O型口蹄疫病毒VP1基因的克隆与表达

以O型口蹄疫病毒(FMDV)流行毒株为研究对象,通过RT-PCR扩增出VP1基因,克隆至表达载体pET-32a中,分析比较不同地区O型口蹄疫病毒VP1基因序列,为构建VP1重组基因工程苗奠定基础．经测序表明,目的基因VP1已以正确的阅读框架整合至表达质粒中,应用大肠杆菌BL21(DE3)为宿主菌,通过IPTG诱导方法,表达包含VP1基因产物的融合蛋白,经SDS-PAGE和Western—blotting分析,表明表达蛋白表达量高,反应原性良好．     

大肠杆菌O157:H7 eaeA基因的原核表达

将含广东分离株大肠杆菌O157: H7 021210 eaeA基因的克隆质粒双酶切后,亚克隆至原核表达载体pET-28a( ),经PCR鉴定、酶切鉴定及核苷酸序列测定,正确构建了原核重组表达质粒pET-eaeA.再将该重组质粒转化E.coli BL21 (DE3) pLysS, 经IPTG诱导, 进行SDS-PAGE,结果显示,目的蛋白的相对分子质量约为94 000,与 eaeA基因蛋白的理论值相符.破菌后电泳证实目的蛋白主要以包涵体形式存在.表达蛋白经初步纯化,3次免疫新西兰兔,获得抗 eaeA蛋白的多克隆血清.经琼脂扩散试验和Western-blotting试验,表明该蛋白具有较好的免疫原性和反应原性.     

柔嫩艾美耳球虫A08基因的阶段表达分析与毕赤酵母表达系统构建

对A08蛋白基因在柔嫩艾美耳球虫不同发育阶段(未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子和裂殖子)的转录情况进行分析,同时以A08蛋白cDNA为模板扩增出1 083 bp的目的基因片段,将该基因连接到pGEM-T-easy载体上,经序列测定和双酶切鉴定表明为A08基因.用EcoRI和NotI酶切回收目的片段连接至用同样酶切的真核表达载体pPIC9k上,构建了重组质粒pPIC9k-A08,转化大肠杆菌TOP10后,提取质粒,经酶切鉴定正确后用SacI将重组质粒线性化,再电转入毕赤酵母GS115菌株,G418筛选抗性重组子,经PCR鉴定正确重组子后做甲醇诱导表达.RT-PCR结果显示该基因在子孢子阶段的转录拷贝数显著高于其他发育阶段,是一个子孢子高表达基因.重组酵母诱导表达产物经SDS-PAGE检测证实,柔嫩艾美耳球虫A08基因在毕赤酵母中获得表达.Western-blot初步分析表明,表达产物具有免疫学反应活性.     

重组NDV HN基因乳酸菌穿梭表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达

为构建新城疫病毒乳酸菌穿梭表达载体,采用RT-PCR方法从新城疫病毒中扩增了HN基因,将其克隆到pMD18-T Simple Vector中.经测序鉴定正确后,定向克隆至乳酸菌表达载体pW425et中,并转化入表达宿主菌BL21 (DE3),利用IPTG诱导表达.采用SDS-PAGE和Western blotting检测重组菌在大肠杆菌中的表达情况.结果表明:NDVHN基因与表达载体pW425et正确重组,且该重组菌传50代次以上,重组质粒依然稳定.SDS-PAGE显示表达出约63 kD的条带,与已知表达的HN蛋白大小相符.Western blotting进一步证实该蛋白能被NDV阳性抗体所识别,具有反应原性.表明构建了重组NDVHN基因乳酸菌穿梭表达载体.     

人TIMMDC1基因在杆状病毒系统中的表达

旨在杆状病毒系统中表达TIMMDC1/c3orf1(Translocase of inner mitochondrial membrane domain containing l)基因,为其应用和功能研究奠定基础.将TIMMDC1基因克隆至重组杆状病毒表达系统的载体中,构建重组穿梭质粒,转染Bm-N细胞,Western blotting验证蛋白的表达.结果表明,重组克隆质粒pFastBac 1-GFP-TIMMDC1的两两酶切结果证实重组克隆质粒构建正确.PCR结果显示重组穿梭质粒Bacmid pFastBac1+ TIMMDC1+GFP可扩增出目的条带.Bm-N-rBacTIMMDC1的表达产物经Westem blotting分析,分别可见相对分子质量57kD的特异蛋白条带,表明融合蛋白TIMMDC1 +GFP在家蚕Bm细胞中成功的进行了表达.本研究成功在杆状病毒表达系统中表达了TIMMDC1基因,为其临床应用和功能研究奠定了基础.     

