石斛属部分植物SRAP-PCR反应体系的建立与优化

建立石斛属(Dendrobium)植物SRAP-PCR反应体系,为石斛的品种鉴定与分类提供理论和技术基础.采用单因素及正交试验对反应体系中的各因子进行优化,确定最优退火温度,并筛选有效引物.结果表明:适用于石斛属植物SRAP 最佳的反应体系为:Mg2+2.5 mmol/L,dNTPs 0.25 mmol/L,Taq D...     

甜菜SRAP-PCR反应体系的优化

为了建立适宜甜菜的SRAP反应体系,以40个不同类型的甜菜品系为试验材料,研究了PCR反应体系的主要成分对SRAP扩增结果的影响。对SRAP反应体系中的DNA模板浓度、Taq DNA聚合酶浓度、引物浓度以及dNTP浓度进行了探索,确立了适合甜菜的SRAP反应体系为:在20μL反应体系中,模板DNA为40ng,Taq DNA聚合酶1.0U,引物60ng,dNTP(2.5mmol/L)为1.6μL,扩增程序为94℃预变性3min,反应前5个循环在94℃1min,35℃1min,72℃1min的条件下运行;随后的35个循环复性温度提高到50℃,最后72℃延伸10min。并利用该反应体系对甜菜40个不同品系进行SRAP反应,用6%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,不同品系间DNA谱带多态性丰富,证实该体系稳定可靠,可以用于甜菜的分子标记研究。     

芒果ISSR反应体系的建立与优化

运用L16(45)正交设计对芒果ISSR反应的5个因素,即DNA模板浓度、Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物浓度、Taq DNA聚合酶浓度在4个水平上进行优化试验,通过不同反应体系扩增效果比较,建立优化的芒果ISSR反应体系,即25μL的PCR体系中含有DNA模板25 ng、Mg2+浓度为1.5 mmol/L、dNTPs 0.3 mmol/L、引物0.32μmol/L、Taq DNA聚合酶1.25 U。这为进一步运用ISSR标记在DNA分子水平上对芒果种质资源进行分析奠定基础。     

茶树ISSR-PCR反应体系的建立

通过优化影响茶树 ISSR-PCR 的主要参数,确立了适用于茶树的 ISSR 反应体系和扩增条件。结果表明在 20 μl 反应体系中,模板 DNA、引物、Mg++、dNTP 和 Taq DNA 聚合酶五种主要成分的最适浓度分别为 10ng、150 nmol/L、1.5 mmol/L、150 μmol/L、0.5 U。在扩增过程中,引物的适宜退火温度比其 Tm 值平均高 4.5℃,扩增出足量产物至少需要 30 个热循环。利用该优化反应体系和扩增条件,对 13 份不同茶树种质资源进行ISSR-PCR 扩增,扩增产物的多态性为 77.6%。引物 TRI18 构建的 ISSR 指纹图谱,可以区分 13 份茶树资源中的 12 份,分辨率达 92.3%。     

蓖麻DNA的提取及SRAP反应体系的建立

为建立蓖麻快速有效的DNA提取方法和SRAP标记的技术体系,本研究采用SDS法和CTAB法对蓖麻不同叶片（新鲜嫩叶、老叶和陈旧的嫩叶、老叶）的基因组DNA进行提取,并以DNA模板用量、Mg2+浓度、引物浓度和Taq酶用量4个因素的不同水平配制了10个反应体系对蓖麻SRAP反应体系进行优化。结果表明,SDS法和CTAB法均可获得较高质量的DNA,多数样品的A260/A280值介于1.7～1.9之间,但以CTAB法更为省工省时,不同叶片DNA的提取效果,以嫩叶效果最佳;设计的10个反应体系中,以反应体系A（总体积为15µL,40ng DNA模板,1.5mmol/L Mg2+浓度,0.2mmol/L dNTPs,0.3µmol/L引物浓度和1Unit Taq酶）最为经济适用,将该体系用于蓖麻的SRAP扩增能获得稳定、清晰的多态性条带。本实验为蓖麻的遗传多样性研究及目标性状的分析定位提供了技术支撑。     

荷花ISSR—PCR反应体系的建立及优化

以荷花叶片提取的基因组DNA为材料,通过对影响ISSR—PCR扩增效果的一些因素,如dNTPs浓度、Mg2＋浓度、TαDNA聚合酶用量、引物用量、模板DNA用量以及退火温度等进行筛选和优化,确立了可用于荷花ISSR—PCR分析的最适宜的PCR反应体系：20μL PCR反应体积含O．4mmol·L-1 dNTPs、3．5mmol·L-1Mg2＋、1．5U TαqDNA聚合酶、0．4μmol·μL-1引物、3ng模板DNA。PCR扩增程序为：94℃预变性2min,94oC变性30s,54．5℃退火30s,72℃延伸1min,45个循环,最后72℃延伸7min,置4℃保存。应用该ISSR体系对6份荷花种质进行了扩增,证实了该体系的适用性和稳定性。     

