柑桔转化酶基因家族新成员的克隆和序列分析

分析植物可溶性转化酶基因的保守区序列，设计一对PCR引物，以甜橙基因组DNA为模板。采用PCR方法扩增出长约1000bp的DNA片段。克隆入pUCm-T载体，测序结果表明获得柑桔酸性转化酶基因家族的一个新的成员。基因片段长1096bp。包括4个外显子和3个内含子，其序列已在GenBank中登记（登记号为AF433643）。在GenBank中进行同源性检索的结果表明，该成员编码的氨基酸与植物可溶性酸性转化酶的氨基酸同源性较高。与宽皮柑桔（GenBank登记号，AF312229）可溶性酸性转化酶基因编码的氨基酸具有77%的同源性，而与定位于细胞壁的（不溶性）酸性转化酶同源性较低。最高权33%（Fragaria ananassa,GenBankAF000521)。聚类分析结果表明该成员与我们已报道的2个柑桔酸性转化酶基因不同，推测我们获得的基因是转化酶基因家族的又一新成员（CS-VI1）。它与CU-AI1和CSCWI-1的核苷酸同源性分别为45.28%和44.85%。氨基酸同源性分别为27.58%和10.35%。3个成员间核苷酸和氨基酸序列较低的同源性，不会在South-ern,Northern和Western杂交中产生交叉干扰反应。     

山核桃APETALA1同源基因的克隆与序列分析

根据植物花分生组织及花器官形成过程中起重要作用的APETALA1（AP1）基因的高度保守区序列,设计合成一对长度为23bp的聚合酶链式反应（PCR）引物,以山核桃Carya cathayensis因组DNA为模板,采用PCR方法扩增出长为486bp的DNA片段,克隆到pMD18-T载体。测序和序列分析结果表明,获得了山核桃AP1同源基因中的1个片段,该片段序列包含2个内含子,长度分别为86bp和291bp,编码区共编码36个氨基酸。其序列已在Gen荷Bank中注册（注册号为EU155118）,在Gen Bank中进行同源性检索结果表明,其氨基酸序列与其他植物AP1同源基因的氨基酸序列同源性高达69％～88％,推测它们在功能上也是相似的。     

毛叶枣APETALA1同源基因的克隆

分析在植物花分子生组织及花器密形成过程中起重要作用的APETALA1（AP1）基因的保守区序列，设计1对长度为23pb的PCR引物，以毛叶枣基因组DNA为模板，采用PCR方法扩增出长为648bp的DNA片段，克隆人pUCm-T载体，测序和序列分析结果 表明获得了毛叶枣AP1同源基因中部的1个片段，该片段有2个内含子，长度分别为152bp和386pb，编码区共编码36个氨基酸，其序列已在GenBank中登记（登记号为AF356541）,在GenBank中进行同源性检索，结果表明其氨基酸序列与其他植物AP1同源基因的氨基酸序列同源性高达66％－88％，推测它们在功能上也是相似的。     

枇杷β-胡萝卜素羟化酶基因片段的克隆和序列分析

根据蔷薇科植物β-胡萝卜素羟化酶基因的保守区序列,设计1对PCR引物,以枇杷基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增出长约450 bp的DNA片段,克隆人pMD-18T载体中,测得该基因片段长为440 bp,编码145个氨基酸,属于开放阅读框的一部分,不含内含子。在GenBank中进行同源性检索,结果该序列与苹果β-胡萝卜素羟化酶基因同源性为95%,证明它属于枇杷的β-胡萝卜素羟化酶基因。     

山核桃FLOWERING LOCUST同源基因的克隆与序列分析

根据不同植物FLOWERING LOCUST（FT）同源基因序列的保守区,设计合成1对长度为18bp的PCR简并引物,以山核桃基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增出长度为152bp的DNA片段,克隆到pMD19-T载体上。测序及序列分析结果表明,扩增所获得的片段序列为FT基因第四外显子部分序列,不含内含子,推测共编码50个氨基酸;其序列在GenBank中注册号为FJ858260．1,同源性比对结果表明,其氨基酸序列与其他植物FT基因的同源性高达88％～96％。     

