重组蛋白sHLA-G1的原核表达与纯化

为了进一步在蛋白质水平对人白细胞抗原HLA-G进行分析,利用已经构建好的克隆质粒pGEM-T-HLA-G1,进一步构建了重组原核表达质粒pET28a-sHLA-G1。SDS-PAGE检测表明,重组蛋白sHLA-G1在大肠杆菌(E.coli)中得到稳定表达,原核表达的重组蛋白sHLA-G1主要以包涵体形式存在。包涵体蛋白经充分洗涤、尿素溶解后用钴离子树脂纯化,并用SDS-PAGE和Western印迹进行了分析,鉴定结果表明,该蛋白纯度达到90%以上,并能与HLA-G特异性抗体87G反应。该研究结果为进一步的复性工作奠定了基础。     

Bt菌株中Cry1Ia和Cry2Ab结构域交换突变体的表达形式

前期构建了一系列Cry1Ia和Cry2Ab蛋白的结构域交换突变体,并在Bt菌株中获得了可观的表达。对6种突变体的表达形式及分泌与否进行了分析和检测。结果显示,6种突变体在Bt中以包涵体的形式存在于菌液沉淀中;这些包涵体与正常Cry蛋白形成的晶体不同,不能溶于Na2CO3缓冲液。蛋白印迹法检测结果显示,带有Cry1Ia分泌信号肽的突变体IAA,IIA和IAI蛋白未分泌到胞外,这可能是由于蛋白表达量过快,迅速聚集而形成包涵体,从而无法分泌到胞外。     

猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒非结构蛋白nsp1α的表达及活性检测

为获得具有活性的猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)非结构蛋白1α(nsp1α),以BJ-4PRRSV nsp1α真核表达质粒pc DNA3.1-nsp1α为模板扩增nsp1α,克隆到原核表达载体p ET-28a,1 mmol/L异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导含有重组质粒的大肠杆菌BL21(DE3)。SDS–PAGE结果显示,nsp1α以包涵体形式高效表达,重组蛋白大小约为20 ku;Western blot结果显示,表达的重组蛋白能与小鼠抗His标签单克隆抗体反应;包涵体蛋白复性后,ELISA方法检测结果显示,重组蛋白能与1∶6 400稀释的PRRSV阳性血清反应。表明成功表达了nsp1α蛋白,且表达的重组蛋白具有较好的免疫学活性。     

水稻密码子优化的cry1Ca 基因在大肠杆菌中表达、纯化及抗体制备

将水稻偏好密码子优化并人工合成抗虫基因cry1Ca通过限制性内切酶酶切的方法构建原核表达载体pET-28bca,成功表达了带6个组氨酸标签的His-cry1ca融合蛋白,其表达量约占菌体总蛋白的24%,表达的融合蛋白主要以包涵体的形式存在.对包涵体蛋白进行可溶性处理,亲和纯化出带6个组氨酸标签的融合蛋白,将其作为抗原免...     

基因工程菌表达效率对细菌总蛋白和包涵体中目的蛋白含量的影响

测定了猪生长激素基因工程菌不同表达效率时细菌总蛋白的含量以及包涵体中重组猪生长激素占包涵体总蛋白的比值。结果表明:随着表达效率的提高,细菌总蛋白含量缓慢增加,最后稳定在一定水平上;当表达效率增加,包涵体中重组猪生长激素占包涵体中总蛋白的百分数也增加,两者上升趋势基本一致。     