胡椒ISSR反应体系的建立与优化

通过单因子、双因子实验研究了胡椒ISSR-PCR反应体系中热参数和5个主要成分,即退火温度、循环数、变性时间、退火时间、延伸时间以及Mg2+、dNTPS、引物、模板DNA、Taq DNA聚合酶对扩增结果的影响,建立了适合胡椒ISSR分析的反应体系和扩增程序,即在25 μL反应体系中,内含2 mmol/L Mg2+、200 μmol/L dNTPS、1×PCR Buffer、2 μmol/L引物、100 ng模板、1 U Taq DNA聚合酶。扩增程序为94℃预变性3 min, 94℃变性120 s,复性60 s,72℃延伸 3 min,循环35个,结束后72℃延伸7 min。这一优化体系的建立为今后利用ISSR标记技术进行胡椒种质鉴定、遗传多样性分析奠定了基础。     

巨竹ISSR反应体系的建立与优化

以巨竹叶片提取的基因组DNA为材料,用引物UBC810（序列为GAGAGAGAGAGAGAGAT）研究了PCR反应体系的主要成分、退火温度及循环次数对该种植物ISSR扩增结果的影响。结果表明,20μL的反应体系含40ng模板DNA、0．6μmol·L^-1引物,1．0UTaqDNA聚合酶,2．5mmol·L^-1 Mg^2＋,0．25mmol·L^-1dNTPs,1×Buffer。PCR扩增程序为：94℃预变性5min;94℃变性45s,54．5℃复性30S,70℃延伸90S,循环40次;72℃延伸10min,置4c℃保存。     

茶树SRAP反应体系优化及引物筛选

以茶树叶片DNA为模板,采用正交试验设计,以Mg2+、引物、dNTP、TaqDNA聚合酶、模板DNA 5种因素5个水平,对茶树SRAP反应体系进行了研究,建立了茶树SRAP最佳反应体系.结果表明,茶树SRAP最佳反应体系为:Mg+22.0 mmol/L、引物各0.5μmol/L、dNTP 0.1 mmol/L、TaqDNA聚合酶0.5U/μL、模板DNA 4ng/μL,总体积为10μL.运用该体系,从128个SRAP引物组合中筛选出扩增条带清晰、多态性丰富的56个引物组合.这一体系的建立及引物组合的筛选为今后利用SRAP标记技术进行茶树分子遗传学研究提供了理论依据.     

利用正交设计优化甘蔗SRAP-PCR反应体系

利用正交设计L16(45)对甘蔗SRAP-PCR反应体系的五大因素(Mg2+、dNTPs、引物、模板DNA、Taq酶)在4个水平上进行优化,得到如下结论:各因素水平变化对PCR反应的影响从大到小依次是:Mg2+、dNTPs、引物、Taq酶和模板DNA;通过对各因素进行筛选,建立甘蔗SRAP-PCR反应的最佳体系(20μL)为:dNTPs 0.25 mmol/L、引物0.1μmol/L、Mg2+2.5 mmol/L、Taq酶0.25U和模板DNA 60 ng。     

国兰杂交品种(系)SRAP-PCR反应体系优化及引物快速筛选

以国兰杂交品种(系)为材料,采用L16(45)正交试验设计对Taq DNA聚合酶、Mg2+、dNTPs、模板及引物等5个重要影响因素进行优化,确定国兰杂交品种(系)SRAP-PCR反应的最优反应体系为(25μL体系):Taq DNA聚合酶,1 U;Mg2+,1.8 mmol/L;dNTPs,0.08 mmol/L;模板DNA,100 ng;引物,上下游各0.3 mmol/L;10×PCR Buffer,2.5μL。此外,本试验采用DNA混合池技术(DNA pooling)快速筛选SRAP引物,从180对SRAP引物组合中筛选出39对扩增产物丰富、多态性高的引物组合。与常规方法相比,该技术明显缩短试验周期、节约了模板用量,为快速高效筛选SRAP引物提供了新思路。     

红麻 SRAP -PCR 反应体系优化及多态性引物的筛选

采用正交试验L16（43）设计,以dNTP、引物和Taq DNA聚合酶3种因素4个水平,并设置了8个模板DNA浓度梯度。扩增效果表明,红麻的SRAP-PCR最佳反应体系为2μL 10＆#215;Taq Reaction Buffer、20 ng模板DNA、 dNTP 220μmol/L、引物0.35μmol/L、 Taq DNA聚合酶0.5 U,总体积为20μL。同时对256对SRAP引物进行扩增,筛选出条带清晰、多态性较好的引物100对。该反应体系及100对多态性引物组合应用于今后红麻的遗传多样性、品种鉴定、亲缘关系、遗传图谱构建、 QTL定位等研究。     

