复叶械FtsZ基因的克隆、RNA干扰载体的构建及其在烟草中瞬时表达

利用简并引物RT-PCR,克隆复叶槭FtsZ基因的cDNA序列,利用马铃薯X组病毒载体pgR107,构建RNA干扰重组病毒载体pVX-AnFtsZi,并转化农杆菌GV3101(含辅助质粒pJIC Sa-rep)侵染烟草.40 d后,检测烟草内源FtsZ基因的表达量.研究结果表明:从复叶械中克隆到的569bpFtsZ基因cDNA片段,具有FtsZ蛋白的核心功能序列GGGTGSG.构建的hpRNA型RNA干扰载体抑制了FtsZ基因的表达.为培育槭树类彩叶新品种奠定分子理论基础.     

复叶槭FtsZ基因的克隆、RNA干扰载体的构建及其在烟草中瞬时表达

利用简并引物RT—PCR,克隆复叶槭FtsZ基因的cDNA序列,利用马铃薯X组病毒载体pgR107,构建RNA干扰重组病毒载体pVX—AnFtsZi,并转化农杆菌GV3101（含辅助质粒pJICSa—rep）侵染烟草。40d后,检测烟草内源FtsZ基因的表达量。研究结果表明：从复叶槭中克隆到的569bpFtsZ基因cDNA片段,具有FtsZ蛋白的核心功能序列GGGTGSG。构建的hpRNA型RNA干扰载体抑制了FtsZ基因的表达。为培育槭树类彩叶新品种奠定分子理论基础。     

美国白蛾的危害及其防治

简介了美国白蛾传入中国后扩散、危害情况及主要防治方法,即营林技术、生物防治和化学防治技术。     

美国白蛾核型多角体病毒ORF72原核表达载体的构建、表达及纯化

[目的]根据Ikdea对Hycu NPV全基因组序列的分析,筛选出功能还未被研究的、保守性高的ORF72基因。[方法]将ORF72基因构建到原核表达载体p GEX-4T-1上,对其进行诱导表达,优化表达的条件,并通过GST亲和层析色谱柱纯化融合蛋白。[结果]重组质粒p GEX-4T-1-ORF72的酶切检测以及测序结果均正确,证明重组质粒载体构建成功。通过SDS-PAGE凝胶电泳显示,ORF72蛋白能够与p GEX-4T-1载体上的GST标签蛋白进行融合表达,诱导表达后的融合蛋白大小约为38. 2 k Da。优化后的表达条件为:异丙基硫代β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导浓度为1. 0 mmol·L-1,最佳诱导温度为25℃,最佳诱导时间为4 h,并且该蛋白在大肠杆菌BL21和Rosetta表达菌株中均能很好的表达,但在Rosetta菌株中表达量更高。[结论]成功构建了p GEX-4T-1-ORF72原核表达载体,确定出ORF72融合蛋白最佳诱导表达条件,诱导表达并纯化出ORF72融合蛋白,为进一步研究其生物功能奠定基础。     

蜡梅几丁质酶基因的克隆与原核表达

在构建好蜡梅花cDNA文库并进行EST分析基础上,通过随机克隆测序,得到1个蜡梅几丁质酶的cDNA基因,命名为Cpchia(GenBank登录号:FJ749130).Cpchia cDNA全长为1 184 bp,开放阅读框为954 bp,编码317个氨基酸,其结构包括信号肽、几丁质结合域、可变交联区、催化区,无C端延伸区,为Class Ⅰ b型胞外几丁质酶,属于几丁质酶第19家族.将Cpchia克隆到原核表达载体pET-28a(+),在大肠杆菌BL21细胞中以包涵体形式表达融合蛋白,利用透析法获得复性蛋白,其几丁质酶活性经DNS法检测达到200 U·mL~(-1).酶活性和稳定性分析表明,试验条件下,pH 7.0有利于酶的稳定和活性发挥,40 ℃活性最高,在0 ℃低温下也有较高活性.上述结果说明,分离的Cpchia基因编码蛋白具有几丁质酶活性,而且可能与蜡梅花的抗寒性形成有关.     

