甜瓜CmACOⅠ启动子组织特异性表达研究

 为进一步明确甜瓜果实软化的分子机理,构建了ACC氧化酶Ⅰ基因（CmACOⅠ）启动子与GUS基因融合的植物表达载体,采用根癌农杆菌介导法转化甜瓜‘甘甜一号’。通过卡那霉素抗性和 PCR检测筛选呈阳性的转化植株,取不同组织进行X-Gluc染色。结果表明,转化植株的根、茎、叶、花、果实等器官组织经X-Gluc染色后,只在花药组织和成熟果果皮中出现蓝色斑点,其余组织均未检出,表明甜瓜CmACOⅠ启动子能够驱动GUS基因在转基因甜瓜花药和成熟果果皮中特异表达。     

甜瓜肌醇半乳糖苷合成酶基因CmGAS1的表达与功能分析

甜瓜（Cucumis melo L.）是棉子糖系列寡糖（Raffinose Family Oligosaccharides,RFOs）转运型植物。肌醇半乳糖苷合成酶（GAS）是催化RFOs合成的关键酶。甜瓜CmGAS1基因（GenBank登录号为AY077642.1）的cDNA全长为1 903 bp,开放阅读框（ORF）为996 bp,编码331个氨基酸。CmGAS1蛋白分子量约为38 kD,理论等电点（pI）为4.81。氨基酸序列比对和系统进化树分析表明,CmGAS1氨基酸序列与黄瓜（AAO84915.1）亲缘关系最近,同源性为98.79%,与西瓜（Cla009222）同源性为97.58%。荧光定量结果表明,甜瓜叶片从幼叶（库）至成熟叶（源）CmGAS1的表达显著升高,第5节位叶片达到最大值。去掉50%叶片植株与对照相比,完全展开功能叶片的CmGAS1表达量明显升高。应用CmGAS1特异性启动子构建CmGAS1的过表达载体,并采用农杆菌介导进行甜瓜遗传转化,获得了PCR阳性转化植株,转化植株完全展开功能叶片的净光合速率以及叶片中的蔗糖、棉子糖、水苏糖含量与野生型相比均有所提高。推测CmGAS1在甜瓜叶片棉子糖系列寡糖合成过程中起重要作用。     

GUS基因在农杆菌和甜瓜中的表达差异研究

以农杆茵和转化的甜瓜组织为试验材料,通过组织化学染色法,来研究GUS基因在农杆菌和甜瓜组织中的表达.结果表明,含有GUS基因的农杆茵和甜瓜愈伤组织都能被染成蓝色,而不含有GUS基因的农杆菌和甜瓜愈伤组织没有被染色,因此在检测转基因植株时,可以减少或避免假阳性的出现,为植物的转化奠定了坚实的基础.     

抗生素对甜瓜植株再生的影响

在建立以农杆菌介导的表达ACC脱氨酶基因的甜瓜遗传转化体系过程中,进行了抗生素影响甜瓜植株再生试验。结果表明:卡那霉素对甜瓜愈伤组织、不定芽分化及生根均有明显的抑制作用,75 mg/L的卡那霉素百可作为今后甜瓜遗传转化筛选转化体和非转化体的临界浓度;200~400mg/L浓度范围内的氨苄青霉素能够很好地抑制农杆菌过度生长造成的污染,但对甜瓜植株再生的影响较小。     

抗生素对甜瓜植株再生的影响

在建立以农杆菌介导的表达ACC脱氨酶基因的甜瓜遗传转化体系过程中，进行了抗生素影响甜瓜植株再生试验。结果表明：卡那霉素对甜瓜愈伤组织、不定芽分化及生根均有明显的抑制作用，75mg/L的卡那霉素可作为今后甜瓜遗传转化筛选转化体和非转化体的临界浓度；200－400mg/L浓度范围内的氨苄青霉素能够很好地抑制农杆菌过度生长造成的污染，但对甜瓜植株再生的影响较小。     

CmMLO2：一个与甜瓜白粉病感病相关的新基因

 通过RT-PCR 方法从甜瓜中克隆得到白粉病感病相关基因CmMLO2 的cDNA 序列,GenBank 登录号为 FJ713542。该基因ORF 全长1 713 bp,可编码由570 个氨基酸组成的蛋白质,具有7 个跨膜螺旋结构,属于典型的 跨膜蛋白。RT-PCR 结果表明,CmMLO2 主要在甜瓜叶片中表达,具有组织特异性。在受到白粉病菌胁迫时CmMLO2 表达显著上调,表明CmMLO2 很有可能与白粉病发病有关。构建RNAi 表达载体pFGC1008-CmMLO2 后,利用叶 盘转化法转化甜瓜,获得了PCR 阳性植株,白粉病接种鉴定结果表明,转化植株对白粉病具有抗性,证明通过ihpRNAi 敲除CmMLO2,可以获得对白粉病具有抗性的甜瓜材料。     