绵羊肺炎支原体热休克蛋白Hsp70 C末端基因原核表达

为研究绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,Mo)热休克蛋白Hsp70抗原特性,以Mo贵州分离株为模板扩增得到Hsp70蛋白C末端基因,将目的基因连接至pET-28a原核表达载体,经PCR、双酶切和序列测定正确的阳性重组质粒转化E.coli Rosseta表达菌,IPTG诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE及Western blotting分析。结果显示,经PCR从Mo贵州分离株扩增获得567bp的C末端片段,并成功构建含Mo Hsp70蛋白C末端基因的原核表达质粒,经IPTG诱导表达获得分子质量约为27ku的目的蛋白,且目的蛋白能与Mo阳性血清印迹反应。说明,成功构建可有效表达Mo贵州分离株Hsp70蛋白C末端基因的原核表达载体。     

小鼠锰超氧化物歧化酶在大肠杆菌中的表达和纯化

为构建小鼠锰超氧化物歧化酶(SOD)的原核表达载体,在大肠杆菌中进行蛋白表达、纯化和功能检测,以小鼠肝脏cDNA为模板,利用PCR方法克隆小鼠锰SOD基因,PCR扩增了1个长600bp左右的基因片段,该片段编码由198个氨基酸组成的成熟的小鼠锰SOD蛋白.将其插入pET15b载体中,经测序鉴定正确后,将重组质粒转化大肠杆菌Rosetta-gami.含有pET15b-mMn-SOD质粒的工程菌经过IPTG诱导能表达出相对分子质量约25000的目的蛋白,超声破碎菌体,经Ni-NTA纯化后得到纯度约为95%的重组mMn-SOD蛋白.SOD活性检测表明经过诱导表达的mMn-SOD比活力为531.7U/mg.     

猪瘟病毒Npro基因的克隆表达

 为了得到一个表达Npro蛋白的真核表达载体,从而为下一步研究不同时间段细胞主要组织相容性复合体（MHC）表达的变化情况,从分子水平上说明Npro与MHC之间的关系,本研究应用反转录聚合酶链式反应（RT PCR）技术对猪瘟病毒石门毒株Npro基因进行了克隆和测序,结果得到了长度为592bp的目的片段。用BamHⅠ和XhoⅠ限制性内切酶分别对重组克隆质粒和转移载体pcDNA30进行双酶切,回收目的基因DNA片段,将目的基因Npro亚克隆至真核转移载体pcDNA30中,经双酶切和序列测定鉴定插入基因和连接方向正确,得到含完整Npro基因的重组载体质粒P Npro。构建成功的真核表达载体以脂质体介导的转染方法将此重组载体质粒转染PK 15细胞,转染24和48h后检测表达情况。经Western blot方法检测表明,此Npro蛋白在PK 15细胞中正确表达。     

番鸭源禽1型副黏病毒HN基因主要抗原结构域和V基因融合表达载体的构建

为构建番鸭源禽1型副黏病毒HN主要抗原结构域(HNd)和V基因融合表达载体,经PCR及融合PCR分别从重组质粒pMDHN和pMDP中扩增HN基因主要结构域和V基因cDNA.将HNd经KpnⅠ和BamHⅠ双酶切、V基因用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后,分别定向插入真核载体pcDNA3的多克隆位点相应的酶切位点中,对2个单表达质粒pcDNAHNd和pcDNAV进行酶切和测序鉴定.利用融合PCR技术扩增出HNd-V基因,定向克隆至pcDNA3的EcoRⅠ和XhoⅠ酶切酶切位点之间,转化感受态细胞后,经PCR反应初筛后,对阳性克隆进行酶切分析及测序鉴定.对单表达重组质粒进行酶切分析及测序鉴定,结果表明:HNd和V基因已被正确定向克隆至真核表达载体peDNA3,成功构建了2个基因的单表达质粒pcDNAHNd和pcDNAV;对融合重组质粒酶切分析和测序鉴定表明,HNd-V融合基因正确克隆进真核表达质粒pcDNA3中,成功构建了融合表达载体pcDNAHNd-V.     

