血管内皮生长因子（VEGF）实时荧光定量PCR质粒标准品的构建

 应用SYBR Green荧光染料检测方法构建VEGF基因质粒标准品,能快速、灵敏、可靠的检测与临床多种疾病密切相关的重要候选基因血管内皮生长因子（VEGF）的表达情况。本研究利用版纳微型猪近交系4~6月龄猪,提取皮肤创面总RNA,设计特异引物,进行RT PCR扩增。纯化目的片段并与pMD18 T载体连接,转化宿主菌DH5α,提取重组质粒DNA,并经酶切、PCR和测序鉴定,计算重组质粒原液拷贝数浓度并制备梯度浓度标准品,进行实时荧光定量PCR。建立的VEGF基因mRNA表达实时荧光定量PCR检测方法特异性较好,检测灵敏度可达1.0×103拷贝,线性范围达1.0×103~1.0×108拷贝,阈值循环数(Ct)与PCR体系中起始模板量的对数值之间存在良好的线性关系(r2=0.982),扩增效率高(E=96.92％)。通过构建版纳微型猪近交系VEGF基因质粒标准品,为探讨VEGF基因在临床多种疾病中所发挥的分子机理奠定基础。     

阪崎克罗诺杆菌中转座子拷贝数实时定量PCR检测方法的建立

[目的]建立检测阪崎克罗诺杆菌中转座子拷贝数的实时定量PCR方法。[方法]以单拷贝持家基因atpD作为内参基因,建立同时含有单拷贝持家基因atpD和EZ-TN5转座子的重组质粒;建立atpD基因与EZ-TN5转座子实时定量检测的标准曲线,并利用所建立的标准曲线,对3株阪崎肠杆菌突变株中atpD基因和EZ-TN5转座子的拷贝数进行检测,并计算其比值。[结果]atpD基因与EZ-TN5转座子实时定量检测标准曲线的相关系数分别为0.999和0.998;3株突变株中atpD基因和EZ-TN5转座子拷贝数比值分别为0.98、1.17与0.91,证明突变株中转座子为单拷贝。[结论]该研究所建立的实时定量PCR方法实用性强,可替代Southern杂交用于不同细菌中EZ-TN5转座子拷贝数的检测。     

Establishment of Real-Time Ouantitative PCR Method for Determination of Transposon Copy Number in Cronobacter sakazakii

[目的]建立检测阪崎克罗诺杆菌中转座子拷贝数的实时定量PCR方法.[方法]以单拷贝持家基因atpD作为内参基因,建立同时含有单拷贝持家基因atpD和EZ-TN5转座子的重组质粒;建立atpD基因与EZ-TN5转座子实时定量检测的标准曲线,并利用所建立的标准曲线,对3株阪崎肠杆菌突变株中atpD基因和EZ-TN5转座子的拷贝数进行检测,并计算其比值.[结果]atpD基因与EZ-TN5转座子实时定量检测标准曲线的相关系数分别为0.999和0.998;3株突变株中atpD基因和EZ-TN5转座子拷贝数比值分别为0.98、1.17与0.91,证明突变株中转座子为单拷贝.[结论]该研究所建立的实时定量PCR方法实用性强,可替代Southern杂交用于不同细菌中EZ-TN5转座子拷贝数的检测.     

水稻OsCKX2基因表达实时荧光定量PCR检测技术的建立

从水稻花序分生组织总RNA中逆转录扩增总cDNA,PCR扩增OsCKX2基因中设计的目的片段,将纯化的目的片段克隆到pMD19-TSimple载体中,PCR鉴定并测序分析,制备成荧光定量PCR梯度浓度质粒标准品。对重组质粒进行实时荧光定量PCR实验。标准曲线结果表明,建立的OsCKX2基因mRNA表达实时荧光定量PCR检测方法,特异性好,灵敏度高,可达102拷贝;线性范围广,可达1.0×102~1.0×107拷贝;扩增效率高(E=95.9%);稳定性、重复性好,可靠性高,批内和批间变异系数(CV)仅为:0.14%~0.29%和0.16%~0.35%;循环阈值与PCR体系中起始模板量的对数值之间有着良好的线性关系(r=1.000),可对OsCKX2基因表达进行准确实时定量。一个基于TaqMan实时荧光定量RT-PCR技术,定量分析控制水稻谷粒数关键基因之一OsCKX2转录水平的技术体系被成功建立。该技术体系重组质粒标准品的制备方法具有很强的实用性;对基因OsCKX2的表达实时定量准确、可靠、便捷。     