甜瓜花器官发育相关基因的电子克隆及表达分析

以厚皮甜瓜（Cucumis melo）‘WI998’（纯雌系）与‘TopMark’（雄全同株）配制杂交组合获得的RIL₆群体为材料,对分离后代雌雄异花同株,雄全同株,完全花植株及纯雌株进行转录组测序,利用生物信息学分析方法,获得花器官发育相关基因序列Un16008,命名为CmTs2。该序列位于甜瓜第12条染色体上,长度1 842 bp,119 ~ 832之间存在一个包含237个氨基酸的最大开放式阅读框,成熟蛋白分子量为25 358.8 D,该蛋白不稳定系数为21.6,脂肪系数是99.11,平均亲水系数为0.078。通过Blast比对发现该基因与多种作物Tasselseeds2（TS2）基因具有高度同源性,其中与黄瓜Tasselseeds2基因同源性高达96%。通过实时荧光定量PCR检测,发现该基因在甜瓜雌雄异花同株花和叶片中表达量均高于其它性别类型植株,在纯雌株中表达量最低,说明该基因可能参与甜瓜花器官发育,尤其是雌花发育的过程。     

甜瓜反义酸性转化酶基因对甜瓜的遗传转化

利用子房注射法将甜瓜反义酸性转化酶基因导入厚皮甜瓜自交系‘0123’果实, 应用PCR和Southern Blot对后代进行分子鉴定。结果表明, 330株甜瓜转化植株中, 有2株为阳性转基因植株, 转化率约为0.6%。进一步研究发现, T0代转基因甜瓜植株生长势减弱, 果实比对照小30%左右, 但可溶性糖含量比对照提高了52%。PCR和PCR - Southern Blot鉴定表明, T0-1的自交后代没有基因丢失, 反义酸性转化酶基因已在转基因植株中稳定遗传。T1代转基因植株生长势也明显减弱, 但成熟果实可溶性总糖含量提高了26% , 蔗糖含量比对照提高了2.5倍, 果糖和葡萄糖含量略有降低, 酸性转化酶活性比对照明显降低。这些结果表明, 反义酸性转化酶基因通过降低酸性转化酶活性, 调控了甜瓜果实蔗糖代谢过程, 改变了甜瓜果实糖分组成, 同时抑制了植株生长。     

苹果花粉中与花柱S-RNase互作的γ-硫堇筛选及鉴定

以‘国光’苹果（S1S2）花粉为材料,成功构建了酵母pGADT7-cDNA文库,转化效率约为1.2×106.μg-1,插入片段大小在300~2000bp之间。通过酵母双杂交方法,用苹果S2-RNase的C2HVC3区筛选文库获得一个长505bp的cDNA片段,经分析发现该cDNA序列上有一个261bp的开放阅读框（ORF）,该ORF编码一个具N端信号肽的多肽,该成熟多肽由64个氨基酸组成,富含带正电荷的赖氨酸和精氨酸,其C端有8个半胱氨酸和一个γ-硫堇功能域,结构预测显示其具有一个α螺旋,3个β折叠,4个二硫键,由此,推断其为苹果γ-硫堇,命名为MdD1。RT-PCR分析发现：MdD1基因在‘国光’苹果叶片、萼片、花瓣、子房、花药和花柱等组织中都有表达,但花药中表达量最高。酵母双杂交结果表明MdD1除了与苹果S2-RNase的C2HVC3区互作外,还与S1-RNase的C2HVC3区,S1、S2-RNase的成熟多肽区存在互作。初步认为：苹果γ-硫堇可能通过与S-RNase非特异性互作,作为花粉非S因子参与自交不亲和反应。     

甜瓜抗旱性相关基因MeP5CS的克隆、序列分析及表达

用GenBank登录的抗旱相关基因序列进行比对,在保守区域设计一对引物,利用RT-PCR获得了一个甜瓜抗旱相关基因,命名为MeP5CS。生物信息学分析表明,该基因全长1000bp,开放阅读框(ORF)753bp,编码250个氨基酸;MeP5CS蛋白大小约82.18kD,理论pI值为4.90;MeP5CS编码蛋白与桐花树、猕猴桃和葡萄同源性较高,分别为94%、81%和73%。该蛋白含约40.2%的α-螺旋,25.2%的β-转角,34.6%的不规则卷曲,在第19～20氨基酸之间存在信号肽的剪切位点;MeP5CS编码蛋白是疏水性蛋白,有2个跨膜螺旋结构和13个磷酸化位点。半定量RT-PCR表明,MeP5CS在甜瓜根系中表达最高,茎中次之,叶片中表达较低。MeP5CS基因在甜瓜组织中的表达受丛枝菌根真菌(AMF)和水分胁迫双重诱导,与甜瓜的组织特异性和水分胁迫处理时间有关。水分胁迫条件下,接种AMF可以显著增加甜瓜幼苗脯氨酸的积累量,菌根甜瓜幼苗的脯氨酸积累与MeP5CS基因的表达呈正相关。     