新孢子虫NcGRA2基因真核表达质粒的构建及其在293细胞内的表达

[目的]为了构建新孢子虫NcGRA2基因的真核表达载体,探讨重组载体在体外细胞的表达.[方法]从含有NcGRA2基因的重组质粒pGEX-4T1-NcGRA2中,用限制性内切酶进行酶切获得带有粘性末端的NcGRA2基因片段.经琼脂糖凝胶电泳切胶回收NcGRA2基因片段,与pcDNA3.1载体连接.将构建的真核表达质粒pcDNA3.1-NcGRA2转染到293细胞中表达.[结果]经酶切分析和序列测定,证实了重组质粒的正确连接.经免疫荧光抗体试验验证pcDNA3.1-NcGRA2能在293细胞中表达NcGRA2蛋白.[结论]获得重组质粒pcDNA3.1-NcGRA2,并能在体外细胞中表达NcGRA2蛋白,为进一步研究核酸疫苗的动物免疫试验奠定了基础.     

Virus Location and Lymphocyte Apoptosis in Lymph Nodes of Piglets Infected with PCV-2

The present study has been performed to understand the location of the virus, type of apoptotic cells, and their relation to lymph nodes of piglets infected with porcine circovirus type Ⅱ （PCV-2）. Nine 32-day-old conventional piglets free of infection with PCV-2 were used, and distributed into three groups： control group （n = 3）, piglets inoculated with PCV-2 alone （PCV-2, n = 3）, and PCV-2 inoculated and KLH immunostimulated group （PCV-2 ＋ KLH, n = 3）. Superficial inguinal lymph nodes from all piglets were collected for histological examination after 32 days postinoculation, and immunohistochemistry for PCV-2 detection. Location of apoptotic cells was detected with TdT-mediated dUTP nick end labeling （TUNEL） and cell cycle, and the apoptotic rates were measured by flow cytometry. The characteristic histopathological lesions of the piglets in PCV-2 and PCV-2 ＋ KLH were lymphocyte depletions in the cortex and paracortex of the lymph nodes, epithelioid-like macrophage infiltration, and intracytoplasmic inclusion bodies presented in epithelioid-like macrophages. PCV-2 was mainly found in epithelioid-like macrophages by immunohistochemistry. In the lymph nodes, lymphocytes presented higher apoptotic rates in the cortex by TUNEL, special B-cell areas, and similar apoptotic cells were found in this compartment in the control. The apoptotic rates of the lymph nodes were 0.41, 3.34, and 4.88% in the control, PCV-2, and PCV-2 ＋ KLH groups by flow cytometry, respectively. The apoptotic rates of lymph nodes for PCV-2 and PCV-2 ＋ KLH piglets were significantly higher than those for the control group （P〈0.05 and P〈0.01）. The proliferation index （PI） was 0.17_＋0.01, 0.12_＋0.01 and 0.12_＋0.04 in the control, PCV-2, and PCV-2 ＋ KLH group, the PI of the control group was higher than that of the other groups, but without the statistical difference. PCV-2 can induce lymphocyte depletion in lymph nodes of piglets by blocking cell proliferation and promoting apoptosis. This is one o     

