牡丹ACC氧化酶基因的克隆与反义载体的构建

根据报道的牡丹ACC氧化酶基因(DQ337251)cDNA序列,设计一对特异引物,以牡丹品种"洛阳红"基因组DNA为模板,用PCR扩增方法克隆出牡丹ACC氧化酶基因的部分片段,并将其连接到pMD18-T载体上进行测序.结果表明,克隆的序列全长为467 bp,其中包括一个长度为157 bp的序列,推测它可能是一个内含子,其它序列与已报道序列同源性为98.2%;用SacⅠ和XbaⅠ对重组质粒和载体pBI 121酶切、连接,构建牡丹ACC氧化酶基因的反义表达载体.     

CRISPR-Cas9系统敲除甜瓜ACC合成酶基因表达载体的构建

以甜瓜品种"老汉瓜"为试材,采用CRISPR-Cas9基因组编辑技术,研究了构建CRISPR-Cas9系统敲除甜瓜ACC合成酶基因表达载体的方法,以期获得高效的敲除甜瓜基因的基因组编辑技术。结果表明:以甜瓜ACC合成酶的基因设计出引物后,将其构建到pP1C.4载体上,用热激法将连接产物转化到大肠杆菌中,筛选的阳性克隆测序验证为最终载体。     

甜瓜黄瓜性别决定机制模型

首次提出甜瓜和黄瓜的性别由两组四对具有显隐关系的雌性基因与雄性基因互作控制。4个雌性基因的化学实质均为乙烯生物合成途径中的限速酶ACC合酶,4个雄性基因为赤霉素生物合成途径中的某个限速酶。花芽最终发育成雄花、雌花,还是两性花,取决于赤霉素与乙烯之间量的平衡和作用方式。雄花是赤霉素诱导花药生长抑制子房生长发育的,雌花是乙烯诱导子房生长抑制花药生长发育的,两性花是赤霉素和乙烯同步持续诱导子房和花药共同生长发育的．     

节瓜ACC 合酶基因CqACS 的克隆与表达分析

为分析ACC 合酶与节瓜雌性之间的关系，以雌性自交系（A36）和普通雌雄同株自交系（SX）为材料，克隆得 到节瓜ACC 合酶（CqACS）基因，并与葫芦科中已知的ACC 合酶基因进行同源序列比对分析、构建进化树；对A36 幼苗 叶片进行赤霉素（GA3）处理后用qRT-PCR 对CqACS 基因进行表达分析，并统计赤霉素处理前后20 节内的雌花率。结果 表明，CqACS 基因在雌性自交系A36 中的长度为1 318 bp，普通雌雄同株自交系SX 中长度为1 637 bp。经对比分析，SX 比A36 多了91、97、117 bp 3 个片段，除此之外只有2 个碱基的差别。同源序列比对发现，A36 中的CqACS 基因与西瓜中 的Cit-ACS1 基因同源性最高，为95.31%，与黄瓜中的Cs-ACS1 基因同源性为91.13%；SX 中的CqACS 基因与西瓜中Cit- ACS1 基因同源性为78.04%，与黄瓜中的Cs-ACS1 基因同源性为76.06%。GA3 处理后，A36 的平均雌花节率（20 节位内） 为45%，而对照为90%；qRT-PCR 分析发现，与对照相比，CqACS 基因在GA3 处理后的相对表达量显著上调，且在第3 次 处理后4 h 上调最大。     

甜樱桃S基因型PCR鉴定技术研究

绝大部分甜樱桃品种自交不亲和,因此自交不亲和基因型的鉴定对于生产具有重要的意义。以甜樱桃主栽品种为试材,建立基于PCR技术的甜樱桃品种S基因型鉴定技术。试验根据已发表的樱桃S基因序列设计了2对引物组合BFP73/74,BFP93/94,结合S1、S5基因的特异扩增引物,利用扩增片段长度的不同,就可以对樱桃品种的S基因型进行鉴定。通过对已知S基因型品种基因组的扩增,最终建立了基于PCR技术的甜樱桃品种S基因型鉴定技术。     

