芽率和出苗率均在60%以上,最高可分别达到68.5%和65.3%;根腐病病情指数显著降低,防治效果均达60%以上,最高可分别达69.5%和65.5%。小区试验结果表明：相较于对照处理组,生防菌处理组表现为出苗率高、根系发达;在开花期,发病率为4.5%,显著低于常规处理的6.7%和对照处理的10.5%;在成熟期,各处理组发病率差异明显,对照组花生镰孢菌根腐病发病严重,发生率达19.8%,生防菌B235处理组根腐病发生较轻,为5.0%,显著低于常规处理的7.3%,且增产显著;同时发现接种菌株B235对花生根际微生物群落结构及多样性也产生积极的影响。综上所述,生防菌B235能够显著降低根腐病的发...     

解淀粉芽孢杆菌41B-1对花生白绢病的生防效果

本文旨在研究解淀粉芽孢杆菌41B-1对花生白绢病的生物防治效果。采用对峙培养法,测定41B-1对白绢病菌的抑制效果;在温室盆栽条件下,用41B-1发酵菌液对花生进行灌根,然后挑战接种白绢病菌,检测对白绢病的防效。结果表明,41B-1能抑制白绢病菌的菌丝生长速率,破坏菌丝结构,减少菌核数量;41B-1能在培养基质和植株根系内部长期生存,并诱导植株产生防御反应,灌根处理植株对白绢病表现出明显的抗性,防效高达93.9%。因此,41B-1菌株可以作为防治花生白绢病的生防菌剂。     

拮抗香蕉枯萎病菌的解淀粉芽孢杆菌LX1菌株的鉴定及其抗菌蛋白基因的克隆

收集海南不同盐碱地的土样进行拮抗香蕉枯萎病菌的微生物分离,对具有较强抑菌作用的菌株进行形态特征、生理生化和分子鉴定,并克隆其抗菌蛋白基因.结果分离到1株具有较强抑制香蕉枯萎病菌能力的细菌LXl,经鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens).抑菌实验发现LX1菌株的发酵上清液中粗蛋白有一定的抑菌作用,经过Sephacryl S-200HR柱层析、DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析分离纯化了其中抑菌作用最强的抗菌蛋白.质谱鉴定结果表明,抗菌蛋白与B.amyloliquefaciens FZB42内切葡聚糖酶同源性最高.根据质谱结果克隆了该抗菌蛋白的编码基因,该基因的核苷酸和氨基酸序列与B.amyloliquefaciens FZB42的内切葡聚糖酶的核苷酸和氨基酸序列同源性分别达99％和100％.拮抗香蕉枯萎病菌的芽孢杆菌LX1可作为潜在的防治香蕉枯萎病的的生防制剂,其抗菌蛋白基因也可通过遗传工程应用于香蕉枯萎病的防治.     

荔枝果实对霜疫霉侵染抗性评价体系建立及初步应用

为建立稳定的荔枝果实对霜疫霉侵染抗性评价体系,研究不同浓度孢子囊悬浮液浸染、不同症状调查时间对不同荔枝品种病情指数的影响,并用建立的方法研究部分荔枝品种对霜疫霉侵染抗性的初步评价。结果表明:以4×104个/m L孢子囊浓度悬浮液为接种浓度,‘妃子笑’和‘大丁香’离体果实病征发生速度适中,侵染第72小时的病情指数比较稳定,能够更好地区分品种间的抗病性差异。2012~2016年,用该指标体系先后评价了15个荔枝品种对霜疫霉侵染的抗性,结果发现不同年份这些品种的抗性分级基本相同,‘黑叶’和‘桂味’是表现最为稳定的抗病和感病品种,证实了建立的抗性评价体系的稳定性。     

硝酸镍诱导水稻白叶枯病抗性与防卫反应酶活性的变化

用1．0和2．0mmol／L的硝酸镍处理水稻幼苗2d后，再用稻白叶枯细菌(Xanthomonns oryzae pw.oryzae)挑战接种，14d后调查病情，发现病斑长分别比对照下降了42．1％和48．0％，说明硝酸镍能诱导水稻幼苗对白叶枯病的抗性。生理指标测定及同工酶电泳结果表明，两种浓度的硝酸镍处理均能明显提高叶片中POD、PPO和PAL活性以及木质素含量，大部分POD同工酶带和4条PPO同工酶带增强，提示硝酸镍对水稻抗白叶枯病的诱导效应可能与POD、PPO和PAL活性以及木质素含量升高有关。     