杀铃脲对美国白蛾的作用机制研究

杀铃脲是一种新型的昆虫生长调节剂，已应用到农林害虫的综合治理中，并取得了较好的防治效果。研究表明利用杀铃脲防治美国白蛾，可使其幼虫内表皮的组成成份发生改变。利用１０ｐｐｍ或２０ｐｐｍ的杀铃脲处理后的幼虫内表皮的几丁质沉积量，可分别比对照减少１７．７４％和２１．２４％，脂肪和灰份的含量也有所增加。利用该药剂处理后，幼虫生长缓慢，头宽、体长和体重均小于对照组，且其体壁缺少硬度，不能在蜕皮、变态过程中给肌肉以足够的支持。这表明杀铃脲具有抑制美国白蛾幼虫体壁的几丁质合成和沉积作用     

转基因杨树对美国白蛾幼虫中肠保护酶系统的影响(英文)

以转Bt基因欧洲黑杨(P.nigra L.)和转CpTI基因毛白杨(Populus tomentosa)叶片饲喂4-5龄美国白蛾（Hyphantria cunea Drury）幼虫，对其体内保护酶系统活性进行测定。结果表明，饲喂两种转基因杨树叶片的幼虫中肠保护酶表现出相似的变化规律，SOD、CAT和POD三种酶的活性在饲喂后数小时内逐渐增加，某一时刻达到最高值，此后突然下降。饲喂转Bt基因杨树叶片的幼虫，其中肠SOD、CAT活性峰值出现在饲喂后的24小时，POD活性峰值出现在饲喂后的12小时；饲喂转CpTI基因杨树叶片的幼虫，其中肠三种保护酶活性高峰出现时间均较前者滞后12小时。本文还比较了饲喂两种转基因叶片不同中毒程度的美国白蛾幼虫体内保护酶活性，发现不论饲喂那种转基因叶片，中毒较轻者其体内保护酶活性显著高于中毒较重者，这种差异在饲喂CpTI叶片的处理株表现尤为明显。     

转基因741杨对美国白蛾幼虫生长发育及其中肠酶活性的影响

为了研究转基因741杨对美国白蛾抗虫稳定性及其生长发育的影响,选择转基因741杨Pb29、Pb17两个无性系为试验材料,测定各龄幼虫死亡率、各龄虫体重、排粪量。试虫取食转基因741杨2周后,测定其中肠淀粉酶和蛋白酶活性。结果表明,转抗虫基因杨树饲养的美国白蛾幼虫死亡率均高于CK 5.34%,高抗Pb29饲养的幼虫死亡率为93.84%,中抗Pb17的为50.01%;存活幼虫发育不正常,发育历期明显延迟,体重增加速率和排粪量均显著降低,高抗Pb29和中抗Pb17饲养的虫体重增长率分别为CK的3.8%和36%,排粪量分别比CK少0.585 7g和0.310 5g;取食转基因无性系的幼虫中肠蛋白酶及淀粉酶活性显著降低,Pb29对其蛋白酶和淀粉酶的抑制率分别为77.93%和96.38%,Pb17的抑制率分别为36.31%和21.14%。因此,转基因741杨树对美国白蛾幼虫中肠酶的抑制作用与对其生长发育的阻滞有良好的相关性,转基因741杨无性系对美国白蛾幼虫仍具有稳定抗性。     

几丁质酶及其在转基因植株内活力的测定及定位

介绍了几丁质酶的作用原理,植物中几丁质酶的分类及表达特点,采用荧光定量法测定转几丁质酶基因植株中几丁质酶的活性,对转基因植物的叶片进行体外包埋与切片,然后利用激光共聚焦显微镜扫描,以确定所转几丁质酶基因的表达部位。     