不同性别黄瓜EIN3基因片段克隆及序列分析

根据GenBank植物EIN3基因家族的保守序列设计了1对引物,以纯雌性系、强雌性系、雌雄同株系、两性花株系的不同性别黄瓜总DNA为模板,经PCR扩增得到6个725 bp左右的基因片段并进行序列比较分析。结果表明,不同性型黄瓜EIN3基因编码区有14个SNPs,平均51 bp发现1个SNP,检出率为1.96 %;其中有3个酶切位点突变,且发现编码区的SNPs有8个突变导致了氨基酸改变;初步建立了1个RFLP-BfmⅠ的酶切体系,发现在两性花株WI1983H中出现特异的酶切条带。     

反义ACO 基因导入获得瓶插寿命长的香石竹植株

 通过农杆菌( Agrobacterium tumefaciens) 介导法, 利用香石竹叶片作外植体, 将反义香石竹ACC 氧化酶基因导入香石竹‘黄星’品种, 通过PCR 扩增、Southern blot 检测, 证明反义ACC 氧化酶基因已整合到香石竹基因组。研究发现, 叶龄、乙酰丁香酮等对转化率有着较大影响。通过叶片的两度选择分化, 大大减少了转化嵌合体比例。转基因植株在隔离条件下栽培, 开花正常, 切花在25 ℃条件下瓶插寿命较对照延长了4 d。     

果实特异启动子调控薄皮甜瓜ACC合成酶cDNA反义表达载体的构建

应用反义RNA技术抑制甜瓜成熟过程中内源乙烯的合成,从而培育耐贮运品种是解决甜瓜延熟保鲜难题的可行新方法。根据GenBank中甜瓜、黄瓜ACC合成酶基因氨基酸保守序列设计引物,从成熟的薄皮甜瓜(齐甜1号)果肉组织中提取总RNA,经RT-PCR扩增得到约0.7kb的ACC合成酶cDNA片段,将其克隆到质粒载体pGEM-TEasy中,测序表明,该基因为777bp,编码258个氨基酸;从番茄(东农706)叶片组织中提取总DNA,经PCR扩增得到约2.2kb的E8基因片段,将其克隆到质粒载体pGEM-TEasy中,测序表明,该基因为2192bp;以pCAM2301为起始植物表达载体,pCAM-GT为中间载体,成功构建了果实特异启动子(E8)调控薄皮甜瓜ACC合成酶cDNA反义表达载体,采用冻融法将其转入根癌农杆菌LBA4404,得到了完整的Ti质粒表达载体系统。     

黄瓜棒孢叶斑病菌PCR检测方法的建立

根据黄瓜棒孢叶斑病菌多主棒孢（Corynespora cassiicola）与棒孢属下女贞棒孢（Corynesporalieustri）、威尔士棒孢（Corynespora cambrensis）和其他常见病原真菌Actin 基因序列差异,设计多主棒孢的特异性引物Caa5F/Caa5R,建立了黄瓜棒孢叶斑病菌的PCR 检测方法,可对引起黄瓜棒孢叶斑病的病原菌扩增出160 bp 的特异性条带,检测灵敏性为4 pg · μL-1 DNA,并可从接种后发病的黄瓜叶片总DNA中检测到特异条带。该引物的PCR 检测方法灵敏性较高,可直接检测植株总DNA,无需病原菌的分离培养,适用于对黄瓜棒孢叶斑病特异快速的检测。     