猪瘟病毒荧光定量PCR标准阳性模板的构建

设计扩增猪瘟病毒(swine fever virus,SFV)核酸5’端非翻译区的引物,采用RT-PCR方法克隆目的片段并插入PMD一18 simple T质粒,重组质粒转化大肠杆菌DH5a感受态细胞,提取质粒经PCR和序列测定证实为阳性重组质粒,命名为pSF。将构建的pSF作为标准阳性模板进行荧光定量PCR(FQ-PCR)检测表明,此模板在一20℃保存6个月对结果无显著影响;对于1×10 9,1×10 7,1×10 5拷贝／2μL 的pSF用FQ-PCR方法测定的ct值最大变异系数分别为1．55％;使用该模板建立的定量范围为1×10 2—1×10 11拷贝／2 μL ;构建的阳性重组质粒pSF具有良好的稳定性和特异性。该方法可以用于临床诊断。     

转基因烟草中外源基因实时荧光定量PCR检测方法的建立

[目的]建立SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测转基因烟草中外源基因拷贝数的方法,为转基因植物中外源基因拷贝数的检测提供参考.[方法]采用SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法,检测转基因烟草中外源绿色荧光蛋白基因(GFP)的拷贝数,以烟草单拷贝的内源核糖核酸还原酶基因(RNR2)作为内参基因,建立相对定量的双标准曲线法检测转基因烟草中外源基因拷贝数的方法.[结果]构建RNR2基因、GFP基因实时荧光定量PCR的标准曲线,分别为y=-0.2858x+5.6695和y=0.2826x+2.1048,R2分别为0.9994和0.9989,相关性较高.在检测的5株转基因烟草中GFP基因的拷贝数分别为5、8、19、28和45,非转基因烟草植株的GFP基因拷贝数为0.[结论]建立的转基因烟草中外源基因SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法具有简单、快速、准确等优点,可用于基因工程中对优良转化植株的筛选及外源基因表达量的快速检测和定量分析.     

猪圆环病毒2型实时定量PCR检测方法的建立

用PCR技术从一临床病猪组织中扩增出猪圆环病毒2型（PCV2）417 bp片段,并克隆到pGEM-T Easy载体中,构建成含有PCV2基因片段的重组质粒。应用该重组质粒进行实时荧光定量PCR,建立了PCV2 DNA的实时PCR标准曲线及其直线回归方程。结果显示该方法重复性好,其检测灵敏度达到102拷贝/μL,检测样品时特异性强。此研究表明,所建立的PCV2 DNA实时定量PCR方法具有重复性好、敏感性高与特异性强等特点,能够用于PCV2的定量检测。     

一种用高拷贝质粒载体制备BAC载体基本功能基因的新方法

[目的]简便有效地解决BAC载体序列因单一拷贝数带来的制备以及下游亚克隆操作的困难。[方法]选择适当的单一酶切位点,将单拷贝BAC载体质粒序列全部插入高拷贝质粒pUC119载体的适当位点。[结果]BAC载体基本功能基因序列在新质粒pUC119-BAC中失去了单一拷贝数控制功能,以高拷贝形式进行复制,利用单一酶切,可将BAC载体基本功能基因序列完整切下来,自连后重新恢复严格的单拷贝控制功能。[结论]利用高拷贝pUC119-BAC质粒,实现了BAC载体的基本功能基因序列高拷贝的复制和扩增,可以方便地用于分子克隆化重组病毒转移载体的构建或BAC文库的构建。     

