致病性马立克氏病病毒的污染与监测

马立克氏病（ Ｍａｒｅｋ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ，ＭＤ）是危害世界养禽业最严重的病毒性肿瘤性传染病。ＭＤ经羽毛囊排毒，空气传播，传染力极强，是鸡的三大主要疫病之一，可造成重大的经济损失。该病的致病因子为马立克氏病病毒（Ｍａｒｅｋ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅｖｉｒｕｓ，ＭＤＶ），属疱疹病毒科成员，根据其嗜淋巴细胞性相似于γ－疱疹病毒，而其基因组结构却相似于α－疱疹病毒［１］。 ＭＤＶ按其致病性和血清学反应不同分为三个血清型：血清Ｉ型（ＭＤＶＩ）包括致瘤致病性的强毒株（如 ＨＰＲＳ－ １７、ＧＡ、Ｍｄ／５、ＢＪ－１）…     

鸡马立克氏病病毒编码的miRNA体内表达特征分析

最新研究发现,鸡马立克氏病病毒(MDV)基因组编码的miRNAs在肿瘤发生发展中发挥了重要的调控作用.为阐明强弱毒株编码的miRNA差异表达与病毒复制的关系,本研究采用SYBR Green荧光定量PCR方法检测了MDV CVI988疫苗株和MDV GA强毒株编码的M4-5P、M8-3P和M12-3P 3种miRNAs在肝脏和胸腺中的动态表达特征.结果表明,强弱毒株编码的这3种miRNAs在病毒感染过程中具有明显的差异性,其中GA株编码的miRNAs表达量高于CVI988株,这是由于强弱毒株在体内的复制滴度差异造成的,表明在感染前期miRNAs的表达量与病毒载量有关.该研究为进一步研究miRNAs的功能提供了实验依据.     

miRNA干扰gM基因对马立克氏病病毒体外复制的抑制作用

用miRNA Target Finder分析软件预测干扰RB1B株马立克氏病病毒（Marek’s Disease Virus,MDV）gM基因翻译的潜在靶序列,从中筛选出3个作为干扰对象,根据干扰载体pRFPRNAiC特点,设计合成3对单链DNA序列,经PCR反应扩增出双链DNA,并将其插入干扰载体pRFPRNAiC,构建重组干扰质粒pRFPRNAiCgM1、pRFPRNAiCgM2、pRFPRNAiCgM3。将质粒pRFPRNAiCgM1以不同的剂量转染鸡胚成纤维（CEF）细胞,确定最佳转染质粒量,试验结果表明1μg转染剂量转染效果最佳。以1μg剂量将3种重组干扰质粒分别转染CEF细胞,24h后感染RB1B株MDV,72h后用空斑计数MDV在CEF细胞上增殖数量,以此判定miRNA干扰效果,结果显示,重组干扰质粒中质粒pRFPRNAiCgM2干扰效果较好,能有效抑制MDV在CEF上的生长繁殖。     

鸡马立克氏病病毒的分离与初步鉴定

从鸡马立克氏病病鸡拔取羽毛根 ,经处理后接种于 4日龄鸡胚绒毛尿囊膜。盲传到第六代出现典型的马立克氏痘斑。用第7代鸡胚绒毛尿囊膜研磨液与MD阳性血清进行琼脂扩散试验 ,结果出现了明显的白色沉淀线。此结果表明已分离到马立克氏病毒。     

马立克氏病病毒的分离与鉴定

从广西不同地区患马立克氏病的鸡群分离出１０株马立克氏病毒，命名为ＭＺ１、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４、Ｇ２、Ｌ１、Ｇ５、Ａｎ７、Ｎ。用ＭＤＶ分型单克隆抗体对Ｅ４、Ｌ１、Ｇ２、Ａｎ７、Ｎ毒进行血清型鉴定，结果除Ｅ４疑有血清Ⅱ型与血清Ⅰ型ＭＤＶ同时存在外，其余均为血清Ⅰ型ＭＤＶ。     

马立克氏病病毒的蛋白和疫苗研究进展

马立克氏病是严重危害养鸡业的重要传染病之一,对该病的研究可为肿瘤病的研究提供理想模型,本文从病毒编码的蛋白出发,重点介绍了病毒的酶类、抗原的研究进行及其在预防马立克氏病上的应用,提出利用载体构建重组疫苗对今后防制马立克氏病具有广阔的应用前景。     