杏鲍菇漆酶基因DNA片段的克隆及序列分析

参照Genbank中发表的杏鲍菇漆酶基因序列(No.AY686700),并根据真菌漆酶氨基酸序列保守区设计特异性引物。以杏鲍菇基因组DNA为模板,PCR扩增出长2 606 bp的漆酶基因片段,DNA经纯化后克隆到pGM-T载体上,经筛选、PCR鉴定和序列分析,证明该片段为完整的杏鲍菇漆酶基因(Genbank注册号KC789846)。通过对基因序列的内含子/外显子进行预测分析,获得漆酶编码区的cDNA,该基因的开放阅读框由1 596个核苷酸组成,编码一个由531个氨基酸组成的多肽,分子量大小约为56 682.0,等电点pI为4.56;比对结果发现该基因氨基酸序列与其他真菌漆酶的同源性最高达93%;进一步对X22-12漆酶二级结构进行分析,并通过SWISS-MODEL预测了该酶的三维结构。     

不同基因型黄瓜性别与乙烯释放速率的关系

采用气相色谱法测定全雄株(ffMMaa)、雌雄同株(ffMMAA)、全雌株(FFMMaa、FFMMAA)和两性花株(FFmmAA)不同基因型近等基因系材料间的乙烯释放速率,探讨乙烯与黄瓜性型的关系。结果表明,不同近等基因系乙烯释放速率之间存在显著性差异。全雄株78♂(ffMMaa)的乙烯释放速率较低;雌雄同株406(ffMMAA)四叶一心期的乙烯释放速率大于两叶一心期;含6.33个F基因拷贝数的雌性系10098♀(FFMMaa)与F基因拷贝数为2.15的雌性系WI1983G(FFMMAA)相比,乙烯释放速率较低;雌性系WI1983G(FFMMAA)的乙烯释放速率极显著高于两性花株WI1983H(FFmmAA),两性花株WI1983H又极显著高于雌雄同株WI1983GM(ffMMAA);说明黄瓜性别表型与内源乙烯密切相关。从试验结果推断:雄株(ffMMaa)中乙烯释放速率低可能与A基因失活相关,雌性系(FFMMaa)乙烯释放速率可能受A/a基因的调控,两性花株(FFmmAA)中虽然M基因失活但内源乙烯释放速率并未降低很多,可能F基因产生的内源乙烯没有直接作用到两性花的雄蕊上。     

黄瓜MADS-box基因家族生物信息学分析及CsMADS-box AGL62的克隆

分别以全雌系D1104-2-4、强雌系D1158♀-2、雌雄异花同株D0528-2为母本,与1个雌雄异花同株父本D0708-2杂交获得杂种一代,调查开花初期、根瓜期、盛果期3个时期雌性相关农艺性状,筛选出差异显著的组合进行转录组测序分析进而分析黄瓜杂交组合间MADS-box家族的差异基因。结果表明:以全雌系D1104-2-4为母本的杂种一代C15-114在雌花数、雌花节率上均具有超亲优势,3个杂交组合F1均具有早熟的中亲优势。转录组分析结果发现,以全雌系D1104-2-4为母本的杂种一代基因表达情况显著的偏向母本,挑选的37个黄瓜MADS-box家族基因只有6个与母本有表达差异,17个与父本有表达差异。生物信息学分析并命名了1个差异最显著的基因Cs MADS-box AGL62,该基因全长745 bp,编码187个氨基酸,编码的蛋白属于线粒体中不稳定的亲水性跨膜蛋白,NCBI比对结果表明该蛋白是1个转录因子,系统进化分析发现其与甜瓜中AGL62同源性最高,在黄瓜中该蛋白和其他黄瓜AGL62亚型属于同一分支并且属于I型。     

两个新发现的黄瓜性别决定基因遗传规律的研究

 选取黄瓜两个雌雄同株型的强雌性高代自交系材料与普通雌雄同株、两性花株、纯雌株高代自交系材料杂交, 通过对F₁、F₂、BC₁ -1 和BC₁ -2 代性型观察, 统计分析表明: 雌雄同株型的强雌性由1对不完全显性和1对隐性基因控制, 暂定名为Mod-F₁和mod-F₂, 它们是新发现的黄瓜性别表达的两个基因, 能增强黄瓜植株雌性的表达, 与F和M 基因独立遗传。     

Genetics and molecular mapping of gynoecious (F) locus in cucumber (Cucumis sativus L.)