TaqMan荧光定量RT-PCR检测猪脂蛋白酯酶mRNA方法的建立

【目的】克隆猪cDNA,作为猪LPL mRNA定量检测的标准品,建立检测方法。【方法】用RT-PCR,从猪背最长肌的总RNA中逆转录扩增LPL的cDNA,将纯化的LPL cDNA与pGM-T载体进行连接,转化宿主菌TOP10,提取重组质粒DNA,PCR鉴定并测序分析,对质粒标准进行实时荧光定量PCR 检测。纯化质粒并检测260 nm吸光度,确定原液的重组质粒拷贝浓度并以此制备荧光定量PCR梯度浓度标准品。【结果】建立了猪LPL mRNA实时定量PCR检测方法,特异性好,检测灵敏度达103拷贝,线性范围为1×103 ～1×1010拷贝,阈值与PCR体系中起始模板量的对数值之间有着良好的线性关系（R2＝0.9871）。【结论】成功克隆了LPL实时荧光PCR定量标准,且TaqMan荧光定量RT-PCR的方法可对猪背最长肌LPL mRNA的表达进行准确定量。     

猪圆环病毒2型SYBR—Green 1实时荧光定量PCR检测方法的建立

【目的】建立一种能够快速、灵敏地检测猪圆环病毒2型(PCV2)的SYBR-Green 1实时荧光定量PCR方法。【方法】根据已报道的PCV2ORF2基因组序列,设计并合成1对引物。通过常规PCR扩增PCV2ORF2基因,将鉴定正确的ORF2基因片段克隆入pTG19-T载体中,转化大肠杆菌JM109,经PCR及测序鉴定后得到阳性重组质粒,作为标准品模板建立SYBR-Green 1荧光定量PCR标准曲线和溶解曲线,并做灵敏性、特异性和重复性试验。【结果】PCV2荧光定量PCR标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,溶解曲线特异,相关系数为0.9988,最低检测的拷贝数为1拷贝/25μL,特异性和重复性较好。【结论】建立了检测PCV2的SYBR-Green 1荧光定量PCR方法,为该病的早期诊断及定量分析PCV2感染程度奠定了基础。     

根瘤菌质粒的研究进展

快生型根瘤菌中普遍存在1到多个数量不等的内源质粒(indigenous plasmid)。其中,含有根瘤菌结瘤和共生固氮所必需的基因的质粒被称之为共生质粒(pSym);其它的质粒被称为非共生质粒(non-pSym)。根瘤菌的内源质粒一般都非常稳定,能够在不同种属的根瘤菌之间和土壤杆菌中进行转移。根瘤菌质粒在转移、复制过程中可能发生重组等现象。本文综述了根瘤菌共生质粒和非共生质粒的功能,以及根瘤菌质粒的转移、复制等特性。     

农杆菌介导的药用植物遗传转化

利用根癌农杆菌、发根农杆菌介导药用植物的遗传转化。对转化过程中转化方法及转化后的鉴定、影响植物遗传转化的因素与次生代谢产物以及转基因药用植物的获得等方面进行综述。     

一种用高拷贝质粒载体制备BAC载体基本功能基因的新方法

介绍一种改进的用普通高拷贝质粒pUC119来制备细菌人工杂色体（BAC）载体基本功能基因序列的新方法及其在构建分子克隆化病毒中的应用,该方法可使BAC载体基本功能基因序列的制备更为简易、高效。     

Research on the Construction of Bacterial Artificial Chromosome Vector DNA and the Potentials in Application

[Objective] The aim of this study was to provide a method for solving the problems in preparing BAC vector with High-copy plasmid pUC119-Bluelox BAC.[Method] With selecting a proper single restriction site,sequences of a single copy BAC vector plasmid were inserted into proper site of High-copy plasmid pUC119 vector.[Result] The gene sequence of BAC vector lost control function of single copy number in new plasmid pUC119-BAC and was copied through High-copy form. The gene sequence of BAC vector basic function was completely cutted off through single enzyme digestion and the control function of single copy could be recovered by auto-connection.[Conclusion] The High-copy pUC119-BAC plasmid was used to copy and amplify high copy of basic function gene sequence in BAC vector,besides that it could be used to construct transfer vector of molecular cloned recombinant virus or BAC library.     