黄河蜜甜瓜CMV CP基因转化及其抗病性鉴定

利用整合有CMVCP基因及NPT-II基因的改建质粒pBim438,以农杆菌为载体,对黄河蜜甜瓜子叶进行转化,以75mg/L卡那霉素筛选转化体,获得了完整的转基因植株。Southern杂交证明转化植株整合了CMVCP基因,Western杂交证明转基因获得了表达。温室CMV攻毒试验及病毒含量测定表明,转基因甜瓜对CMV的侵染表达了较高的抗病性,能够推迟系统症状显症发生,减轻病害发生程度,转基因植株体内病毒含量低于对照。转基因植株抗病性存在差异,筛选出的2个抗性株系中,TM0-1抗性高于TM0-2。     

瓜类褪绿黄化病毒p22 基因在大肠杆菌中的表达及抗血清的制备

 以被瓜类褪绿黄化病毒（Cucurbit chlorotic yellows virus,CCYV）侵染的甜瓜叶片为供试材 料,采用RT-PCR 方法克隆其P22 蛋白基因,并将其连接到原核表达载体pGex-4T-3 上,PCR 验证及克隆 测序确定开放阅读框的正确性。将重组载体pGexp22 转化大肠杆菌BL21 菌株,诱导表达,SDS-PAGE 分 析表明,经IPTG 诱导,p22 基因在大肠杆菌BL21 中得到了高效表达。以表达的蛋白作为抗原,免疫家 兔,制备了CCYV P22 的特异性抗血清。ACP-ELISA 检测结果表明,血清效价高达1.28 × 10⁵。Western blot 检测甜瓜叶片,结果表明抗血清能够特异性地检测CCYV 侵染的甜瓜叶片中的CCYV P22 蛋白。     

甜瓜多聚半乳糖醛酸酶反义基因植物表达载体的构建及其转化烟草的研究

用限制性内切酶从目的基因供体质粒pBI-aPG上切下大小约2.3kb的目的基因,将它定向连接在受体质粒pCAMBIA2301载体上,构建成含有GUS基因和NPTⅡ基因的甜瓜多聚半乳糖醛酸酶反义基因植物表达载体pCB-aPG。采用直接转化法将pCB-aPG导入根癌农杆菌菌株LBA4404,采用该菌株对普通烟草进行了遗传转化研究。在Kanamycin选择压力下获得的烟草转化不定芽和完整植株,经过GUS基因组织化学法检测以及PCR方法鉴定,证实了该反义基因已导入烟草基因组中。此项研究为下一阶段用该反义基因转化甜瓜品种以改良甜瓜果实耐贮运性打下基础。     

中国商陆抗病毒蛋白基因的克隆及其转化辣椒

根据美洲商陆抗病毒蛋白基因序列设计引物,从中国商陆（Phytolacca acinosa）叶片基因组DNA扩增克隆缺失无毒型中国商陆抗病毒蛋白基因（PacPAP1）,构建该基因植物表达载体,采用农杆菌介导的叶盘法转化辣椒,对转基因植株进行分子检测,TMV及CMV人工接种鉴定,25d后统计发病情况。结果表明：克隆得到缺失无毒型PAP基因PacPAP1,大小为714bp,与美洲商陆抗病毒蛋白基因（Pam-PAP）的同源性为99.7%;得到了PacPAP1整合入辣椒基因组中的阳性植株;接种TMV、CMV的阴性对照植株都明显发病,转PacPAP1植株未出现症状,说明转基因辣椒植株可获得抗TMV和CMV材料。     

以PMI为选择标记的露地菊转Lc-14-3-3基因体系的建立及功能鉴定

 从东北地区高pH盐碱地上生长良好的羊草中克隆Lc14-3-3基因，以露地菊（Chrysanthemum morifolium）‘火焰’叶片愈伤组织为受体，以农杆菌介导，将Lc14-3-3基因转入‘火焰’基因组中。以载体中的磷酸甘露糖异构酶基因（phosphomannose isomerase，PMI）为筛选标记，通过甘露糖的筛选，结合PCR、Southern杂交检测Lc14-3-3整合到其基因组。通过转基因植株与对照植株的耐盐性对比可见转化Lc14-3-3基因植株具有更高的耐盐能力。磷酸甘露糖异构酶基因/甘露糖筛选系统可有效应用于露地菊遗传转化。     

