仔猪水肿病蜂胶佐剂多价灭活苗的研制Ⅰ.疫苗制备工艺

针对仔猪水肿病发病迅速,病死率很高且很难用抗菌药物控制的特点,旨在研制一种预防该病的新型高效疫苗。采用仔猪水肿病多发病型菌株O138,O139,O141以及湖北地方病型菌株作为制苗用菌种,优化其培养条件,采用蜂胶作为制备疫苗的佐剂,对研制的疫苗进行检验。结果表明菌种在优化培养基上生长旺盛,疫苗安检小鼠及仔猪全部健活,效力检验免疫组保护率达到100％。结果表明该疫苗制备工艺切实可行,疫苗安全性好,保护力强,值得进一步研究。     

选择优良菌株用于仔猪水肿病疫苗的改进

传统的仔猪水肿病疫苗（目前市场上广泛使用），只是以致水肿病大肠杆菌菌株的O抗原为基础，而没有考虑水肿毒素SLT－lle抗原和菌毛F18抗原，其免疫效果鸡以提高，在仔猪水肿病疫苗的改进中，我们除了考虑O139、O18、O141菌体抗原之外，还利用PCR技术、单克隆抗体技术、电镜技术筛选了含有水肿毒素SLT－lle抗原和菌毛F18抗原的菌株。本研究中获得用于新一代仔猪水肿病疫苗的三型大肠杆菌菌株；O139：SLT－lle^ ：F18ab^ 、O138：STL－lle^ ：F18ab^ 以及O141：SLT－lle^ :F18ac^ 。     

仔猪大肠杆菌病三价蜂胶灭活疫苗猪体血清抗体消长规律

采用大肠杆菌C83549(O149:K88ac)、C83644(O68:K99)、C83710(O9:987P)菌株制备抗原,以蜂胶为佐剂,研制仔猪大肠杆菌病三价蜂胶灭活疫苗,疫苗成品检验均符合相关要求。将疫苗免疫妊娠母猪并用凝集试验测定其所产仔猪的抗体消长规律,并研究疫苗免疫保护相关性。结果表明:妊娠母猪产前40d和15d各免疫1次所产仔猪母源抗体效价较高,仔猪在整个哺乳期都可以得到保护。同时也可运用产前30d和10d进行免疫接种方法。     

仔猪水肿病(三价)灭活疫苗的研究 I菌种的微生物学特性、毒力和免疫原性鉴定试验

对引起仔猪水肿病的常见血清型大肠埃希氏菌菌株C83905、C83684和C83527进行了各级系统的鉴定和初步研究。结果表明这3个菌株毒力强,免疫原性好,可以作为预防仔猪水肿病的疫苗候选株。     

仔猪水肿病(三价)灭活疫苗的研究Ⅰ菌种的微生物学特性、毒力和免疫原性鉴定试验

对引起仔猪水肿病的常见血清型大肠埃希氏茵菌株C83905、C83684和C83527进行了各级系统的鏊定和初步研究。结果表明这3个菌株毒力强，免疫原性好，可以作为预防仔猪水肿病的疫苗候选株。     

仔猪大肠埃希氏菌病三价蜂胶灭活疫苗血清抗体消长规律的研究

采用猪大肠杆菌C83549（O149：K88ac）、C83644（O68：K99）、C83710（O9：987P）菌株制备抗原,以蜂胶为佐剂,研制仔猪大肠埃希氏菌病三价蜂胶灭活疫苗,疫苗成品各项检验均符合相关要求。将疫苗免疫妊娠母猪并用微量凝集试验测定其所产仔猪的抗体消长规律,并研究疫苗免疫保护情况。结果表明：妊娠母猪产前40d和15d各免疫1次,所产仔猪母源抗体效价较高,仔猪在整个哺乳期都可以得到保护。同时也可运用产前30d和10d进行免疫接种的方法。     