果园草被残体浸提液对日本草种子发芽与幼苗生长的化感效应

采用生物检测方法,研究果园草被植株残体浸提液处理后的日本草种子萌发和幼苗生长的变化。结果表明：（1）10％浓度浸提液处理果园土壤时,会影响果园杂草的萌发及优势种日本草根冠比;（2）用不同浓度果园草被的植株残体浸提液砂培日本草种子时,都会降低发芽势和发芽率,且竹节草处理的效果最明显,达到差异显著（p<0.05）或极显著水平（p<0.01）;（3）百喜草处理促进日本草幼苗生长,宽叶雀稗处理效果相反;竹节草处理5.0％和10.0％时抑制日本草根生长,而其它处理促进了日本草根生长;（4）不同处理的日本草生物量都不同程度地小于对照,且竹节草处理的效果最明显,达到差异显著或极显著水平;（5）各处理对受体日本草的化感综合效应指数都小于对照,起抑制作用,竹节草处理抑制效果最明显。     

橡胶树MSAP技术体系的优化与建立

通过对酶切反应最少酶用量及选择性扩增体系的优化,建立了橡胶树MSAP最佳反应体系。研究结果表明,500 ng橡胶树叶片基因组DNA,用EcoRⅠ、HpaⅡ和MspⅠ各0.5 U,在37℃酶切4 h,即可完全酶切。优化的选择性扩增体系为:Mg2+1.5 mmol/L、dNTPs 250μmol/L、引物0.15μmol/L、Taq DNA聚合酶1 U;使用该体系,可获得清晰稳定的橡胶树MSAP图谱。     

甜菜SRAP扩增产物两种不同检测方法的比较

为了研究不同电泳及染色方法对甜菜SRAP扩增产物的影响,以6个甜菜二倍体品系为材料,比较变性聚丙烯酰胺凝胶电泳与非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对SRAP-PCR扩增产物用不同银染方法的检测效果进行了比较分析。结果显示:非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳与变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的分辨率差异不大,但非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳具有灌胶简单易学,显色时间短,节省药品等特点,可以作为今后甜菜SRAP电泳及显色的首选方法。     

甜叶菊NaN3离体诱变技术体系的建立

采用NaN3对甜叶菊离体培养的茎段进行诱变处理,通过对各处理下的再生苗进行SRAP检测,建立其离体诱变技术体系。结果显示,较低浓度的NaN3(3 mg/L)诱变处理对再生苗伤害较小,随着诱变浓度的增加(3～7 mg/L),茎段死亡率也逐渐增加;SRAP分子检测发现,再生苗的DNA序列发生了不同程度的多态性变化,最高多态性比率为54.2%(3 mg/L处理20 d)。结果表明,较合适NaN3离体诱变技术体系为3 mg/L处理20 d。     

爱玉子性别与品系的SRAP分析

爱玉子雌、雄异株,其性别以及品系在结果前难以通过枝叶等形态特征进行辨别.作者将序列相关扩增多态性(SRAP)标记应用于爱玉子性别及品系鉴别研究,建立了完整的PCR反应体系,扩增效果好,结果稳定可靠,可重复性强.在153对SRAP引物中,只有引物me_5-em_4在爱玉子雌株上扩增出约220 bp的特异条带,将其命名为FA me_5-em_(14)-220,该标记与雄株没有关联,可作为爱玉子性别鉴别的SRAP标记.从153对引物中筛选出8对多态性好、分辨率高的引物组合,在24个爱玉子雌性品系和16个雄性品系的DNA样品中扩增出171条多态性带,并获得爱玉子雌、雄各品系独特的核酸指纹,其中em_6-me_6引物与me_3-em_2、me_1-em_8、me_2-em_9中的任何一对引物进行组合,都能鉴别24个爱玉子雌性品系;me_3-em_2与me_9-em_(14)2对引物组合也能鉴别24个爱玉子雌性品系;me_1-em_8单独一对引物,以及me_1-em_9与me_3-em_2(或me_6-em_6)2对引物组合能鉴别16个爱玉子雄性品系,并获得2个雄性品系的特异性片段,即片段me_1-em_8-350 bp为大洋57特有,me_1-em_8-240bp为大洋241特有.研究结果对爱玉子种质资源遗传多样性的分析、品种和品系的鉴定、以及种苗质量仲裁检验等具有重要的理论意义和实践价值.