不同温度LED光萎凋对铁观音MEP上游关键基因和香气的影响

【目的】萜类化合物是乌龙茶挥发性芳香物质的重要组分,2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸途径（MEP）上游关键基因直接参与调控萜类化合物前体物质的合成。而乌龙茶香气的形成与萎凋工序密切相关,光照和温度是影响萎凋的重要因子,探讨LED光与温度在乌龙茶萎凋过程中对香气的影响,为提高乌龙茶萎凋叶香气品质提供参考。【方法】基于转录组数据,根据KEGG筛选出响应光照的MEP上游关键基因（DXS、DXR、HDS、HDR）。对一芽三叶铁观音鲜叶进行LED白光和不同温度（20℃（L20）、25℃（L25）、30℃（L30）、35℃（L35）和40℃（L40））萎凋处理,黑暗下温度（20℃（D20）、25℃（D25）、30℃（D30）、35℃（D35）和40℃（D40））萎凋处理;分别测定铁观音萎凋叶的香气组分和MEP上游关键基因的相对表达量。【结果】L30处理萎凋叶各基因表达量达到最大值,萜类基因（DXS、DXR、HDS、HDR）表达量分别为XY组（对照）的4.31、5.28、11.77、1.59倍,为D30处理的2.24、2.39、1.86和1.60倍。D30组各基因表达量为黑暗处理组最大,依次为XY组的1.92、2.21、6.34和0.99倍。L20处理萎凋叶的α-法呢烯芳樟醇氧化物（I、II）含量最高,较XY依次提高了15.05%、4.92%和15.13%;L30处理萎凋叶的橙花叔醇、芳樟醇和香叶醇含量最高,较XY组依次提高了3.71%、6.14%和15.28%;LED组铁观音萎凋叶主要香气组分含量均高于相对应的温度处理组。通过主成分分析法建立数学模型,对萎凋叶香气组分进行评估,得出L20组萎凋叶得分最高,L30组萎凋叶次之;与香气分析得出结果一致。【结论】铁观音萎凋叶基因表达量与香气含量的变化趋势不存在同步性;L30处理萎凋叶基因表达量、主要萜类香气物质含量和主成分分析得分均较高,这与铁观音生产上的萎凋温度相一致。萎凋温度过高（40℃）不利于萎凋叶萜类关键基因的表达和萜类化合物的形成。     

丙草胺与4种磺酰脲类除草剂混用对稻苗安全性的影响

室内测定了丙草胺分别与磺酰脲类除草剂甲磺隆、苄嘧磺隆、醚磺隆和吡嘧磺隆混用后，一叶一心期稻苗抑制50％株高的使用浓度(IC50)和抑制10％株高的使用浓度(IC50)，并用共害系数(CHC)对混用组合安全性的联合作用进行了评价．结果表明：所有混配处理的CHC10均小于12．0，表现出强烈的解毒效应；不同混用处理的CHC50值差异很大，丙草胺与甲磺隆混用的CHC50均小于25．0，解毒效应显著．丙草胺与苄嘧磺隆混配的CHC50为26．1—167．8，丙草胺与苄嘧磺隆混用的CHC50为52.2—115.5，丙草胺与醚磺隆混用的CHC50为80．0—110．2．     

不同阶段肉仔鸡能量需要模型的建立

试验研究了0~8周龄肉仔鸡胴体与羽毛蛋白、脂肪的生长曲线及0~3、4~6和7~8周龄3个阶段每日摄入不同水平的能量及蛋白对其体蛋白、体脂肪沉积的影响,旨在确定胴体与羽毛蛋白、脂肪动态的沉积规律及日粮能量沉积为体蛋白及体脂肪的效率。试验1,包括3个饲养试验分别选取体重相近的0、21和42日龄爱拔益加(AA)肉仔鸡324只,按性别及日粮随机分为18个处理,每处理3个重复,每重复6只鸡。肉仔鸡每日限量饲喂,饲喂水平分别为正常采食量的90%、70%和50%,每日定量供给肉仔鸡高、中、低3个水平的高蛋白质基础日粮及由饲喂水平决定的定量淀粉,进而使肉仔鸡每日采食能蛋质量比(代谢能/粗蛋白)不同的9种日粮;试验2,选取体重相近的0日龄AA肉仔鸡144只,按性别不同随机分为2个处理,每处理4个重复,每重复18只鸡。试验初和试验末分别进行屠宰,以测定肉仔鸡胴体和羽毛蛋白、脂肪和干物质含量。结果显示:1)Gompertz方程能很好的拟合不同性别肉仔鸡蛋白和脂肪的生长,不同性别间蛋白和脂肪极限重量、羽毛蛋白和脂肪的生长速率差异显著(P<0.05),而胴体蛋白和脂肪的生长速率差异不显著(P>0.05)。2)在0~3、4~6和7~8周...     