Gynoecious is an important economic trait of cucumber for determinant of earliness and yield, yet genetic mechanism is not well understood for this trait. The experiment was conducted using F₂ mapping population by crossing of PPC-2, a gynoecious and parthenocarpic line with Pusa Uday (monoecious and non-parthenocarpic cultivar). Out of 179 SSR markers screened, 39 markers differentiated the gynoecious and monoecious parents. However, only 17 markers were segregating with F₂ mapping population, those were used for genotyping and linkage map analysis and these markers were placed along with F locus on chromosome 6 covering a total distance of 100.4cM. The SSR markers, SSR13251 and UW020605 were found to be closely linked to gynoecious (F) locus at 1.0 and 4.5 cM, respectively. The segregation of F₂ population of PPC-2 × Pusa Uday and GPC-1 × Punjab Naveen and test crosses for sex type herein suggested that single dominant gene controlled the gynoecious sex expression in cucumber particularly in gynoecious genotypes PPC-2 and GPC-1. Therefore, the monogenic dominant nature of gynoecious sex identified in the present experiment and SSR markers closely linked to the F locus will be useful in marker-assisted backcross breeding for transfering gynoecious trait into horticulturally desirable varieties.     

Sex inheritance and development of gynoecious hybrids in bitter gourd (Momordica charantia L.)

Gynoecism has been used on a large scale in heterosis breeding of cucumber. Production of hybrid seeds in bitter gourd is highly expensive because it is done mainly through hand pollination. But utilization of a gynoecious line would be more economical and easier method. Since gynoecious parent has only female flowers, the open pollinated seeds it produces will be F₁ hybrid. It will reduce the cost of male flower pinching and hand pollination. Two gynoecious lines, DBGY-201 and DBGY-202 were crossed with two monoecious cultivars, “Pusa Do Mausami” and “Pusa Vishesh” and their F₂ populations were observed to determine the inheritance pattern of gynoecious sex form. Another experiment was conducted to determine magnitude of heterosis by utilizing nine inbred lines including one gynoecious line, DBGY-201 in diallel (without reciprocal) mating system. All the gynoecious hybrids showed significant heterosis in a desirable direction for traits like sex ratio (male:female), days to first picking, number of fruits per plant, yield per plant, and vine length. The segregation pattern in F₂ suggested that gynoecious sex form in bitter gourd was governed by single recessive gene. The gynoecious hybrids DBGY-201 × “Pusa Vishesh” and DBGY-201 × “Pusa Do Mausami” were important for early harvest (～50 days after sowing) whereas DBGY-201 × “Priya” and DBGY-201 × “Arka Harit” were promising for higher yield.     

黄瓜全雌性基因连锁的AFLP和SCAR分子标记

 本研究以全雌品种‘戴多星’自交系和弱雌品种‘北京截头’自交系为双亲杂交获得F₁ ,然后得到F₂ 性型分离群体, 利用分离群体分组分析法(Bulked Segregant Analysis, BSA) 构建全雌和弱雌两个基因池, 筛选了64对AFLP选择性引物EcoR I-NN +Mse I-NNN组合, 发现EcoR I-TG +Mse I-CAC引物组合在全雌基因池中扩增出一条分子量为234 bp的特异带。经F₂ 代单株验证, 该特异条带能在全雌单株中稳定出现。以MAP MAKER (Version 310) 软件分析, 该标记与全雌性位点的连锁距离在617 cM。命名该连锁标记为TG/CAC₂₃₄。将该特异条带回收、克隆、测序, 设计特异SCAR引物, 再对F₂ 代单株基因组DNA进行扩增, 仅在全雌单株中扩增出1条分子量为166 bp 的特异带, 表明已成功地将与黄瓜全雌性连锁的AFLP标记转化为操作简便、表现稳定的SCAR标记, 该标记命名为SA₁₆₆。     

