以G418为筛选标记的极细链格孢菌(Alternaria tenuissima)原生质体转化体系的建立

[目的]建立极细链格孢菌(Alternaria tenuissima)的原生质体遗传转化体系。[方法]采用酶解法制备极细链格孢菌的原生质体,并通过PEG/CaCl2介导的化学方法将含有G418抗性标记的DNA转入极细链格孢菌原生质体。[结果]转化子生长表型及其基因组DNA的PCR检测表明抗性基因已成功整合到极细链格孢菌基因组中。该方法的转化率达3~4个转化子/μg转化DNA。所获得的转化子在无选择压力下连续培养3代,G418抗性仍能稳定遗传。[结论]成功建立了极细链格孢菌的遗传转化系统,为极细链格孢菌的基因功能研究奠定了基础。     

以G418抗性为筛选标记的深绿木霉遗传转化研究

【目的】探索建立以G418抗性为筛选标记的农杆菌介导的深绿木霉遗传转化方法,为木霉菌突变菌株的筛选和基因功能研究奠定基础。【方法】测试供试野生型深绿木霉菌菌株T23对G418的敏感性,构建以G418抗性为筛选标记的质粒载体p1300-neo,并将该质粒通过农杆菌导入深绿木霉T23菌株中,利用G418抗性平板筛选获得转化子,通过PCR对稳定转化子进行鉴定。【结果】T23菌株对G418具有高度敏感性,25μg/mL G418可完全抑制T23菌株的生长;构建的p1300-neo载体是可行的G418抗性标记,通过该载体获得了多株具有G418抗性的深绿木霉遗传转化子。【结论】G418抗性可以作为深绿木霉菌有效的遗传筛选标记,其在PDA培养基中的使用量为25μg/mL。     

绿僵菌致病力的制约因素研究

[目的]研究影响绿僵菌生长以及分生孢子萌发的因子,为绿僵菌的制剂化应用过程提供理论依据。[方法]分别对温度、pH值、紫外线以及杀虫剂等对绿僵菌的影响进行试验。[结果]绿僵菌最适生长温度为26～28℃,且在pH值为6.2～6.6的环境中孢子萌发率最高,其在30 W的紫外灯下20 cm处,被照射15 min后失去活力,杀虫剂敌百虫对绿僵菌的生长几乎没有影响,但辛硫磷严重抑制绿僵菌的生长,要避免同时使用。[结论]温度、pH值、紫外线以及常用杀虫剂对绿僵菌生长过程均有影响。     

法夫酵母整合型表达载体的构建

为了建立法夫酵母虾青素代谢途径研究和分子育种的技术体系,构建了法夫酵母的整合型表达载体.通过测定法夫酵母对G418的抗性来确定抗性筛选物的质量浓度,以来源于法夫酵母本身的rRNA基因为基因同源重组片段,利用法夫酵母肌动蛋白启动子和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（gpd）启动子,构建了携带G418抗性基因的整合型载体pMD-18spakta和pMD-18spgktg.结果表明：法夫酵母对20 μg/mL质量浓度的G418敏感,将构建的载体转化法夫酵母菌株后,筛选得到了能够在含有G418的培养基上生长的转化子;利用PCR的方法检测到转化子中存在的抗性基因.将筛选得到的阳性菌株连续传代培养10次后,发现该菌株的G418抗性仍然存在;以总DNA为模板,用PCR的方法仍可检测到G418抗性基因.说明已经构建得到了遗传稳定性良好的法夫酵母整合型表达载体,构建的质粒pMD-18spakta和pMD-18spgktg可作为法夫酵母整合载体应用于法夫酵母的DNA重组实验.     

生防链霉菌gCLA4遗传转化体系的建立与优化

【目的】建立生防菌淡紫灰链霉菌(Streptomyces lavendularectus)gCLA4的遗传转化体系,为定向改造基因、提高基因表达水平及其生防分子机制研究奠定基础。【方法】以具有安普霉素(Apramycin)抗性基因标记的整合型质粒pSET152为出发质粒,Escherichia coli ET12567(pUZ8002,pSET152)为供体,淡紫灰链霉菌gCLA4为受体进行接合转移试验,并对影响接合效率的培养基、热激温度、接合转移时间和筛选转化子培养基等因素进行优化。【结果】成功地将质粒pSET152转入到了生防链霉菌gCLA4中,明确了可用于筛选链霉菌gCLA4转化子的抗生素为安普霉素或四环素;链霉菌gCLA4孢子50℃热激时转化效率较高,接合效率在16,18,20h下没有明显差异,MS培养基作为接合转移培养基时转化效率最高,接合产物涂布到高氏一号抗性培养基上进行阳性转化子筛选的效果最好。【结论】建立了生防链霉菌gCLA4的遗传转化优化体系。     

