菊属ISSR反应体系的建立及优化

以菊属野生种和不同类型菊花品种为试验材料,通过正交试验对菊属ISSR-PCR反应体系进行初选,在此基础上对体系中的dNTP、引物、Mg2 、TaqDNA聚合酶、模板DNA等最佳浓度进行了筛选,通过稳定性检测,优化了菊花ISSR-PCR反应体系:总体积20μl,DNA模板量60 ng;引物浓度0.5μmol/L;dNTP浓度100μmol/L;Mg2 浓度1.875 mmol/L;Taq聚合酶1 U。     

贯叶连翘ISSR-PCR反应体系的建立与条件优化

[目的]建立贯叶连翘的ISSR-PCR反应体系,并对其条件进行优化.[方法]以贯叶连翘基因组DNA为模板,用L16(45)正交试验设计系统分析引物浓度、Taq DNA聚合酶浓度、Mg2浓度、dNTP浓度和模板DNA浓度5种因素对贯叶连翘ISSR-PCR反应扩增结果的影响.[结果]正交试验设计的方法可以用于贯叶连翘1SSR-PCR反应体系的建立,经过优化得到贯叶连翘ISSR-PCR反应体系的最佳条件为:20μISSR-PCR反应体系中含10×PCR buffer,Mg2+浓度1.2 mmol/L,Taq DNA聚合酶浓度50 U/ml,DNA浓度20 ng/μl,dNTP浓度250 μmol/L,引物浓度0.75 μmol/L.[结论]试验建立的贯叶连翘的ISSR-PCR反应体系重复性好、分辨率高,结果稳定可靠.     

老芒麦ISSR-PCR反应体系的建立与优化

[目的]建立并优化老芒麦ISSR-PCR反应体系和扩增程序,以期为探讨老芒麦种质资源的遗传多样性提供科学依据。[方法]采用正交设计试验和单因素试验相结合的方法对老芒麦的ISSR-PCR的反应体系进行构建和优化,对影响ISSR-PCR扩增效果的Taq酶、模板DNA的浓度、Mg2+、dNTP和引物浓度等因素进行优化,同时对退火温度、循环次数和延伸时间进行筛选。[结果]在25μl体系中各反应物的最适含量为:0.2 mmol/L dNTP,0.2μmol/L ISSR引物,1.50 U Taq DNA聚合酶,2.5μl 10×PCR Buffer,1.5 mmol/L MgCl2和40 ng模板DNA;循环次数和延伸时间分别是35次和90 s。[结论]该研究建立并优化了老芒麦ISSR-PCR反应体系,通过2份老芒麦种质对所优化体系得验证,结果显示体系稳定,可用于老芒麦种质资源遗传分析。     

适于长竹蛏的ISSR反应体系的优化

[目的]以长竹蛏基因组DNA为模板,探讨利用简单重复序列区间分子标记技术进行PCR扩增的最优条件。[方法]采用单因素比较试验,分析了Mg2+、dNTP、TaqDNA聚合酶、引物以及模板DNA浓度对ISSR-PCR扩增效果的影响。[结果]长竹蛏的ISSR反应体系包括10×Buffer,2.5 mmol/LMg2+,0.25 mmol/L dNTP,0.5μmol/L ISSR引物,0.040 U/μlTaqDNA聚合酶,1.6 ng/μl模板DNA。[结论]优化后的反应体系适于长竹蛏的ISSR-PCR扩增。     

濒危植物珙桐ISSR-PCR反应体系的建立

以珙桐叶片为材料,通过单因子试验分别研究了退火温度、TaqDNA聚合酶用量、dNTP浓度、Mg2 浓度、引物浓度和模板DNA浓度对ISSR-PCR反应的影响,建立了适宜于珙桐ISSR分析的扩增体系,即25μl的反应体系中:模板DNA20 ng,Mg2 1.5 mmol/L,引物0.6μmol/L,dNTP 0.20 mmol/L,TaqDNA聚合酶1.5 U。     

适用于川芎的ISSR-PCR反应体系的建立及优化

[目的]建立和优化适合川芎的ISSR-PCR反应体系。[方法]以川芎叶片为材料,利用改良CTAB法提取了叶片基因组DNA,利用单因素试验分析了DNA模板、Mg2＋、dNTP、引物和TaqDNA聚合酶的浓度对ISSR-PCR反应的影响,对适合川芎的ISSR-PCR反应条件进行了优化。[结果]适合川芎的ISSR-PCR反应体系为25.0μl,其中含2.5μl 10×TaqDNA聚合酶缓冲液、2.1 mmol/LMgC l2、300μmol/L dNTP、0.4μmol/L引物、1.0 UTaqDNA聚合酶和20～40 ng模板DNA。[结论]为进一步对全国17个不同分布区的川芎资源进行遗传多样性研究奠定了基础。     