Co-rrp基因小干扰RNA载体的构建及烟草中的遗传转化

为研究油茶种子成熟调控蛋白基因的功能,以pCAMBIA1304质粒为载体,根据油茶种子成熟调控蛋白基因的cDNA序列设计了小干扰RNA(Si RNA)序列,构建了油茶种子成熟调控蛋白基因小干扰RNA植物表达载体pCAMBIA1304-si RNA,并借助农杆菌介导叶盘法将pCAMBIA1304-si RNA转化到野生型烟草中,获得了稳定表达的转基因烟草苗。为下一步的油茶种子成熟调控蛋白基因的功能鉴定奠定了基础。     

松材线虫Bxpel2基因的克隆及RNA干扰载体构建

[目的]为了构建松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)果胶酶Bxpel2基因干扰载体.[方法]通过Trizol 法提取松材线虫总RNA,反转录合成cDNA,设计带T₇启动子的果胶酶Bxpel2基因引物,以cDNA为模板扩增出果胶酶Bxpel2基因片段,连接到RNA干扰载体,再以干扰载体为模板,PCR扩增出目的片段后进行测序鉴定,合成果胶酶Bxpel2基因双链RNA(dsRNA),采用RT-PCR检测松材线虫Bxpel2基因干扰后的表达情况.[结果]表明:1)提取的松材线虫总RNA完整性好,无降解;2)成功克隆出松材线虫果胶酶Bxpel2基因片段(790 bp)并将其连接至pMD19-T载体;3)以RNA干扰载体为模板合成dsRNA,浓度分别为1.313 mg·mL^-1和1.152 mg·mL^-1;4)RT-PCR结果显示,松材线虫经过dsRNA干扰后,Bxpel2基因表达基本受到抑制.[结论]成功构建松材线虫果胶酶Bxpel2基因干扰载体,为进一步研究Bxpel2基因在松材线虫致病过程中的作用和功能奠定了良好的基础.     

美国白蛾直升飞机防治中的雾滴分析及其对防治效果的影响

飞机防治是美国白蛾防控的最主要措施之一。为进一步明确飞行参数对林间雾滴密度分布和对美国白蛾幼虫防控效果的影响,该文通过检测、比较不同飞行方案下林间雾滴密度及雾滴穿透力等数据,发现航速和高度对林间喷幅、雾滴穿透力、雾滴密度、雾滴均匀度均产生显著影响。方案2(航速150 km/h,飞行高度40—45 m),地面喷幅宽度为59.35 m,高于方案1(航速120 km/h,飞行高度30—35 m)的地面喷幅宽度。飞行方案2的雾滴穿透性也相对较好,顶层、中层、下层雾滴密度相对均匀;而方案1不同高度雾滴密度差异相对较为显著,树冠顶层(高度11—12 m)雾滴密度较多,最高雾滴密度可达9.8/cm2,随高度降低,雾滴密度下降明显,到底层叶片位置(高度3 m)时,雾滴密度仅为2.07/cm2,下降了78.9%。观测试验表明,林间雾滴密度应高于5.093/cm2,防控效果才能确保达到90%。     

美国白蛾对摩西球囊霉定殖银中杨的适应和生理响应

【目的】探明美国白蛾对丛枝菌根真菌(AMF)定殖银中杨的适应和生理响应,为揭示AMF在林木与植物昆虫之间的相互作用奠定基础,为利用AMF诱导增强林木化学防御提供理论依据。【方法】对银中杨扦插苗进行外源接种摩西球囊霉(GM),在GM侵染率达到最高时(90天),采叶饲喂美国白蛾幼虫,观察美国白蛾幼虫的生长发育、食物利用情况,分析其消化酶和解毒酶的活性变化。【结果】与对照相比,取食GM侵染的树叶后,3～6龄幼虫体质量均不同程度的低于CK,但差异不显著;2～5龄幼虫发育历期显著延长,且3龄和5龄幼虫相对生长率显著降低;美国白蛾5龄幼虫食物消耗率无显著差异,食物转化率和利用率被抑制;6龄幼虫食物消耗率、转化率和利用率均无显著差异。5龄幼虫脂肪酶活性显著增加,谷胱甘肽-S-转移酶(GSTs)活性被抑制,蛋白酶和淀粉酶、羧酸酯酶(CarE)活性与对照无显著差异。6龄幼虫脂肪酶、蛋白酶和淀粉酶、GSTs和CarE活性均显著高于对照。【结论】接种GM的银中杨对美国白蛾的生长发育和食物利用在短时间内有一定抑制作用,美国白蛾会通过提高消化酶和解毒酶活性来突破这种抑制作用,维持正常生长发育。     