绿僵菌农药助剂的筛选及混配防治荔枝蝽蟓的研究

[目的]探讨化学杀虫剂与绿僵菌菌株MA4、JF-813的相容性以及菌药混用的增效作用。[方法]以荔枝蝽蟓为供试昆虫,绿僵菌MA4、JF-813为供试菌株,研究5种化学杀虫剂对绿僵菌孢子萌发的影响以及菌药混用防治荔枝蝽蟓的效果。[结果]供试的5种化学药剂对MA4、JF-813菌株孢子萌发均有一定的抑制作用。20％乳油氰戊菊酯与MA4、JF-813菌株的相容性最好,低剂量20％乳油氰戊菊酯对菌落抑制作用明显低于其他4种化学药剂。低剂量的农药与绿僵菌混合使用对绿僵菌的致病力具有协同增效作用。绿僵菌JF-813和次亚致死剂量的2．5％溴氰菊酯混用效果最佳,绿僵菌MA4和4．5％高效氯氰菊酯混用效果最佳。[结论]该研究为绿僵菌混合制剂的生产应用提供了参考依据。     

重组毕赤酵母高产木聚糖酶菌株的筛选及诱导条件优化

[目的]筛选重组毕赤酵母高产木聚糖酶菌株并优化其甲醇诱导条件。[方法]用不同浓度的G418 YPD平板筛选高拷贝转化子,不同时间间隔添加不同浓度的甲醇进行木聚糖酶诱导表达。[结果]在G418浓度为10.0 mg/m l时,筛选得到产酶活力最高的16号菌株,以0.5%甲醇于30℃诱导产酶,第6天时酶活力达到最高,为826.2 IU/m l,木聚糖酶比活力达5 229.1 IU/mg;该菌在诱导时间间隔为12 h、诱导浓度为0.8%时,产酶量高且稳定。[结论]该菌是甲醇依赖型的高拷贝高酶活菌株。     

小檗碱与绿僵菌复配的相容性及对桃褐腐病菌的抑制作用

[目的]探讨小檗碱与绿僵菌复配的可能性。[方法]考察小檗碱对绿僵菌孢子萌发、菌丝生长及产孢的影响,并测定小檗碱与绿僵菌复配对桃褐腐病菌(Monilinia fructicola)的抑制作用。[结果]试验浓度的小檗碱对绿僵菌的孢子萌发、产孢量和菌落形成未产生明显影响;当绿僵菌与褐腐病菌共培养时,绿僵菌处于优势菌群,褐腐病菌未能影响绿僵菌的生长;小檗碱与绿僵菌复配能完全抑制褐腐病菌的生长。[结论]小檗碱和绿僵菌可混合使用,二者相容性好。     

T-DNA插入麝香百合的研究

[目的]获得麝香百合转基因植株。[方法]采用2步外植体法和农杆菌介导的T-DNA插入技术转化麝香百合。[结果]菌液浓度OD600值为0.6~0.8时浸染效果好,同时附加250 mg/L的AS可以提高转化效率,50 mg/L G418为抗性筛选最适浓度。对经过抗性筛选的百合转化植株进行PCR分子检测,部分转基因植株呈阳性,初步证明T-DNA已插入到百合基因组中。[结论]该研究为利用T-DNA插入技术筛选优良的百合新品种奠定了基础。     

以吡啶硫胺素抗性基因为选择标记的红曲菌原生质体转化研究

[目的]以吡啶硫胺素抗性基因(Pyrithiamine Resistance Gene,ptrA)为选择标记基因,对红曲菌原生质体转化体系进行研究,以期为红曲菌基因功能的研究奠定基础。[方法]采用PEG-CaCl2介导的原生质体转化法,将含有吡啶硫胺素抗性基因(ptrA)的pPTRⅡ质粒转入橙红色红曲菌AS3.4384原生质体中,随机挑选5个转化子,通过PCR方法和Southern杂交对转化结果进行检测,验证pPTRII质粒是否整合到转化子染色体DNA中。[结果]pPTRⅡ质粒转入红曲菌AS3.4384原生质体中的转化率为20～24个/μg,PCR检测结果显示,基因组DNA中有吡啶硫胺素抗性基因的存在,Southern杂交分析发现,ptrA基因随机整合到了转化子的染色体上,该结果表明ptrA基因可用作红曲菌转化的选择标记。[结论]该研究是吡啶硫胺素抗性基因在红曲菌中的首次转化研究,试验结果为红曲菌的基因功能研究奠定了基础。     