茶树ISSR-PCR反应体系的正交优化

对茶树ISSR-PCR反应体系中的5因素(Taq酶浓度(U/(20μL))、Mg2+浓度(mmol/L)、模板DNA质量浓度(ng/(20μL))、dNTP浓度(mmol/L)、引物浓度(μmol/L))在4水平上进行正交优化试验,筛选出各因素的最佳水平,建立茶树最佳ISSR-PCR反应体系,即20μL反应体系中,TaqDNA聚合酶为1.0U/(20μL),Mg2+为2.0mmol/L,模板为40ng/(20μL),dNTP为0.20mmol/L,引物为0.25μmol/L.对茶树ISSR-PCR最佳反应体系进行梯度退火试验,确定引物ISSR1、UBC881的最适退火温度分别为52.4、59.0℃.     

麻栗坡兜兰ISSR引物筛选及反应体系的优化

[目的]对麻栗坡兜兰ISSR引物进行筛选,并建立一个稳定性高、重现性好、适合麻栗坡兜兰ISSR反应体系。[方法]以麻栗坡兜兰DNA为模板,分别对Mg2+、dNTP、引物、Taq DNA聚合酶、DNA等PCR反应成分进行优化,并用优化的体系对25条兰科中报道的ISSR引物进行筛选。[结果]确立了麻栗坡兜兰最适ISSR-PCR反应体系:在25μl反应体系中,Mg2+2 mmol/L、引物0.4 mmol/L、dNTP 0.20 mmol/L、DNA 1.5μl、Taq酶1.4 U。利用该体系,共筛选得到10条ISSR引物用于麻栗坡兜兰分析,并对21份麻栗坡兜兰材料进行扩增,获得了较好的扩增效果。[结论]该体系稳定可靠,为今后ISSR标记在兜兰属植物的种质鉴定、遗传多样性等方面的广泛应用奠定了重要基础。     

铜鱼ISSR-PCR反应体系的正交设计优化

采用正交设计方法,对影响铜鱼(Coreius heterodon(Bleeker))ISSR-PCR扩增结果的5个因素,如Mg2+、dNTP、引物、TaqDNA聚合酶和模板DNA的浓度,在4个水平上进行了比较优化,建立了适合铜鱼的最佳ISSR-PCR反应体系:在25μL反应体系中含有1.5 mmol/L Mg2+,0.16 mmol/L dNTP,0.2μmol/L引物,1UTaqDNA聚合酶和140 ng模板DNA.检验结果表明,采用该反应体系对铜鱼进行ISSR-PCR扩增可获得多态性高,稳定性和重复性好的电泳条带.     

桑叶ISSR-PCR反应体系的建立与优化

[目的]建立和优化桑叶稳定的ISSR-PCR反应体系和扩增程序。[方法]采用5因素4水平的正交试验和单因子梯度优化相结合的方法对最适因素水平进行筛选。[结果]适用于桑叶的25μl ISSR-PCR反应体系中各因素的最佳浓度分别为:dNTPs 0.35 mmol/L、Mg2+2.5 mmol/L、Taq酶1.25 U、引物0.4μmol/L、DNA 100 ng。[结论]对于桑叶ISSR-PCR试验,一次正交试验基本可以建立满足要求的ISSR-PCR体系。     

药用长春花生长动态研究

[目的]为长春花的规范化生产提供理论依据。[方法]采用随机区组设计,测定长春花的农艺性状和总生物碱含量的动态变化。[结果]长春花农艺性状的动态变化呈现类抛物线型增长。其中株高和一级侧枝数目在4月中下旬就进入快速增长期,株高增速可达11.9cm/10 d,一级侧枝数目增速可达6.4条/10 d;而地径、叶片数目和干、鲜重则于5月下旬或6月上旬进入快速增长期,地径、叶片数目和干、鲜重最快增速分别为1.17cm/10 d、24片/10 d和2.27、15.30 g/10 d。总生物碱含量于6月中旬进入快速增长期,增速可达1.70mg/10 d。[结论]长春花农艺性状都呈现类抛物线型变化,表现为"前期增加缓慢-中期迅速增加-后期缓慢增加"的趋势,总生物碱含量则呈现前期缓慢增长,到6月中下旬进入快速增长期的趋势。     