马立克病病毒编码的miR-M4-5p调控宿主靶基因的筛选及鉴定

血清1型马立克病病毒（MDV-1）感染引起的鸡马立克病（MD）一直以来被认为是研究病毒诱导肿瘤发生机制的理想模型。此前研究发现,MDV-1编码的miR-M4-5p是宿主癌基因miR-155的病毒同源物,从基因组中敲除miR-M4-5p可显著降低MDV-1的致病性和致瘤性,表明miR-M4-5p可能是MDV-1诱导肿瘤发生的重要调控因子。为进一步揭示miR-M4-5p的调控机制,以CEF细胞总RNA反转录产物cDNA为模板,利用hybrid-PCR技术构建了miR-M4-5p的候选靶基因文库。通过基因克隆、PCR鉴定及序列比对分析,获得128个候选基因序列,有73个基因的3'-UTR存在miR-M4-5p的潜在结合靶点,其中23个3'-UTR结合靶点与miR-M4-5p完全互补配对。通过双荧光素酶报告试验和qRT-PCR分析,对miR-M4-5p与3'-UTR的体内外相互作用以及候选靶基因的表达水平进行分析和验证,最终鉴定DPT、TMEM230和DCLK1为miR-M4-5p调控的宿主靶基因。本研究为后续进一步阐明miR-M4-5p在MD肿瘤发生中的调控机制奠定了重要基础。     

鸽新城疫病毒野毒PB9601株的致病性研究

用不同方法测试了从新城疫患鸽分离到的新城疫病毒（ＮＤＶ）野毒ＰＢ９６０１株的致病性。结果,该毒株对１日龄ＳＰＦ雏鸡的脑内接种致病指数为２．００,对６周龄ＳＰＦ鸡静脉接种致病指数为０．００;该毒株对６周龄左右鸽有很强的致病性,有的血清中已有一定量的抗鸽ＮＤＶ抗体;经ＳＰＦ鸡胚传１３代的尿囊液病毒对鸽的半数致死量约为１２个ＴＣＩＤ５０。由此认为,ＰＢ９６０１株ＮＤＶ是对鸡致病性很弱但对鸽呈高度致病性的毒株,可作为国内鸽ＮＤＶ强毒的参考株。     

Cloning and Sequence Analysis of Meq Gene of Marek's Disease Virus Guangxi Strain

To investigate genetic variation of Marek's disease virus(MDV) in Guangxi province, three isolates of MDV were isolated from infected chicken.One pair of primers for amplifying Meq gene of MDV was designed according to nucleotide sequence in GenBank, Meq gene of the isolates were amplified by PCR, and then cloned, sequenced and compared with reference MDV strains published in GenBank.The results showed that Meq gene from all of the MDV isolates consisted of 1020 bp, coding for 339 amino acids.Compared with reference strains published in GenBank, the sequences of Meq gene in different isolates were relatively conserved and the homologies of nucleotide and amino acid sequence of the isolates were 83.8% to 99.9% and 88.4% to 99.6%, respectively.The proline-rich repeats of Meq gene of the MDV isolates had site mutations, and it was related to MDV's virulence.The isolate were nearly related to YL and GXY2, and far away from RB1B, GA, Md5, 648A and the immune strain phylogenetically.The study would provide research materials for the prevalence, genetic variation, protection and control of MDV in China.     

鸡马立克氏病病毒广西株Meq基因的克隆与序列分析

为研究鸡马立克氏病病毒(MDV)广西流行株的遗传变异情况,本研究从广西发病鸡中分离鉴定了3株MDV。参照GenBank中MDV的核苷酸序列设计1对引物,利用PCR技术对分离毒株的Meq基因进行了克隆、序列测定,并与GenBank中发表的国内外参考毒株进行比对分析。结果显示, Meq基因序列全长为1020 bp,编码一条由339个氨基酸组成的多肽,分离株与国内外MDV参考毒株相比,不同MDV株的Meq基因序列相对较保守,它们之间核苷酸同源性为83.8%~99.9%,氨基酸同源性为88.4%~99.6%。3株MDV分离株Meq基因在相关报道中提到的与毒力相关的脯氨酸重复区存在点突变。3株分离株与国内参考株YL、GXY2关系较近,与参考株RB1B、GA、Md5、648A及疫苗株亲缘关系较远。该研究为中国MDV的流行、遗传变异及防控研究提供了材料。     

