苜蓿萎蔫病菌TaqMan探针实时荧光PCR检测方法的建立

苜蓿萎蔫病菌是我国对外检疫性二类有害生物，目前国内尚无发生6在出入境捡验检疫中主要是采用生物学和血清学方法进行检测，劳动强度大，耗费时间长。根据苜蓿萎蔫病菌与其它细菌菌株16SrDNA序列差异，设计出对苜蓿萎蔫病菌具有稳定点突交特异性探针，利用该探针对棒形杆菌属4个种及其它属细菌进行了实时荧光PCR检测实验。结果表明，只有苜蓿萎蔫病菌能检测到荧光信号，其它细菌没有荧光产生。该方法特异性强，灵敏度高，能检测到21．4fg质粒DNA，比常规PCR灵敏100倍，而且整个过程只需要2～3h。该方法可有效地应用于进出境病原菌检测之中。     

实时荧光PCR快速检测苹果蠹蛾

苹果蠹蛾(Cydia pomonella L.)是重要的国际检疫性害虫。本文根据苹果蠹蛾线粒体COI基因序列设计引物和探针,对苹果蠹蛾及其相似种进行实时荧光PCR检测,结果表明,不同虫态的苹果蠹蛾均能够与近似种类区分开来。该技术可快速准确地鉴定苹果蠹蛾,为检疫性害虫苹果蠹蛾的检疫提供了一种新的方法。     

向日葵黑茎病菌TaqMan-MGB探针实时荧光快速检测方法

 向日葵黑茎病菌是我国进境检疫性有害生物名录中的一种检疫性真菌。根据向日葵黑茎病菌及其近似种的ITS序列差异,设计并合成特异性引物和探针,建立了向日葵黑茎病菌的实时荧光PCR检测方法。特异性试验结果表明,该检测方法能特异性检测向日葵黑茎病菌;灵敏度试验结果表明,最低检测限量为20 μL反应体系中总DNA含量0.1 pg;实时荧光PCR优化反应条件为引物终浓度0.6 μmol·L^-1,探针终浓度0.3 μmol·L^-1。实际样品检测结果表明,该方法可用于疑似携带向日葵黑茎病菌样品的检测与初筛。此方法快速、灵敏,整个反应过程约1 h,检测过程完全闭管,无需PCR后续处理,为早期快速检测向日葵黑茎病菌提供了重要参考。     

鳞球茎茎线虫实时荧光PCR检测技术的研究

传统的线虫形态学鉴定存在经验性强和幼虫难以鉴定等不足.本文根据线虫ITS基因序列多态性,设计鳞球茎茎线虫(Ditylenchus dipsaci)特异的TaqMan探针,建立了实时荧光PCR检测方法.对茎线虫属的鉴定实验表明:只有鳞球茎茎线虫产生特异性荧光信号,同属的其他线虫均检测到荧光信号.整个检测过程只需30min到2h,能够满足口岸检验检疫快速通关的要求.     

奶粉中阪崎肠杆菌检测方法行业标准通过审定

由我院和天津出入境检验检疫局牵头完成的“奶粉中阪崎肠杆菌检测方法”行业标准于2005年5月20日在京通过了审定。该标准建立了阪崎肠杆菌的改进的传统检测方法（经典方法）、普通PCR方法和荧光PCR方法（快速筛选方法），其中改进的传统方法与美国FDA方法相比检测结果一致，但效率大大提高，时间缩短1／3～1／2。以田波院士为主任的标准审定委员会一致认为，该标准操作性强、特异性好、便于推广使用。     

张家港局在船检中截获小麦矮腥黑穗病菌

2007年4月上旬，张家港局检验检疫人员在对某韩国籍化工品船实施登轮检疫时，发现该船储存于干货库内的面粉品质较差，根据其包装及询问确认该面粉来自于美国，检疫人员随即取样带回。后经江苏局植检实验室进一步的检测鉴定及复核，确认该面粉携带小麦矮腥黑穗病菌（Tilletia controversa Kuhm）。据悉，这是张家港首次在船舶检疫中截获该病害。     