以G418为筛选标记的极细链格孢菌(Alternaria tenuissima)原生质体转化体系的建立(英文)

[Objective] The study aimed to establish a protoplast transformation system in Alternaria tenuissima. [Method] The protoplast of A.tenuissima was firstly prepared by enzymolysis method; then the yielded protoplast was transformed by G418 resistant DNA plasmid using PEG/CaCl2 method. [Result] The growth phenotype and PCR detection showed that resistance gene had integrated into A.tenuissima genome. The transformation efficiency of this method reached per μg DNA 3-4 transformants. After subculture thrice under nonselective condition, G418 resistance could still inherit stably. [Conclusion] The transformation system of A.tenuissima was successfully established, which laid basis for studying of the gene function of Alternaria tenuissima.     

转叶绿体超氧化物歧化酶基因水稻的获得

[目的]研究转叶绿体超氧化物歧化酶（SOD）基因水稻的获得。[方法]在构建叶绿体超氧化物歧化酶基因转化载体的基础上,采用农杆菌侵染法,使用C418作为筛选剂,经筛选和分化获得转基因植株,并对其进行PCR检测。[结果]确定G418的最佳浓度为200mg／L,采用尽可能短的筛选时间获得了好的转化效果,最终获得237株再生苗;经PCR检测,65株呈阳性,转化率为27％。[结论]确定了G418的筛选效果,为其进一步应用提供科学依据。     

金龟子绿僵菌对小菜蛾的室内毒力测定

[目的]采用浸叶法和浸虫法测定金龟子绿僵菌在不同浓度下对小菜蛾的室内毒力。[方法]以小菜蛾3龄幼虫为供试虫源,用浸叶法和浸虫法研究金龟子绿僵菌在2种侵染途径下对小菜蛾的室内毒力,并对感染反应的时间与剂量效应作综合分析。[结果]在2种方法处理下。10^5～10^9个孢子／ml浓度的金龟子绿僵菌孢悬液对小菜蛾均有杀伤作用,同一浓度下浸虫法优于浸叶法。在浸叶法中,金龟子绿僵菌对小菜蛾第3天的LD。对数剂量为15．48,第8天的加。对数剂量为11．93;在浸虫法中,金龟子绿僵菌对小菜蛾第3天的凹。对数剂量为9．25,第8天的蛾．对数剂量为8．73。10^9个孢子／ml金龟子绿僵菌处理的小菜蛾在第8天校正死亡率达到92．86％,其￡％为1．95d。[结论]该研究为田间应用金龟子绿僵菌防治小菜蛾提供理论依据。     

稳定表达犬信号淋巴细胞激活因子基因细胞株的建立与鉴定

[目的]构建稳定表达犬瘟热病毒细胞受体———犬信号淋巴细胞激活因子(SLAM)的非洲绿猴肾细胞株(Vero)。[方法]采用RT-PCR方法从犬外周血淋巴细胞中扩增出SLAM基因,将其克隆到哺乳动物真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组质粒pcDNA3.1/SLAM。采用脂质体将pcDNA3.1/SLAM转染到Vero细胞中,利用G418加压筛选和纯化培养获得稳定表达SLAM的重组Vero细胞株。应用RT-PCR和间接免疫荧光试验检测SLAM的表达。[结果]重组蛋白SLAM在Vero细胞中获得表达,并且在不同代次的阳性细胞株中均能稳定表达目的蛋白。[结论]该研究建立了稳定表达犬SLAM的细胞株Vero/SLAM,为犬瘟热病毒的分离和生物学特性研究提供了平台。     

转甜味蛋白Brazzein基因乳腺特异表达载体的山羊体细胞株筛选

[目的]建立通过山羊乳汁获取甜味蛋白Brazzein的方法.[方法]将前期工作中构建的Brazzein基因山羊乳腺特异表达载体STP-pBC1进行线性化,采用脂质体法转染山羊成纤维细胞,以期获得转基因阳性细胞.[结果]采用脂质体法转染山羊成纤维细胞后,通过最适G418浓度（400 μg/ml）筛选获得转基因阳性细胞;转基因阳性细胞形态呈现梭形且核仁清晰,其生长曲线呈现正常的“S”;转基因阳性细胞经冷冻复苏后,仍呈现与冷冻前新鲜转基因细胞相似的形态和生长曲线;PCR鉴定结果表明,STP-pBC1已整合入转基因细胞的基因组中.[结论]成功获得乳腺特异的转甜味蛋白基因Brazzein的山羊成纤维细胞株.