玉米ZmCIPK6基因的克隆及植物表达载体的构建

根据MaizeDGB数据库中ZmCIPK6基因序列设计引物,采用RT-PCR技术从玉米中克隆了1个ZmCIPK6基因。ZmCIPK6基因c DNA全长1 739 bp,5′-非编码区长281 bp,3′-非编码区长111 bp,编码区长1 347 bp,编码448个氨基酸,预测分子量为48.8 KDa,等电点为9.14。氨基酸同源性分析发现,ZmCIPK6与高粱SbCIPK6同源性较高。根据ZmCIPK6的基因序列和植物表达载体pCAMBIA3301的多克隆位点设计带有限制性内切酶位点的特异性引物,以质粒pMD18-T-ZmCIPK6为模板,PCR扩增ZmCIPK6基因片段,双酶切目的片段及载体,回收后连接,构建成该基因的植物表达载体。经PCR检测及测序鉴定,表明成功构建了ZmCIPK6基因的植物表达载体,为进一步遗传转化研究基因的功能奠定基础。     

枇杷LEAFY同源基因的克隆及序列分析

为从分子水平研究枇杷成花的机理,通过分析植物花分生组织决定基因LEAFY(LFY)同源基因的保守区序列,设计了1对简并引物,用PCR方法从枇杷栽培品种‘早钟6号’基因组DNA中扩增出1个1317bp的片段,把该片段克隆到pUCm-T载体,测序和序列分析结果表明获得了枇杷LFY同源基因(ejLFY)3’端的1个片段,该片段有1个911bp的内含子,编码区共编码130个氨基酸,其序列已经在GenBank中登记(登录号为AY551183)．在GenBank中进行同源性搜索,发现该基因片段与其他作物中已经报道的LFY同源基因的同源性大都在94％以上,特别是与同属于蔷薇科的苹果的同源性最高,达到98％的同源性,推测它们具有相似的功能．     

金柑LEAFY同源基因克隆与全序列分析

通过PCR扩增，从融安金柑基因组DNA中克隆出一条2361bp的DNA片段，该DNA克隆含有1个2081bp的LEAFY同源基因全长序列（FcLFY）。金柑LEAFY同源基因包含2个内含子和3个外显子，编码398个氨基酸。比对结果表明，金柑LEAFY同源基因与甜橙、枳的LEAFY同源基因的核苷酸和氨基酸序列的同源性均为98％。该研究为今后从分子水平上研究金柑开花调控机理打下了坚实的基础。     

桃果实乙烯反应因子PpERF1全长基因的克隆及序列分析

以成熟肥城桃果实的cDNA为模板,根据EST库中的核苷酸序列,设计2条特异引物分别与B26进行PCR扩增,结果得到了该基因下游包括3''端非编码区的765 bp大小的cDNA片段.PpERF1基因全长为1263 bp,包含一个708 bp大小的完整开放阅读框(ORF).序列分析表明,PpERF1与番茄、拟南芥、苹果和葡萄等在DNA结合功能域的约57个氨基酸中,同源性可达68.4%～100%,且在该区域中存在1个α-螺旋和3个反平行链构成的β-折叠结构.经同源性分析,该序列与拟南芥、葡萄、豌豆等植物的氨基酸同源性为58.8%～67.5%,属于同一类ERF家族成员.     

麦洼牦牛H-FABP、HSL基因多态性及与生长性状的相关分析

【目的】探讨心脏脂肪酸结合蛋白（heart fatty acid-binding protein,H-FABP）、激素敏感脂肪酶（hormone-sensitive lipase,HSL）基因在牦牛中的遗传多态性,进一步揭示牦牛各品系间的遗传分化以及候选基因与牦牛生长性状间的关联性,同时为2个候选基因在牦牛中的表达调控等研究提供理论依据,寻找可用于辅助选择的分子标记。【方法】采用PCR-SSCP技术和DNA测序技术对共100头麦洼牦牛个体的H-FABP、HSL基因的外显子部分进行遗传多态性分析,统计基因和基因型频率,进行Hardy-Weinberg平衡性检测,计算纯合度、杂合度、多态信息含量和有效等位基因数等遗传多态指标,分析候选基因不同基因型与体高、体重、体斜长、胸围、管围等生长性状的关联性。【结果】①麦洼牦牛H-FABP、HSL基因外显子部分均存在多态性,多态性检验均存在3种基因型;②适合性检验表明仅HSL基因外显子8上多态位点处于Hardy-Weinberg平衡状态,其余多态位点均偏离;③测序分析表明,H-FABP基因外显子4第7 339位（与原序列相比）发生单碱基突变（T→C）,该突变属同义突变;HSL基因外显子7第6 883位发生G→C转换,以及第6816处发生碱基A→G突变,并导致编码氨基酸由天冬氨酸（D）转变为甘氨酸（G）;外显子8第10 183 bp处发生A→G碱基突变,编码氨基酸由半胱氨酸（C）变为甘氨酸（G）;④对各标记基因型生长发育指标（体高、体斜长、胸围、管围、体重）进行差异显著性检验,仅HSL基因外显子7上A6816G基因座差异极显著（P﹤0.01）。【结论】麦洼牦牛H-FABP、HSL基因存在遗传多态性,且HSL基因外显子7上A6816G基因座表现的多态有可能作为一种遗传标记。     