冬生疫霉的实时荧光PCR检测方法

冬生疫霉(Phytophthora hibernalis)是我国检疫性病原菌。本研究根据冬生疫霉的ITS基因序列,设计了实时荧光PCR引物PH-F和PH-R及TaqMan-MGB探针PH-Pr,建立了冬生疫霉的实时荧光PCR检测方法,可检测到冬生疫霉DNA最低浓度为50 fg/μL,而冬生疫霉的近似种、近缘种和空白对照,无荧光信号增加。因此,利用该方法可以稳定、高效的检测出冬生疫霉。     

利用实时荧光PCR技术检测风信子黄腐病菌

风信子黄腐病菌是我国禁止入境的病原细菌之一,我国目前尚无该病的发病报道.本研究根据风信子黄腐病菌基因组16S-23S ribosomal RNA intergenic spacer保守序列,设计并合成了1对特异性引物和1条具有稳定点突变特异性探针进行实时荧光PCR检测,风信子黄腐病菌有很强的荧光信号,供试的其它7种病原细菌菌株均没有荧光产生.与常规PCR相比,实时荧光PCR检测特异性强,灵敏度高,适合病害的快速诊断和口岸检验检疫应用.经优化反应条件,建立了稳定的风信子黄腐病菌实时荧光PCR检测方法.     

利用TaqMan探针实时荧光PCR方法检测香石竹细菌性萎蔫病菌

 根据香石竹细菌性萎蔫病菌基因组16S-23S rRNA保守序列,设计并合成了一对特异性引物和一条具有稳定点突变特异性探针,建立了对香石竹细菌性萎蔫病菌的TaqMan实时荧光PCR检测方法。除香石竹细菌性萎蔫病菌外,还对其他7种病原细菌菌株进行了荧光PCR检测。结果表明,只有香石竹细菌性萎蔫病菌产生荧光,其他病原细菌均没有荧光产生。与常规PCR相比,实时荧光PCR检测特异性强,灵敏度高,能检测到浓度为0.4 pg/μL的DNA,且能直接用于苗木等样品的检测,适合病害的快速诊断和口岸检验检疫应用。      

实时荧光PCR技术在植物线虫诊断中应用

定量荧光PCR技术发明以后，很快在生物学各个领域得到广泛应用，本文介绍了定量荧光PCR的种类、原理以及优缺点，详细论述定量荧光PCR在线虫检测研究中方法的建立以及应用，同时对实验中注意事项进行分析，最后对该技术在线虫研究中进一步应用进行展望。     

张家港局检出大豆疫霉病

2005年1月,张家港局对一批来自美国的6万t大豆实施检疫时,抽取了样品和其中携带的土壤颗粒,经过PCR快速检测方法和传统的叶碟诱集法的两次相互验证检测,确认该批大豆中携带大豆疫霉病菌.现已对该批大豆进行了除害处理.     

甘蔗宿根矮化病菌实时荧光定量PCR检测方法的建立

 甘蔗宿根矮化病是由Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx)引起的一种世界性甘蔗细菌病害。根据Lxx的Pat1基因保守序列,设计并合成了一对特异性引物Pat1F (5′-GGTTCCATTGCTTACCGATT-3′)/Pat1R(5′-CAAGTTTCGACAGGAACAGC-3′),和一条TaqMan探针(FAM-5′-CCACGGCTACGTCAATTCGGG-3′-TAMRA),建立了一种特异性强、灵敏度高的甘蔗宿根矮化病菌实时荧光定量PCR检测方法。结果表明,本研究建立的实时荧光定量PCR方法,对Lxx的检测最低下限为10² copies·μL^-1。应用实时荧光定量PCR与常规PCR方法对14个甘蔗品种进行Lxx检测,阳性检出率分别为86%和43%,表明实时荧光定量PCR比常规PCR检测方法具有更高的灵敏度。研究结果为甘蔗宿根矮化病的诊断、田间发生动态监测、脱毒健康种苗检测及品种/材料交换检疫检测提供了新技术支撑。     