不同原核表达载体对非洲猪瘟病毒CD2v蛋白可溶性表达及免疫反应性比较

本研究旨在系统性地探究不同原核表达载体对非洲猪瘟病毒CD2v蛋白的可溶性表达差别，并利用临床非洲猪瘟病毒抗体阳性血清比较包涵体和可溶性CD2v蛋白的免疫反应性。利用5种原核表达载体pCold-TF、pET28a、pMAL-C6T、p GEX-4T-1、p ET32a分别表达去除信号肽和跨膜区的非洲猪瘟病毒CD2v蛋白，利用镍-氨三乙酸（nickel-nitrilotriacetic acid, Ni-NTA）亲和层析法分别纯化源自pET28a和pCold-TF表达载体的包涵体和可溶性CD2v蛋白，并用间接酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）方法比较纯化蛋白的免疫反应性。结果显示，p Cold-TF载体以表达可溶性蛋白为主，pMAL-C6T载体同时表达包涵体和可溶性蛋白，而其他载体主要表达包涵体蛋白。临床非洲猪瘟病毒抗体阳性血清检测数据显示，可溶性蛋白的免疫反应性显著优于包涵体蛋白（P<0.05）。p Cold-TF载体的触发因子（trigger factor, TF）标签可促进CD2v蛋白的可溶性表达，其表达蛋白的免...     

苦荞过敏原TBa和TBb基因的共表达及其包涵体复性的研究

[研究目的]利用大肠杆菌共表达苦荞过敏蛋白的两个亚基,并对表达产物进行包涵体复性研究和免疫学活性分析;[方法]用已构建的表达质pET-28a-TBa和pET-32m-TBb,共转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态,利用双抗生素筛选法,获得稳定遗传的双质粒转化子,经IPTG诱导,两个基因在同一宿主菌中共表达,在共表达产物复性过程中,两个亚基互为分子伴侣,相互促进了蛋白质的重新正确折叠;[结果]表迭蛋白以包涵体的形式存在,ELISA检测表明:复性后的蛋白免疫学活性得到了提高;[结论]由此获得了有活性的蛋白质,并且建立了不相容双质粒共表达外源基因和包涵体复性的方法.     

A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1的表达纯化及活性检测

为获得具有活性的A型FMDV VP1蛋白,以A型vp1重组质粒pMD19T A vp1为模板,利用PCR扩增得到A型FMDV vp1基因片段,将此基因片段与原核表达载体pET28a连接,构建重组质粒pET A vp1。经IPTG诱导表达含重组质粒pET A vp1的E. coli BL21 (DE3) 菌后,SDS PAGE显示VP1蛋白以包涵体形式获得高效表达,蛋白分子质量约为29 ku。通过对IPTG浓度及诱导时间进行优化,结果表明,在37 ℃条件下,IPTG终浓度为0.3 mmol/L,诱导表达6 h后,VP1蛋白的表达量最大。Western Blot分析表明,VP1重组蛋白能够被A型口蹄疫阳性血清特异性识别。ELISA检测结果显示,VP1包涵体蛋白经洗涤纯化,尿素浓度梯度透析复性后具有较高的活性。     

耐热木聚糖酶xynB_(64)和红色荧光蛋白Dsred2的融合表达及其应用

[目的]耐热木聚糖酶xynB64的表达研究,探讨利用红色荧光蛋白Dsred2标签简便快捷地检测包涵体复性的效率。[方法]构建重组质粒pET42a-xynB64和pET42a-xynB64-Dsred2,利用宿主菌Rosetta(DE3)进行表达,DNS法测定酶活,并检测其荧光强度和尿素复性的包涵体。[结果]红色荧光蛋白Dsred2促进了目的蛋白可溶性表达,重溶包涵体经激发后发射光波长在583 nm,光强度与可溶性大致成正比。[结论]研究表明红色荧光蛋白Dsred2在包涵体复性中可作为报告蛋白,该结果为工业化复性包涵体提供了检测依据。     

内含肽融合标签介导的人乙醛脱氢酶2基因原核表达

为获得高活性重组人乙醛脱氢酶2(ALDH2)重组蛋白,研究通过PCR获得ALDH2基因,先后构建克隆和表达载体p GEM-ALDH2和p TYB11-ALDH2。转化的阳性重组菌经IPTG诱导,SDS-PAGE显示融合蛋白获得大量表达。通过正交试验对表达条件优化设计,结果表明,诱导OD值0.3,30℃,IPTG浓度1.0 mmol·L-1,诱导表达4 h为最优表达条件。由于融合蛋白以包涵体形式存在,经变性、复性,使用IMPACTTM-CN蛋白纯化系统,经内含肽标签蛋白自裂解洗脱、纯化,获得仅含有几个载体氨基酸的ALDH2蛋白,蛋白浓度为0.045 mg·m L-1。纯化的ALDH2蛋白比活力为462 U·mg-1。     