苹果NADP依赖的苹果酸酶基因克隆、序列和表达分析

【目的】克隆苹果（Malus×domestica B.）中苹果酸代谢的关键酶基因MdNADP-ME,进行序列特征分析,研究MdNADP-ME在苹果中组织表达的情况。【方法】利用RT-PCR技术获得苹果MdNADP-ME1,2,3全长的cDNA序列。对该序列进行生物信息学分析,采用荧光实时定量PCR技术研究MdNADP-ME1,2,3的组织表达。【结果】测序结果显示,获得的3个NADP-苹果酸酶基因（MdNADP-ME1、MdNADP-ME2 和 MdNADP-ME3; GenBank 登录号为JX971883、JX971884和JX971885）,其ORF分别为1 512、1 782和1 926 bp,推测其分别编码503、593和641个氨基酸的多肽。氨基酸序列和结构分析显示,这3个基因均含有5个保守的氨基酸区域（motif I-V）,含有2个功能结构域：malic和NAD_bind_1_malic_enz。进化树分析结果显示,MdNADP-ME1 和MdNADP-ME2属于双子叶植物细胞质NADP-ME型,MdNADP-ME3属于双子叶植物质体NADP-ME型。荧光实时定量PCR结果表明,MdNADP-ME1-3在被检测的组织中均有表达,但表达差异明显。【结论】MdNADP-ME1-3属于植物NADP-ME家族,结构高度保守,并且在苹果的不同组织中有不同表达模式。     

3个品种鸡α干扰素基因的克隆与序列分析*

 根据GenBank中鸡α干扰素（IFN-α）基因序列设计1对引物,应用PCR技术直接从鸡肝组织基因组中扩增罗曼鸡、海兰鸡及固始鸡α干扰素基因,并进行克隆和测序。结果表明,获得了3个品种鸡IFN-α全基因序列,长度均为582bp,编码193个氨基酸残基。3个品种鸡IFN-α基因及推导的氨基酸序列比较结果显示,海兰鸡和罗曼鸡IFN-α基因序列完全一致,而固始鸡与海兰鸡和罗曼鸡IFN-α基因核苷酸同源性99.3%,有4个碱基发生非同义变异,氨基酸同源性为97.9％。克隆的3个品种鸡IFN-α基因序列与GenBank上发表的7条鸡IFN-α基因序列进行比较分析发现,核苷酸同源性在98.1%～100%之间,氨基酸同源性在96.9%～100%之间。     

Cloning and Characterization of Full Length cDNA of a CC-NBS-LRR Resistance Gene in Sweetpotato

Conserved domain such as nucleotide binding site （NBS） was found in several cloned plant disease resistance genes. Based on the NBS domain, resistance gene analogues （RGAs） have been isolated. A full-length cDNA, SPR1 was obtained by rapid amplification of cDNA ends （RACE） method. Sequence analysis indicated that the length of SPR1 was 3 066 bp, including a complete open reading frame of 2 667 bp encoding SPR1 protein of 888 amino acids. Compared with known NBS-LRR genes, it presented relatively high amino acid sequence identity. The polypeptide has a typical structure of nonT1R-NBS-LRR genes, with NB-ARC, CC, and LRR domains. The SPR1-related sequences belonged to multicopy gene family in sweetpotato genome according to the result of Southern blotting. Semi-quantitative RT-PCR analysis showed SPR1 expressed in all tested tissues. The cloning of putative resistance gene from sweetpotato provides a basis for studying the structure and function of sweetpotato disease-resistance relating genes and disease resistant genetic breeding in sweetpotato. The gene has been submitted to the GenBank database, and the accession number is EF428453.     