Research on the Construction of Bacterial Artificial Chromosome Vector DNA and the Potentials in Application

[Objective] The aim of this study was to provide a method for solving the problems in preparing BAC vector with High-copy plasmid pUC119-Bluelox BAG. [Method] With 8electing a proper single restriction site, sequences of a single copy BAC vector plasmid were inserted into proper site of High-copy plasmid pUC119 vector. [Result] The gene sequence of BAG vector lost control function of single copy number in new plasmid pUC119-BAC and was copied through High-copy form. The gene sequence of BAC vector basic function was completely cutted off through single enzyme digestion and the control function of single copy could be recovered by auto-connection. [ Conclusion ] The High-copy pUC119-BAC plasmid was used to copy and amplify high copy of basic function gene sequence in BAG vector, besides thai it could be used to construct transfer vector of molecular cloned recombinant virus or BAC library.     

利用质粒指纹图谱法对大肠杆菌耐药质粒遗传特性的研究

为研究鸡源大肠杆菌耐药性及耐药的生物学特性，选用30株来自不同地区的鸡源大肠杆菌，在药敏试验的基础上，对耐药菌质粒进行了指纹图谱分析。结果表明：30株鸡源大肠杆菌对氨苄青霉素、青霉素、四环素的耐药率为100.00%，对氯霉素、庆大霉素、利福平、红霉素的耐药率为60.00%-93.33%，多重耐药率为26.67%-80.00%，质粒图谱比较发现：来源相同的菌株质粒图谱相同或相似；来源不同的菌株质粒图谱一般不同。聚类分析表明：30株大肠杆菌遗传距离在0.224-0.416处聚成五类，其中同一地区聚为一类。这表明同一地区的大肠杆菌病的病原之间有一定的同源性。其次，这30株大肠杆菌在遗传距离为0.864处聚成一大类，说明它们之间有一定程度的遗传相关性。     

一种用高拷贝质粒载体制备BAC载体基本功能基因的新方法(英文)

[Objective] The aim of this study was to provide a method for solving the problems in preparing BAC vector with High-copy plasmid pUC119-Bluelox BAC.[Method] With selecting a proper single restriction site,sequences of a single copy BAC vector plasmid were inserted into proper site of High-copy plasmid pUC119 vector.[Result] The gene sequence of BAC vector lost control function of single copy number in new plasmid pUC119-BAC and was copied through High-copy form. The gene sequence of BAC vector basic function was completely cutted off through single enzyme digestion and the control function of single copy could be recovered by auto-connection.[Conclusion] The High-copy pUC119-BAC plasmid was used to copy and amplify high copy of basic function gene sequence in BAC vector,besides that it could be used to construct transfer vector of molecular cloned recombinant virus or BAC library.     

一种改良的苏云金芽孢杆菌质粒DNA提取方法

以Sambrook的碱裂解法为基础,通过控制菌体培养时间,适当调整提取过程中3种溶液的比例及作用时间,摸索出一种适合于提取苏云金芽孢杆菌质粒DNA的方法.该法与常规碱裂解法相比具有重复性好、质粒DNA质量高等优点.     

Characterization of a blaCTX-M-3, blaKPC-2 and blaTEM-1B co-producing IncN plasmid in Escherichia coli of chicken origin

An extensively drug-resistant (XDR) Escherichia coli strain 258E was isolated from an anal swab sample of a chicken farm of Anhui Province in China. Genomic analyses indicated that the strain 258E harbors an incompatibility group N (IncN) plasmid pEC258-3, which co-produces bla_CTX-M-3, bla_KPC-2, bla_TEM-1B, qnrS1, aac(6´)-Ib-cr, dfrA14, arr-3, and aac(6´)-Ib3. Multiple genome arrangement analyses indicated that pEC258-3 is highly homologous with pCRKP-1-KPC discovered in Klebsiella pneumoniae from a patient. Furthermore, conjugation experiments proved that plasmid pEC258-3 can be transferred horizontally and may pose a significant potential threat in animals, community and hospital settings.