传染性法氏囊病病毒变异株的致病性

传染性法氏囊病病毒变异ＧＣ９０２株可引起１０日龄ＳＰＦ鸡胚肝脏坏死和脾脏明显肿大及较高的死亡率。接种２周龄ＳＰＦ雏鸡,同时设标准Ｉ型强毒ＣＪ８０１株和标准变异株强毒１０８４Ａ株接种对照,该毒株接种后第３天才出现法氏囊粘膜浆膜出血、个别黄化、质硬等病变,且于第４天法氏囊明显萎缩变小,至接种后２０天法氏囊仍严重萎缩;接种后第２天引起脾脏显著肿大,于第１２天时大小恢复正常。试验结果表明,该ＧＣ９０２株对ＳＰＦ雏鸡的致病性与标准变异株基本一致,仅有一定的差异,但明显不同于标准Ｉ型强毒株的致病性。     

不同基因型新城疫病毒株对鹅的致病性

用不同基因型(Ⅳ、Ⅵb、Ⅵg、Ⅶd(坞源)、Ⅶd(鹅源)、Ⅷ、Ⅸ)新城疫病毒(NDV)强毒株分别人工感染23日龄隆昌鹅，观察了其对鹅的致病性。结果：各株病毒均可使接种鹅感染、发病，发病串为10％～100％，死亡率分别为0％、20％、30％、70％、50％、40％、50％。接种Ⅵg、ⅦdI、Ⅶ和Ⅸ型NDV强毒株可使鹅严重发病、死亡，症状和病变都与Ⅶd亚型鹅源毒株感染鹅相似，接种Ⅳ型(Herts／33)及Ⅵb亚型(PB9601)毒株的鹅轻微发病。免疫组化检检测发现，攻毒鹅多种组织器官中都能检测到病毒抗原。在能检测到病毒抗原的器官中，病毒抗原主要定位于淋巴细胞、网状细胞、巨噬细胞、肝细胞及各种上皮细胞的胞浆内；与Ⅵg、ⅦCl、Ⅶ和Ⅸ型NDV感染鹅组织相比，Herts／33、PB9601感染鹅大部分组织内的阳性染色较弱。本试验结果表明，不同基因型NDV强毒株对鹅的致病性存在明显差异。     

不同基因型新城疫病毒强毒株对鸡的致病性

就不同基因型新城疫病毒强毒株对鸡的致病性进行了比较。用3种基因型（Ⅵg、Ⅶd亚型、Ⅸ型）新城疫病毒强毒株分别人工感染25日龄雏鸡，结果各株病毒接种鸡均100％发病、100％死亡，表现出嗜内脏型新城疫病毒感染引起的典型的新城疫症状和病理变化。免疫组化检测发现．攻毒鸡多种组织器官中能检测到病毒抗原，在能检测到病毒抗原的器官中，病毒抗原主要定位于淋巴细胞、网状细胞、巨噬细胞、肝细胞及各种上皮细胞的胞浆内；新城疫病毒对肠相关淋巴组织的亲嗜性优先于附近的上皮。本试验结果表明．基因Ⅵg、Ⅶd亚型、Ⅸ型新城疫病毒强毒株对鸡均具有高度致病性。     

Isolation and Identification of a Field Strain of Marek's Disease Virus and Analysis of Major Pathogenic Genes

In a certain area of Shandong province, Marek's disease (MD) occurred in diseased chickens that had been vaccinated by turkey herpesvirus.In order to isolate the virus strain and detect the virus pathogenicity, agar diffusion test, cell culture and indirect immunofluorescence assay (IFA) were used to isolate the Marek's virus from chicken's blood and feather marrow.The isolated strain was adapted to grow in chick embryo fibroblasts (CEF).Genes involved in pathogenesis of MDV, such as meq, pp38 and 132 bp repeat sequence were amplified by PCR.The obtained sequences were compared with that of standard strains published in GenBank by DNAStar software.The results showed that pp38 gene of the SDAU-1 shared homology from 100% with standard virulent sequence.Analysis of 132 bp repeat sequence and meq gene sequences of the viral genome showed that the isolated virus belongs to the highly virulent MDV strains.     

一株鸡马立克氏病病毒的分离鉴定及主要致病基因分析

山东省某地区鸡马立克氏病疫苗免疫鸡群暴发马立克氏病(MD),为分离得到致病毒株,检测其致病性,采用琼脂扩散试验、细胞培养和间接免疫荧光试验(IFA)等方法从发病鸡的血液及羽髓中分离到一株适应鸡胚成纤维细胞(CEF)生长的马立克氏病病毒。采用PCR方法扩增分离毒株的meq、pp38、132bp重复序列等病毒致病相关基因,所得序列用DNAStar软件与GenBank上登录的参考毒株进行比对分析。结果显示,该分离株SDAU-1的pp38基因与标准强毒序列同源性为100%,132bp重复序列的拷贝数及meq基因的变异均符合MDV强毒株的序列特征。