全雌黄瓜单性结实性遗传分析

 采用植物数量性状主基因+多基因混合遗传模型对黄瓜强单性结实雌性系‘6401’ 与非单性结实自交系‘6429’、‘6426’杂交组合多世代群体的单性结实性进行联合分析,结果表明：全雌黄瓜单性结实性在不同遗传背景下遗传表现基本一致,单性结实性遗传均表现为不完全隐性基因遗传,符合E-1-1模型,受2对加性-显性-上位性主基因+加性-显性多基因控制。两组合第1主基因显性效应、主基因显性×显性互作效应以及多基因效应较大。‘6401×6429’组合的B₁、B₂、F₂群体（主基因+多基因）遗传率分别为51.36%、72.31%和76.78%;‘6401×6426’组合的B₁、B₂、F₂群体（主基因+多基因）遗传率分别为20.50%、75.39%和74.58%。强单性结实全雌黄瓜品种选育以双亲均为强单性结实为宜。     

甜瓜花器官发育相关基因的电子克隆及表达分析

以厚皮甜瓜（Cucumis melo）‘WI998’（纯雌系）与‘TopMark’（雄全同株）配制杂交组合获得的RIL₆群体为材料,对分离后代雌雄异花同株,雄全同株,完全花植株及纯雌株进行转录组测序,利用生物信息学分析方法,获得花器官发育相关基因序列Un16008,命名为CmTs2。该序列位于甜瓜第12条染色体上,长度1 842 bp,119 ~ 832之间存在一个包含237个氨基酸的最大开放式阅读框,成熟蛋白分子量为25 358.8 D,该蛋白不稳定系数为21.6,脂肪系数是99.11,平均亲水系数为0.078。通过Blast比对发现该基因与多种作物Tasselseeds2（TS2）基因具有高度同源性,其中与黄瓜Tasselseeds2基因同源性高达96%。通过实时荧光定量PCR检测,发现该基因在甜瓜雌雄异花同株花和叶片中表达量均高于其它性别类型植株,在纯雌株中表达量最低,说明该基因可能参与甜瓜花器官发育,尤其是雌花发育的过程。     

黄瓜果皮光泽性状的遗传分析及基因定位研究

 以黄瓜（Cucumis sativus L.）果皮有光泽自交系‘1101’（P1）为母本,以3 个无光泽自交 系‘1116’（P2）、‘9930’（P3）、‘1107’（P4）为父本,分别构建6 世代遗传群体,对黄瓜果皮光泽性状 进行遗传规律分析和基因定位研究。结果表明,黄瓜果皮有光泽性状由显性单基因G 控制,有光泽对无 光泽为显性。利用‘1101’ב1116’的F2 群体,结合分离群体分组分析法（bulked segregate analysis, BSA）筛选得到了30 对与黄瓜果皮有光泽基因G 相关的SSR 标记,将该基因定位到黄瓜第5 染色体上, 侧翼标记为CS28 和SSR15818,遗传距离分别为2.0 cM 和6.4 cM。两侧翼标记之间的物理距离为454 kb, 在该区域中共预测了177 个候选基因。     

与黄瓜M基因连锁的三个共显性标记

 利用黄瓜近等基因系纯雌株WI1983G（基因型为FFMM）与两性花株WI1983H（基因型为FFMM）为亲本，以WI1983H为回交亲本构建了BC₁代分离群体，采用SSR及SCAR分子标记技术，获得了3个与M基因紧密连锁的标记SSR23487、SCAR123和SSR19914，它们与M基因的遗传距离分别为0.28 cM、0.94 cM和3.20 cM，两侧标记SSR23487和SCAR123将M基因定位在1.22 cM的遗传区间内。这3个分子标记的获得不仅可以用于分子标记辅助选择育种，而且为最终M基因的克隆打下了基础。