五节芒ISSR-PCR反应体系的优化

［目的］保护五节芒的种质资源并为其开发利用奠定基础。[方法]以五节芒DNA为材料,分析DNA浓度、Mg^2＋浓度、dNTP浓度、Taq DNA聚合酶的含量以及退火温度对ISSR-PCR扩增结果的影响。并通过单因子试验对ISSR-PCR反应体系进行优化。［结果］建立了五节芒ISSR-PCR的最佳体系：25 μl反应体系中10×PCR Buffer 2.5 μl、0.2 mmol/L 4×dNTP、1.5 mmol/L Mg^2＋、0.75 U Taq DNA聚合酶。PCR反应程序为94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30s;51-53 ℃退火30 s,72 ℃延伸50 s,40个循环;72 ℃再延伸7 min。利用优化反应体系从100个ISSR通用引物中筛选出了11个稳定性高、重复性好的引物。［结论］这一优化体系的建立为今后利用ISSR标记技术研究五节芒遗传多样性奠定了基础。     

藤三七ISSR-PCR反应体系的建立与优化

[目的]建立和优化藤三七稳定ISSR-PCR反应体系和扩增程序。[方法]采用5因素4水平的正交试验和单因子梯度优化相结合的方法。[结果]适用于藤三七的25μl ISSR-PCR反应体系中各因素的最佳浓度分别为:10×buffer 2.5μl,dNTPs 0.15 mmol/L,Mg2+2.0mmol/L,Taq酶1.0 U,引物0.5μmol/L,DNA 100 ng。[结论]对于藤三七ISSR-PCR试验,一次正交试验完全可以建立满足要求的ISSR-PCR体系。     

雷公藤ISSR反应体系的建立与优化

[目的]建立适合雷公藤的ISSR-PCR反应体系,为雷公藤种质资源的亲缘关系鉴定和遗传多样性分析提供技术支持.[方法]采用单因素试验设计优化影响雷公藤ISSR-PCR扩增效果的Taq DNA聚合酶、dNTPs、Mg2+、引物浓度和DNA模板含量及退火温度,并以32份雷公藤样品对优化的ISSR-PCR反应体系进行验证.[结果]优化的雷公藤种质资源ISSR-PCR反应体系为:20.00μL反应液中含1.50 U Taq DNA聚合酶、0.30 mmol/L dNTPs、2.00 mmol/L Mg2+、0.40μmol/L引物、20 ng DNA模板和2.00μL 10×Buffer.ISSR-PCR扩增程序中最佳退火温度为54.7℃.[结论]建立优化的雷公藤ISSR-PCR反应体系具有较高的稳定性、重现性和适用性,可应用于雷公藤不同地理种源间的遗传多样性鉴定.     

吴茱萸ISSR-PCR反应体系优化

[目的]建立吴茱萸ISSR-PCR最佳反应体系。[方法]采用改良的CTAB法提取吴茱萸基因组DNA,研究模板DNA、dNTPs、Mg^2＋、引物（U834）、Taq DNA聚合酶的浓度对ISSR-PCR扩增结果的影响。[结果]20μl反应体系中含2μl 10×PCR buffer,0.15 mmol/LdNTPs,1.6 mmol/L Mg^2＋,0.4 mmol/L引物,20 ng模板DNA,1.2 U Taq DNA聚合酶。[结论]为研究吴茱萸种质资源遗传多样性和分子鉴定奠定了技术基础。     

油橄榄ISSR-PCR反应体系优化与引物筛选

[目的]对油橄榄ISSR-PCR反应体系进行优化,并筛选出多态性ISSR引物。[方法]以油橄榄嫩叶片提取的基因组DNA为模板,通过单因子试验针对反应体系主要因子Mg2+、dNTPs、引物浓度及模板用量进行油橄榄ISSR-PCR反应体系优化。[结果]优化的油橄榄ISSR-PCR反应体系为:总体系20μl中含1×Taq Buffer,3.5 mmol/L Mg2+,0.4 mmol/L dNTPs,1.0μmol/L引物,1.0 U Taq DNA聚合酶,20 ng DNA模板。反应程序为:94℃预变性5 min;94℃变性30 s,52～55℃退火30 s,72℃延伸2 min,40个循环;72℃延伸10 min,4℃保存。同时利用上述反应体系和反应程序筛选出了扩增稳定、多态性高、扩增条带清晰的ISSR引物11条。[结论]为进一步油橄榄种质资源的多样性研究和品种鉴定奠定了基础。