水杨酸诱导的水稻对白叶枯病的系统抗性与未处理叶酶活性的变化

 0.5、2.0 mmol/L 的水杨酸（SA）处理水稻幼苗后第3 天用稻白叶枯菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae）对未处理叶（第3叶，进行SA处理时用塑料袋套住）挑战接种，2周后调查病情，发现病斑长比对照分别下降了10.2%和18.2%，说明SA能诱导水稻幼苗对白叶枯病的系统抗性。酶活性测定表明，两种浓度的SA能明显降低水稻幼苗未处理叶中过氧化氢酶（CAT）和抗坏血酸过氧化物酶（APX）的活性，而对过氧化物酶（POD）活性无明显影响。两种浓度的SA对未处理叶中超氧化物歧化酶（SOD）活性的影响不同，其中0.5 mmol/L 的SA处理下，SOD无明显变化，但20 mmol/L 的SA对SOD活性有较明显的促进作用。SA处理后1～4 d，未处理叶H2O2含量比对照上升了23.6%～72.8％(0.5 mmol/L)和31.2%～122.6％(2.0 mmol/L)。H2O2水平的显著提高可能是H2O2产生加快和降解减慢的共同结果（2.0 mmol/L的SA下），或单纯的降解减慢所致（0.5 mmol/L的SA下）。同时，SA对未处理叶PAL活性有促进作用。提示在水稻中，SA对水稻抗白叶枯病的系统诱导作用可能与H2O2积累和PAL活性的升高有关。     

转几丁质酶基因（RC24）水稻中大2号抗纹枯病特性研究

导入外源几丁质酶基因“RC24”的水稻中大2号接种纹枯病菌的结果表明,接种病菌后病斑扩展速率和田间病情指数小,表现为对水稻纹枯病高抗。组织病理学研究表明纹枯病菌能侵入中大2号,并引发纹枯病,入侵时间和症状出现的时间与非转基因感病对照没有显著差异,但病菌菌丝体消解现象出现早于对照,其抗病性主要表现为限制病菌扩展。以中大2号与非转基因水稻材料配制的杂交组合的抗病性表明,杂交组合的抗病性均高于非转基因亲本,但其抗病性也会因母本的不同而有所变化。     

Characteristics of Resistance to Rice Sheath Blight of Zhongda 2, a Transgenic Rice Line as Modified by Gene “RC24”

The transgenic rice, Zhongda 2, which was genetically modified from an indica rice line Zhuxian B by rice chitinase gene (RC24), had high resistance to rice sheath blight (Rhizoctonia solan!) in laboratory and a two-year field experiment. The pathogen could invade sheath of Zhongda 2 and induce symptoms of the disease. No difference was noted in time of penetration or incubation period between Zhongda 2 and non-transgenic rice control, Zhuxian B, but the hyphae lysate could be observed earlier than control. Its resistance expressed as to inhibit the growth of mycelium in host tissue. Fis from Zhongda 2(4) crossed with other five non-transgenic rice lines showed higher resistance than donor non-transgenic parents, but the resistance was different along with the different maternal parents.     

分子标记辅助选择与花药培养相结合快速聚合水稻白叶枯病抗性基因

以受微效多基因控制白叶枯病抗性的五丰占2号和主基因[i]xa5[/i]控制的IRBB5为材料,应用分子标记辅助选择、花药培养和回交技术研究了主基因与微效多基因聚合的途径。经查阅GeneBank中RG556的序列,利用在线引物设计软件Primer 3设计了一条新的R引物：5′CCAGACACCACTGCACATTC3′,克服了原引物Tm值相差太大,扩增效率低的缺点,使PCR扩增效率提高了近10倍。采用病斑长度与五丰占2号相近且携有xa5基因的五丰占2号[sup]2[/sup]/IRBB5 B[sub]1[/sub]F[sub]1[/sub]植株进行花药培养,获得30株二倍体植株,其中16株携有[i]xa5[/i]基因。携有[i]xa5[/i]基因的植株的平均病斑长度仅0.1 cm,对白叶枯病的抗性明显强于双亲。成功地聚合了白叶枯病抗性主基因和微效多基因。从配组到获得主基因和微效多基因聚合材料仅用两年时间,比常规育种方法缩短1~2年。     

利用Fhb1基因分子标记辅助回交育种法改良黄淮冬小麦赤霉病抗性

黄淮冬麦区小麦赤霉病的发生流行程度年际间变化较大,给赤霉病抗性品种的田间选择造成很大困难,因此分子标记辅助选择育种技术的应用显得尤为重要。为明确 Fhb1基因在轮选136背景下对赤霉病抗性的影响,本研究以6个长江中下游麦区抗赤霉病品种(系)为供体,与黄淮冬麦区骨干亲本周麦16的矮败小麦近等基因系进行杂交,并分别与周麦16及其衍生品系轮选136进行2次回交,创建6个BC_2回交育种群体。利用功能标记跟踪后代 Fhb1基因,结合单花滴注接种和自然发病鉴定,检测分子标记选择的效果。根据三个环境表型鉴定结果,发现161个携带 Fhb1抗性等位基因( Fhb1-R)的BC_2F_3株系平均病小穗数和严重度均低于中感赤霉病对照淮麦20和轮回亲本轮选136。其中,60个BC_2F_3株系(37.3%)的病小穗数和严重度在三个环境下表现一致,显著低于淮麦20。在入选的122个BC_2F_4品系中,93个品系(76.2%)的赤霉病抗性优于淮麦20,36个品系(29.5%)优于或相当于中抗对照扬麦158。基因型分析结果表明,赤霉病抗性优于淮麦20的93个BC_2F_4品系除了携带 Fhb1-R外,还携带轮选136的抗性位点 Qfhb.7D。本研究为黄淮冬麦区小麦抗赤霉病分子标记辅助选择育种提供了重要信息和育种材料。