新型抗菌蛋白内溶素在大肠杆菌中的融合表达与纯化

抗菌蛋白E17G是一种通过基因改造获得的高效杀菌蛋白。为高效表达抗菌蛋白E17G并减少E17G的抗菌活性对大肠杆菌宿主菌的致死作用,将E17G基因克隆到原核表达载体pGEX 6P 1中,构建的重组原核表达载体pGEX 6P 1 E17G在低温下经IPTG诱导,E17G蛋白在大肠杆菌BL21中以GST E17G融合蛋白的形式表达,采用GST亲和层析纯化和收集GST E17G融合蛋白。SDS PAGE和Western blotting检测结果显示,GST E17G能在大肠杆菌中正确表达,为进一步研究E17G抗菌蛋白的生物学活性奠定了基础。     

橡胶HbJAZ1基因的原核表达与纯化分析

为了鉴定巴西橡胶树中存在与JAZ蛋白特异性结合的蛋白,利用pGEX-6p-1载体构建橡胶JAZ（HbJAZ1）与GST（Glutathione S-transferase）融合表达载体,并成功转化大肠杆菌进行原核表达,同时利用谷胱甘肽-琼脂糖填料成功纯化gcHbJAZ1-GST融合表达蛋白。在纯化实验中,发现HbJAZ1融合表达蛋白在大肠杆菌原核表达中是难溶蛋白,大多存在于裂解菌液的沉淀物中。     

鹅坦布苏病毒E蛋白结构域Ⅰ的原核表达及免疫原性鉴定

【目的】明确鹅坦布苏病毒（GTUMV）E蛋白结构域I的原核表达及免疫原性,为进一步研究GTMUV E蛋白结构的生物学特性、免疫学功能等奠定基础。【方法】通过人工合成方法获得GTMUV E蛋白结构域I的编码基因（EI基因）,并与携带GST标签的p GEX-4t-1载体连接,转入大肠杆菌后经诱导表达获得融合蛋白,并以Western blotting鉴定融合蛋白是否有免疫原性。【结果】合成获得的E1基因片段为411 bp,将其插入p GEX-4t-1载体可构建重组表达质粒p GEX-4t-1-EI。阳性重组菌经1 mmol/L IPTG诱导5 h后,融合蛋白的表达量达最高峰,且以包涵体形式存在,分子量约41.0 k Da。Western blotting鉴定结果显示,融合蛋白与GST标签抗体和E蛋白阳性血清均可发生特异性反应,检测到预期的目的条带。【结论】GTMUV E蛋白结构域I可在大肠杆菌中成功诱导表达,且获得的融合蛋白具有良好的免疫原性,可用于GTMUV血清学检测试剂盒的研发。     

传染性支气管炎病毒(IBV)小囊膜蛋白基因的原核表达

以传染性支气管炎病毒(IBV)M41毒株为材料,克隆该毒株的小囊膜蛋白(E)基因,并将其连接到表达载体pGEX-6P-1中,转化到大肠杆菌BL21中。经IPTG诱导后,SDS-PAGE分析目的蛋白与谷胱苷肽硫转移酶(GST,大小约为26ku)融合后大小约为38ku,表明目的蛋白相对分子质量约为12.4。这一结论为E蛋白的进一步研究提供了条件。     

牛FcγRⅠ(CD64) GST融合蛋白在大肠杆菌中的表达

采用PCR技术从牛巨噬细胞cDNA文库中扩增了牛的高亲和力IgGFc受体FcγRⅠ,测序结果显示与已报道的牛FcγRⅠ序列一致。在牛FcγRⅠ成熟蛋白胞外环区两端分别合成带有BamHⅠ、XhoⅠ限制酶切位点的引物,用PCR扩增后亚克隆到GST融合蛋白表达载体pGEX - 6P- 1,转化宿主菌BL2 1(DE3) ,经IPTG诱导,SDS -PAGE分析表达了N端带有GST的融合蛋白,Western -blotting试验表明融合蛋白在变性条件下能和牛IgG结合。GST -FcγRⅠ融合蛋白的成功表达为研究牛IgG和受体的相互作用机制及其介导的免疫反应打下了基础。     