酸柚根系CS和PEPC基因的克隆及序列分析

以酸柚(Citrus grandis)根系为材料,利用热硼酸法提取了根系总RNA,并逆转录成cDNA,利用PCR和RACE技术相继得到柠檬酸合酶基因(CS)和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(PEPC)的保守区、3'端和5'端.酸柚根系CS基因全长1760bp,开放读码框有1413 bp,编码472个氨基酸,氨基酸序列相对分子质量为52.487 ku,等电点为6.9,亲水指数为-0.199;5'端非编码区为67 bp,3'端非编码区为277 bp;推导的氨基酸经序列比对,发现与其他物种具有很高的同源性(85.4%-99.6%).酸柚根系PEPC基因全长3307 bp,开放读码框有2604 bp,编码868个氨基酸,氨基酸序列相对分子质量为99.569ku,等电点为6.68,亲水指数为-0.398;5'端非编码区为431 bp,3'端非编码区为269 bp,推导的氨基酸经序列比对,发现与其他物种具有很高的同源性(85.8%-95.7%).初步确定克隆到的为酸柚根系CS和PEPC基因,登陆Genbank,登陆号分别为HQ537481和HQ537482.     

野生二粒小麦低分子量谷蛋白基因序列分析

根据低分子量谷蛋白亚基(LMW-GS)基因编码区保守序列设计引物,用PCR方法从蛋白质含量低至13.17%的D81和高达27.20%的D42 2份野生二粒小麦(Triticumdicoccoides)中克隆得到2个LMW-GS基因序列LMW-D81和LMW-D42(GenBank上的序列号分别为FJ461691和FJ461690)。它们具有小麦低分子量谷蛋白基因的典型结构特征,其长度分别为1053bp和1011bp,并分别编码350和336个氨基酸残基的成熟蛋白。LMW-D42和LMW-D81的氨基酸序列估算分子量分别为38kDa和39kDa,说明二者均为C型亚基编码基因。LMW-D42和LMW-D81的N-末端序列都为METSHIP-,表明这2个C型亚基编码基因归属LMW-m型。同源性比对和聚类分析揭示,LMW-D81和LMW-D42均属于Glu-B3位点编码基因。LMW-D42和LMW-D81的核苷酸序列和推导的氨基酸序列一致性分别为93.94%和92.57%。与LMW-D81相比,LMW-D42除发生了22处间断性的碱基替换外,还存在一段42个碱基的缺失。对推导氨基酸序列进行的二级结构预测显示,LMW-D81和LMW-D42的蛋白质二级结构高度一致。其α-螺旋主要位于信号肽和C-末端,少量的α-螺旋和不规则卷曲构成了N-末端。大多数不规则卷曲位于重复区,仅有的一段β-折叠则出现在C-末端。同时,它们的编码区均具有分布一致的8个半胱氨酸残基,且第一和第七个半胱氨酸残基均位于无规则卷曲中。这些结构特点对小麦加工品质改良具有一定意义。     

猪肌生成抑制素(MSTN)基因cDNA克隆及序列分析

利用GenBank中猪肌生成抑制素(MSTN)编码序列设计引物,以湖北白猪背最长肌肌细胞总RNA为模板,利用RT-PCR技术,扩增出MSTN基因cDNA片段。该片段全长1277bp,包含猪MSTN基因的全部编码序列。将所得片段与pUCm-T载体连接,转化到DH5α大肠杆菌中,成功地筛选到阳性克隆,其质粒测序结果与文献报道的一致。     

PCR法扩增钙激活酶激活蛋白cDNA

钙激活酶激活蛋白是钙激活酶的激活蛋白, 可以促进钙激活酶活性的发挥, 从而促进肉的嫩化。采用PCR技术, 以山羊肝脏cDNA为模板经扩增得到钙激活酶激活蛋白(calpainactivator) 基因, 并进行了序列测定。该片段长1 017bp, 5′—端非翻译区长39bp, 3′—端非翻译区长567bp。编码区长411bp, 编码一个长137个氨基酸残基的蛋白质, 其理论分子量为14 298Da。与EdonMelloni等(1998) 报道的从牛脑中提取纯化的钙激活酶激活蛋白的氨基酸序列相比发现, 二者仅有五个位点不同。