ICP-OES法同时测定果蔬中铅、砷、镉、铬、铜、锡含量

果蔬样品经混酸消化后,控制一定的酸度,定容后应用等离子体发射光谱法(ICP-OES)对果蔬中铅、砷、镉、铬、铜、锡六种有害重金属进行测定,研究了分析测定条件,方法简单快速。测定结果表明,五种元素的加标平均回收率在91.0%~107%之间。其RSD均小于3.5%。按该方法进行处理及测定铅、砷、镉、铬、铜、锡,在选择的测定条件下最低检出限分别为0.0006 mg/kg、0.0003 mg/kg、0.00003 mg/kg、0.00005 mg/kg、0.00003 mg/kg、0.0006 mg/kg。     

夹竹桃目植物新资料

本文根据国内外模式标本和文献资料,将亚洲、美洲和大洋洲夹竹桃目植物进行了部分整理和研究,对该目夹竹桃科和萝摩科18属37种作了订正,其中有11种分布新记录,17个新异名,建立15个新名称和1个新组合.     

氮、磷、钾、硼肥施用对甘蓝型杂交油菜产量及经济效益的影响

 【目的】指导当前生产条件下江西油菜测土配方施肥技术的推广。【方法】2008—2009年在江西省设置12个田间试验,研究氮、磷、钾和硼肥施用对甘蓝型杂交油菜产量及其相关性状的影响,并对施肥经济效益进行分析。【结果】氮磷钾硼肥配施处理(NPKB)平均产量为2 015 kg?hm-2,与不施肥相比,NPKB、缺B(NPK)、缺P(NKB)、缺K(NPB)和缺N(PKB)分别增产1 121、839、758、746和249 kg?hm-2;NPKB配施处理下各主要经济性状表现较好,有利于对N、P、K、B素的吸收利用;效益分析表明,NPKB配施效益达到5 449.5元/hm2,比不施肥增收2 231.1元/hm2,其次是缺B(NPK)、缺P(NKB)、缺K(NPB),分别比不施肥增收1 298.4、1 280.7和1 541.1元/hm2,而不施氮肥的处理减收206.1元/hm2。【结论】NPKB配施对甘蓝型杂交油菜增产、增收效果显著,是保证高效生产的技术关键。     

锌对不同基因型玉米产量及氮磷钾锌吸收与分配的影响

[目的]研究锌对不同基因型五米产量及氮磷钾锌吸收与分配的影响。[方法]以四单19和牡丹9 2种不同基因型玉米为材料,以EDTA-Zn为锌肥料,采用盆栽方法研究锌对不同基因型玉米产量及氮磷钾锌吸收与分配的影响。[结果]适量供锌可以提高玉米的穗粒数;在低锌处理下（Zn0、Zn1）各器官锌含量相差较小,随着施锌水平的提高,锌在叶片、茎秆、叶鞘中含量迅速增加,而在子粒和苞叶中增加幅度较小;玉米吸收的多余的锌主要集中在下部器官,以减轻过量的锌对植株造成的伤害。不同的供锌水平对低锌不敏感品种牡丹9氮、磷、钾的吸收与转运影响较小;相对而言,低锌敏感品种四单19氮、磷、钾的吸收与转运更易受到外界供锌量的影响。[结论]适量供锌可以提高玉米产量和对氮、钾的利用率降,低磷的吸收和利用。     