设计表达兔防御素基因NP1

利用计算机软件对在将大肠杆菌中表达的兔防御素NP-1基因进行分析。消除宿主菌不表达或低效表达的密码子。同时对NP-1基因与质粒pGEX-4T-1中融合基因GST。进行RNA二级结构预测，通过对RNA二级结构进行分析，消除可能影响基因表达的二级结构，设计了有利于今后对目的基因的表达的兔防御素基因，并在大肠杆菌高效表达。结果表明：合成基因可以在大肠杆菌中高效表达。     

E Protein Prokaryotic Expression of Avian Infectious Bronchitis Virus

The small envelope protein （E） gene of avian infectious bronchitis virus （IBV） M41 strain was cloned, and then it was subcloned into prokaryotic expressing vector pGEX-6P-1. The recombinant plasmid was transformed into E.coli. BL21 and induced by IPTG. SDS-PAGE result showed that when objective protein fused with GST （about 20 ku）, the relative molecular mass of fusion protein was 38 ku. It indicated that objective protein was about 12.4 ku. The result showed that E protein was expressed successfully, it was useful to the subsequent E protein research.     

非洲猪瘟病毒(Malawi LIL 20/1株)k8R基因的表达与鉴定

蛋白多肽二级结构的电脑预测表明,非洲猪瘟病毒（ＭａｌａｗｉＬＩＬ２０／１株）ｋ８Ｒ基因编码带有多个疏水氨基酸小区的２７ｋＤａ蛋白质。该基因的ＰＣＲ产物克隆入质粒ｐＧＥＸ－２Ｔ后,在大肠杆菌中表达４２～５４ｋＤａ不溶性ＧＳＴ－ｋ８Ｒ融合蛋白。此表达蛋白能被针对不同非洲猪瘟病毒株的猪免疫血清识别。在非洲猪瘟病毒细胞适应株感染的细胞中,针对ｋ８Ｒ大肠杆菌表达产物的单抗能检测出２７ｋＤａ特异病毒蛋白。进一步鉴定表明,ｋ８Ｒ基因编码的蛋白质为病毒非结构蛋白,不发生糖基化,出现于病毒感染周期的晚期,主要集中于靠近细胞核的病毒复制部位。用大肠杆菌表达的ＧＳＴ－ｋ８Ｒ融合蛋白免疫猪未能抵抗ＭａｌａｗｉＬＩＬ２０／１强毒株攻击。     

谷胱甘肽-S-转移酶-ASPP2融合蛋白的原核表达及纯化

为表达并初步纯化包含ASPP2活性区域和不包含其活性区域的谷胱甘肽-S-转移酶(GST)-ASPP2融合蛋白。采用PCR扩增两段ASPP2基因短片段,在引物5'端和3'端分别引入BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点,将其克隆进入原核表达载体pGEX-4T-1;异丙基硫代-半乳糖苷(IPTG)诱导重组质粒pGEX-4T-1-ASPP2在大肠杆菌BL21(DE3)中表达同时带有谷胱甘肽-S-转移酶(GST)标签的融合蛋白;超声法裂解大肠杆菌,应用谷胱苷肽琼脂糖树脂纯化可溶的GST-ASPP2融合蛋白;通过SDS-PAGE和Western blot验证GST-ASPP2融合蛋白的表达。结果表明,已成功的构建了GST-ASPP2小片段融合蛋白表达载体,在Western blot分析中,4个蛋白条带均能被鼠抗GST单克隆抗体特异性识别,条带所在位置和GST-ASPP2的分子质量相符。构建了GST-ASPP2重组质粒,在大肠杆菌BL21中高效表达GST-ASPP2融合蛋白,为进一步研究ASPP2全长,N-末端和C-末端生理意义奠定了基础。