应用实时荧光PCR检测苹果果实球壳孢腐烂病菌

根据苹果果实球壳孢腐烂病菌(Sphaeropsis pyriputrescens Xiao&J.D.Rogers)ITS区序列设计特异性引物和TaqMan荧光探针,建立了苹果果实球壳孢腐烂病菌的实时荧光PCR检测方法。该方法能够特异性检测苹果果实球壳孢腐烂病菌,供试的目标菌株检测结果为阳性,而苹果轮纹病菌、苹果炭疽病菌、苹果干腐病菌和苹果褐腐病菌、苹果腐烂病菌等5种对照菌株检测结果为阴性。该方法具有快速、简便、准确的优点,适合于该病害的快速诊断和口岸检验检疫运用。     

番茄细菌性溃疡病菌的实时荧光PCR检测

 由Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis(Cmm)引起的番茄细菌性溃疡病是一种严重危害番茄生产的种传细菌性病害。根据ITS序列多态性设计引物及TaqMan探针进行实时荧光PCR检测的结果表明,这组引物一探针能检测出所有供试的Cmm菌,对照菌均未检测到荧光信号。用接种但未显示症状的番茄苗叶片及人工处理的带菌种子提取的核酸作为模板,均能检测到病菌,其检测灵敏度比常规PCR高约100倍。实验中不需病原菌的分离培养及PCR的后续处理。该方法快速、简便、安全、准确,适用于出入境检验检疫及种子、种苗健康检测领域。     

利用常规PCR和实时荧光定量PCR检测杨梅凋萎病菌

凋萎病是近年来危害杨梅的主要病害。为了快速灵敏的检测杨梅凋萎病菌(Pestalotiopsis versicolor和P.microspora),本研究开发了常规PCR和SYBR Green实时荧光定量PCR技术各一套。利用P.versicolor(JN861773)和P.microspora(JN861776)的ITS1-5.8S rDNA-ITS2序列的相同部分设计引物对(Pvm1L/Pvm1R)。该引物对利用常规PCR技术能特异性扩增出杨梅凋萎病菌188 bp的目标产物而对照菌株则呈阴性。该常规PCR体系能够检测人工接种后21 d和田间自然发病的有病症杨梅组织中的凋萎病菌,检测下限是0.6×10~5拷贝数。利用Pvm1L/Pvm1R进行SYBR Green实时荧光定量PCR,检测灵敏度是常规PCR的100倍,检测下限是0.6×10~3拷贝数,能够检测出人工接种及田间已经感染但尚未表现症状的杨梅组织中的凋萎病菌。这两项技术简单、快速、灵敏特异性强,可以应用于杨梅凋萎病的诊断和苗木检疫。     

不同品系赤眼蜂对烟青虫卵的寄生选择性

采用棚室笼罩试验，研究了松毛虫赤眼蜂和螟黄赤眼蜂的不同品系对不同卵龄烟青虫卵的寄生选择性、松毛虫赤眼蜂HJS品系对烟草不同叶位、叶面上的烟青虫卵及不同植物（辣椒和烟草）上的烟青虫卵的寄生选择性。结果表明，松毛虫赤眼蜂HJS、YYS品系和螟黄赤眼蜂JDM品系对0～12h烟青虫卵的寄生率显著高于12～36h的卵；而螟黄赤眼蜂GGM品系对该二卵龄烟青虫卵的寄生选择性无显著差异。不论位于叶正面、叶背面还是整叶上的卵，松毛虫赤眼蜂HJS品系均对倒10～12叶位的卵寄生选择系数最高，其次为倒13～15叶，对倒1～6叶均较低，这与烟青虫产卵对叶位的选择不同；HJS对所有叶位叶正面烟青虫卵的寄生选择系数均高于对背面的，并以倒1～3和倒4～6叶位最为明显，且HJS对叶正面卵的寄生倾向和程度与烟青虫雌蛾在该叶位正面产卵的倾向及程度存在差异，该差异因叶位不同而不等。HJS对辣椒上烟青虫卵的寄生选择系数较高，而烟青虫偏好产卵于烟草。     