野生甜瓜MLO基因突变体对白粉病菌的抗性分析

以野生和栽培甜瓜为试材,通过人工接种白粉病菌,对两份材料的抗性进行了鉴定,结果表明野生种质对甜瓜白粉病菌生理小种Race1具有抗性。基因测序发现野生种质与栽培品种的MLO基因序列相差85个碱基。进一步利用荧光标记的农杆菌介导法将CmMLO2基因在野生种质中表达,白粉病菌能够感染阳性转化植株,说明CmMLO2突变使野生种质缺失MLO蛋白,导致对白粉病的负调控作用被解除,从而启动了对白粉病菌的广谱抗性。     

自交系BU—21／3——甜瓜（Cucumis melo L．）转基因育种的有效工具

甜瓜转化率低的问题仍具有挑战性。用1个新特质甜瓜自交系BU-2l／3作材料研究其再生和转化能力，表明这个自交系的再生能力优于以往研究过的基因型。用含有报告基因GUS或GFP的根癌农杆菌浸染子叶外植体，研究瞬时表达和稳定表达效率，观察到了大量瞬时表达，稳定表达时每个外植体可产生0．4-1．5个转基因芽，在转化后的8-10周，将转基因植株移入可控温室，发现表型和育性正常。再生能力的遗传分析表明它受单个显性位点控制，因此，这种新特质的基因型有望成为甜瓜转基因育种的有效工具。     

甜瓜syntaxin家族基因鉴定及其对白粉病菌响应分析

为了揭示突触融合蛋白(syntaxin)家族基因在甜瓜抵御白粉病过程中的功能,采用生物信息学方法从甜瓜基因组序列中鉴定到17个syntaxin家族成员,这些基因不均匀地分布在9条染色体上。系统进化分析发现甜瓜17个syntaxin家族成员属于7个亚家族(SYP-1、SYP-2、SYP-3、SYP-4、SYP-5、SYP-7、SYP-8),表明不同syntaxin家族成员之间具有不同的分子功能。基因结构分析表明甜瓜syntaxin家族基因包含1～12个内含子。组织表达分析表明有10个甜瓜syntaxin家族基因组成性表达,7个基因组织特异性表达。此外,甜瓜幼苗经白粉病菌人工接种侵染之后,9个syntaxin家族基因呈现不同程度的响应,9个syntaxin家族基因与MLO家族基因共表达,推测其在甜瓜抗白粉病过程中发挥重要功能。     

乙肝表面抗原大蛋白(S1S2S)基因在转基因苹果中表达

构建了乙肝表面抗原大蛋白基因PRS-S1S2S的表达载体pYF9616,通过根癌农杆菌介导法首次将该基因导入苹果品种红爱佳中,得到了抗卡那霉素的GUS阳性转化植株。随机取3株GUS染色阳性的转基因苹果植株经PCR扩增及RT-PCR检测证实该基因已整合入转基因苹果的基因组,并在转录水平得到了表达,ELISA检测证明在苹果植株中正确表达了乙肝表面抗原大蛋白基因。     

杏香气形成特异基因PaCCD1的克隆与功能分析

以‘轮台小白杏’果实为材料,利用转录组测序筛选获得的类胡萝卜素裂解双加氧酶CCD1基因片段设计特异引物,使用 RACE技术克隆全长cDNA序列,命名为PaCCD1。该基因长为1 885 bp,开放阅读框（ORF）1 644 bp,编码547个氨基酸残基,蛋白质分子量为61.699 kD。氨基酸序列比对发现,PaCCD1与甜瓜等其他已知功能的CCD1相似,具有4个保守的组氨酸残基、2个半保守的谷氨酸残基和1个天冬氨酸残基。活性位点分析表明,PaCCD1编码的蛋白存在多个糖基化位点和磷酸化位点。进化树分析表明,PaCCD1与AtCCD1（拟南芥）及碧桃等的CCD1在同一分支上,其中与PpCCD1（碧桃）和CmCCD1（甜瓜）的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR结果表明,PaCCD1在杏幼果中表达量最高,在花中表达量次之,而在根、叶和1年生枝条中不表达,具有组织表达特异性。杏果实发育和成熟过程中,果皮和果肉中PaCCD1的表达均显著上调,主要类胡萝卜素β–胡萝卜素和叶黄素的含量显著下降,而脱辅基类胡萝卜素类香气物质二氢–β–紫罗兰酮、β–紫罗兰酮和β–大马酮的含量显著增加。将目的基因通过转化大肠杆菌,获得了体外表达蛋白,饲喂类胡萝卜素的底物特异性测定发现,PaCCD1蛋白能较快吸收β–胡萝卜素产生二氢–β–紫罗兰酮和β–紫罗兰酮,能吸收叶黄质产生β–大马酮。据此推测PaCCD1是控制杏果实脱辅基类胡萝卜素类香气物质形成的关键基因。