绿粘帚霉F051产几丁质酶条件优化及其对三种病原菌的作用

系统研究了碳源、氮源、温度、起始pH值、培养基装量和接种量等因素对绿粘帚霉(Gliocladium virens)F051产几丁质酶的影响。结果表明,碳、氮源分别为麦芽糖和酵母粉最好,并通过正交试验法优化了发酵条件。优化后的产酶条件为:温度为28℃,pH值7,瓶装量为100 ml,每100 ml接种1 ml孢悬液,且碳源和氮源的量分别为1.5%和0.2%。从时间对菌丝生长和几丁质酶活的影响来看,培养第4天酶活便达到最高。在此基础上探索了几丁质对病原菌细胞壁的作用,结果显示,该几丁质酶粗酶液对3种病原真菌细胞壁有一定的降解效果,使病原真菌出现细胞壁变薄、断裂,质壁分离,原生质空泡等现象。     

飞机喷洒甲维·灭幼脲的雾滴参数测定及其防治美国白蛾效果的研究

为控制美国白蛾的危害,采用EC120直升机空中喷洒甲维·灭幼脲飞机防治专用悬浮剂,防治面积1万hm2。结果表明:施药高度在距林木顶端15—20 m时,雾滴密度较高,雾滴大小合适,均匀度较高,有效喷幅较大;树体上部的雾滴直径较大,分布不均匀;中、下部雾滴较小,均匀度较好;雾滴在上、中、下部的沉积密度差异显著。林间防治效果调查显示,飞机距林木顶端15—20 m施药24 h后美国白蛾的校正死亡率为20%左右,48 h后对美国白蛾的虫口校正死亡率可达40%,72 h后对美国白蛾的校正死亡率在70%左右。     

反义PSY基因植物表达载体的构建及其对中国水仙的转化

实验从中国水仙花瓣中分离得到该基因的572bp的片段，将该片段反向连接到pCAMBIA1301双元载体质粒上，得到CaMV 35S组成型启动子的表达载体pCAM35S-PSY，用“冻融法”将pCAM35S-PSY质粒转入农杆菌LBA4404和EHA105两个菌株中。PCR扩增和酶切鉴定结果表明，所构建的反义表达载体pCAM35S-PSY是正确的并已经成功导入农杆菌中。随后，按照业已建立的遗传转化体系对中国水仙进行了遗传转化，得到了转基因抗性芽。     

桑树景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶基因的克隆、原核表达与植物表达载体的构建

景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶(SBPase)是卡尔文循环过程中的关键酶.利用RACE技术得到景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶基因全长cDNA,命名为MSBPase(GenBank登录号;DQ995346).MSBPase全长为1 527 bp,该序列含有1个1 179 bp的完整开放读码框,编码393个氨基酸,蛋白质理论分子质量约为42.6 ku,等电点为5.85,其氨基酸序列与其他植物中已分离的SBPase有很高的同源性.对MSBPase编码的蛋白质(命名为MSBPase)进行结构预测分析表明,该蛋白富含无规卷曲(coil),高达64.29%,其次是α-螺旋(helix),为22.19%,而β-折叠(strand)只有13.52%.将MSBPase编码区插入原核表达载体pET30a( ),并转化到大肠杆菌菌株 BL21中,经过IPTG诱导,MSBPase融合蛋白在BL21菌株中成功表达.将得到的MSBPase编码区插入植物表达载体pBI121中,构建了MSBPase植物表达载体pBI121.SBP.