菠菜中3种新烟碱类杀虫剂多残留分析方法研究

寄生隐丛赤壳菌是引起板栗疫病的致病菌。为建立该菌的分子检测技术,本研究首先采用通用引物 ITS1／ITS4对分离自四川雅安、泸州及重庆的寄生隐丛赤壳菌及其他参试菌株的 ITS 区进行 PCR 扩增和测序比对。根据该片段与 GenBank 中隐丛赤壳属其他种的 ITS 序列差异,设计了寄生隐丛赤壳菌的特异性引物 ITSP1／ITSP2,片段扩增大小为462 bp。利用该引物对菌株基因组 DNA 进行扩增,可以将寄生隐丛赤壳菌与其他参试菌区分开,检测灵敏度达30 pg。而以引物 ITS1／ITS4和 ITSP1／ITSP2进行的巢氏 PCR,可检测到30 fg 基因组 DNA,其灵敏度较常规 PCR 提高了1000倍。利用巢氏 PCR 检测体系对发病程度不同的组织和携菌组织进行检测,均能快速稳定地检测出寄生隐丛赤壳菌。     

花园葱蜗牛形态学与PCR检测鉴定技术

花园葱蜗牛(Cepaea hortensis Müller)是我国新增的进境植物检疫性有害生物名录中的成员,该螺与近似种在贝壳形态上难以鉴别。本文应用贝壳、软体解剖和PCR技术相结合的方法,研究了花园葱蜗牛的检测鉴定技术,结果表明,PCR方法特异性强、灵敏度高、检测结果稳定,并与形态学鉴定结果一致,该方法为非软体动物分类专业的检疫人员检测鉴定花园葱蜗牛提供了快速简便的技术方法。     

转基因延熟番茄"华番一号"的品系特异性检测方法

本文使用反向PCR方法克隆了转基因延熟番茄"华番一号"(Bioscein)的外源基因和番茄基因组之间的一段边界序列,并依据此段序列设计了具有品系特异性的引物和荧光探针,以实时荧光PCR技术建立了华番一号的品系鉴定检测方法,扩增片段长108bp,横跨在Nos启动子和番茄基因组之间.以转基因大豆(RR)、转基因玉米(Mon810)、转基因抗草甘膦油菜、转基因棉花(保龄棉)、非转基因番茄、马铃薯、茄子、大椒、大米、小麦、烟草等为试材,证明本方法同其它转基因作物及其它蔬菜无非特异性反应.本方法在检测华番一号番茄时,相对检测灵敏度可达到0.1%,绝对灵敏度达到20个拷贝.由于本方法的PCR扩增产物长度只有108bp,因此该方法也可以用于检测加工产品中的转基因成分,或作为常规PCR定性检测后的确证实验方法.     

葡萄苦腐病菌的分子检测方法

葡萄苦腐病菌(Greeneria uvicola)是我国检疫性有害生物.本研究根据G.uvicola的ITS基因序列,设计了PCR引物GUA-1和GUA-2以及实时荧光PCR引物GUA-P1和GUA-P2及荧光探针GUA-Probe-117.利用引物GUA-1和GUA-2进行PCR扩增,G.uvicola和感染G.uvicola的红提葡萄可产生354 bp的特异性片段;实时荧光PCR扩增,G.uvicola和感染G.uvicola的红提葡萄均出现强荧光信号(△Rn)增加.而葡萄上其他常见真菌样品以及健康的红提葡萄既无特异性扩增也无荧光信号增加.灵敏度测试中,普通PCR可检测到含G.uvicola DNA浓度0.05ng/μL以上的样品,实时荧光PCR可检测到含G.uvicola DNA浓度0.0005 ng/μL以上的样品.由此确立了G.uvicola的两种稳定可靠、灵敏的分子检测方法.