中国屏腹茧蜂属订正附二新种记述（膜翅目：茧蜂科：屏腹茧蜂亚科）

屏腹茧蜂属ｓｉｇａｌｐｈｕｓＬａｔｒｅｉｌｌｅ是茧蜂科中的一个小属，种类稀少，标本不易采到。本文对该属的中国种类作了订正研究。中国过去虽已记述过４种，但现经研究发现，其中Ｓ．ａｎｏｍｉｓＹｏｕｅｔＺｈｏｕ，１９９１和Ｓ．ｎｌｇｒｉｐｅｓＨｅｅｔＣｈｅｎ，１９９３均为Ｓ．ｈｕｎａｕｎｓＹｏｕｅｔＴｏｎｇ，１９９１的同物异名，因此，实存２种；本文另添２个新种：Ｓ．ｇｙｒｏｄｏｎｔｕｓＨｅｅｔＣｈｅｎ，ｓｐ．ｎｏｖ．和Ｓ．ｒｕｆｉａｂｄｏｍｉｎａｌｉｓＨｅｅｔＣｈｅｎ，ｓｐ．ｎｏｖ．所以，目前本属的中国种类共有４种。另外，Ｓ．ｈｕｎａｎｕｓＹｏｕｅｔＴｏｎｇ和Ｓ．ｇｙｒｏｄｏｎｔｕｓＨｅｅｔＣｈｅｎ，ｓｐ．ｎｏｖ．为本属在东洋区的首次记录。     

不同授粉组合对‘富士’和‘新红星’苹果品质的影响

【目的】探讨不同授粉品种对苹果品质和香气物质成分差异的影响,为高效授粉树的选育和苹果品质的提高提供依据。【方法】采用自育高效授粉树‘红菱’‘红锦’‘红雾’的花粉,在‘富士’(Malus domestica‘Fuji’)、‘新红星’(M.domestica‘Starkrimson’)铃铛花期进行授粉,以授‘嘎拉’(M.domestica‘Gala’)花粉的果实为对照,对果实发育期间总类黄酮含量的变化进行研究,并在果实成熟时测定可溶性固形物、花色苷含量等品质指标及香气物质成分。【结果】不同的授粉品种条件下,‘富士’和‘新红星’苹果除可滴定酸外的各项品质指标均高于对照。‘富士’苹果经‘红菱’授粉后,其果形指数、硬度、花色苷、可溶性糖含量显著提高,分别为对照的1.12、1.15、1.28、1.12倍。‘新红星’苹果经‘红雾’授粉后,其单果重、果形指数、花色苷、可溶性固形物、可溶性糖含量均显著提高,分别为对照的1.22、1.12、2.48、1.10、1.11倍,其可滴定酸含量显著降低,仅为对照的75%。在果实发育的整个生长期内,不同授粉品种处理的‘富士’和‘新红星’苹果总类黄酮含量均高于对照,且不同品种间存在显著差异。在花后160 d,‘富士’经‘红菱’‘红锦’‘红雾’花粉授粉后,果实内总类黄酮含量与对照相比分别增长19.63%、28.72%、13.97%,‘新红星’在花后120 d分别增长14.18%、15.26%、4.24%,差异显著。‘红菱’‘红雾’‘红锦’和对照授粉处理的‘富士’和‘新红星’苹果总酯类挥发性物质的相对含量分别为50.20%、52.03%、42.68%、45.10%和71.08%、68.85%、71.83%、66.03%,‘红菱’授粉后‘富士’‘新红星’果实总酯类挥发性物质含量明显增加,其中2-甲基丁酸乙酯的含量分别为对照的1.14和203.91倍。‘富士’苹果中,‘红菱’‘红雾’‘红锦’授粉处理的果实乙酸-2-甲基丁酯的含量分别为对照的1.73、1.07、1.36倍;其己酸乙酯和乙酸丁酯的含量分别为对照的1.09、1.12、1.29倍和1.50、0.77、1.30倍。而在‘新红星’苹果中,经‘红菱’‘红雾’‘红锦’授粉后,乙酸-2-甲基丁酯和己酸乙酯的含量分别为对照的1.82、1.27、0.93倍和2.57、1.15、0.27倍;乙酸丁酯的含量分别为对照的7.83、3.48、3.30倍。此外,‘富士’和‘新红星’苹果经‘红菱’授粉后,其烃类物质含量明显高于对照,主要表现为法呢烯的增多。【结论】高效授粉树能显著提高‘富士’和‘新红星’苹果的外观和内在品质,并且与对照存在显著差异。不同授粉组合对‘富士’和‘新红星’苹果品质影响差异较大,经‘红菱’授粉,‘富士’和‘新红星’苹果品质有显著提高。