致仔猪水肿病大肠杆菌的分离鉴定及对小鼠的毒力研究

从发病仔猪脏器中分离到一株细菌,进行了初步鉴定。结果表明,该菌为致猪水肿病大肠杆菌,在血平板上呈β溶血,经PCR鉴定该菌株具有产毒素基因,对小鼠毒力强,能致其发病死亡,血清型为O141,是临床多发血清型菌株。将细菌培养物和裂解毒素分别经皮下和尾静脉两种途径接种于体重为16~18 g昆明系小鼠,小鼠腹腔注射细菌培养物后12~48 h死亡,不表现神经症状,剖检水肿病病变特征不典型;小鼠于尾静脉注射裂解毒素后4~48 h,出现典型的眼睑水肿和后躯瘫痪等神经症状,直至死亡。该菌株致小鼠死亡的最小毒素剂量为0.2 mL/只。研究结果表明,小鼠可作为诊断仔猪水肿病模型,也进一步证明试验菌株为致猪水肿病菌株,可作为制备疫苗菌株。     

断奶仔猪对毒力基因缺失大肠杆菌的免疫应答

为研究猪水肿病大肠杆菌SLT-Ⅱe编码基因突变菌株作为口服疫苗的免疫效果,本实验用构建的突变菌株(O139/SLT-Ⅱ e/07)口服免疫断奶仔猪后,检测突变菌株在仔猪肠道的定植情况,仔猪血清及粪便中的特异性抗体和细胞因子水平,并进行了免疫保护效力评价.结果显示,免疫后21 d仍能在实验1组(微胶囊口服免疫)和2组(直接口服免疫)的仔猪粪便中检出突变菌株;从免疫后第7 d、14 d和21 d开始,在实验1组血清样品中可分别检测到抗SLT-Ⅱ eA蛋白、F18ab菌毛蛋白和O139抗原的IgG抗体(P/N＞2);从免疫后第7 d、14 d开始,在粪便中可分别检测到抗SLT-Ⅱ eA蛋白、SLT-Ⅱ eB蛋白、O139抗原、F18ab菌毛蛋白的slgA抗体(P/N＞2);免疫仔猪血清中的INF-γ的含量升高;实验2组的血清特异性IgG水平和粪便中sIgA抗体水平比实验1组低;该突变菌株对仔猪具有免疫保护作用.研究结果表明该大肠杆菌基因突变株可作为仔猪水肿病口服疫苗的候选菌株.     

仔猪产气荚膜梭菌肠毒血症病原诊断及疫苗研究V.疫苗的制备、检验和田间试验

将试验确定的产毒力强的产气荚膜梭菌A型、C型菌种,选用复合培养基,经培养、灭活脱毒、浓缩和冷冻干燥,制备多批肠毒血症A型、C型和AC型二价干粉灭活疫苗.采用免疫攻毒或中和试验方法对研制的疫苗进行效力检验,疫苗100%合格,达到<规程>规定的标准.在13个省进行大规模田间试验的结果表明,所研制的疫苗性能良好,安全有效.母猪接种疫苗后无一例不良反应发生,并且仔猪生后健康,能够有效地预防和控制该病的发生和流行.     

仔猪水肿病标准菌株对小鼠和仔猪免疫原性的测定试验

分别以仔猪水肿病标准菌株C83684、C83905、C83527制备的灭活疫苗免疫小鼠和仔猪,14天后分别攻以致死量的强毒菌液及毒素,攻毒试验表明,疫苗免疫效果良好,三株菌株具有良好的免疫原性。     

鸭疫里氏杆菌二价灭活疫苗制备及免疫效力研究

【目的】根据鸭疫里氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)血清1型、2型贵州流行株制备二价灭活疫苗,为鸭疫里氏杆菌病的防控及疫苗研制提供研究资料。【方法】以血清1型RA(RA-G06株)、血清2型RA(RA-HS01株)地方流行株为菌种,通过涂板法测定菌株生长曲线,利用改良寇氏法计算菌株对鸭的半数致死量(median lethal dose, LD₅₀),将2株菌培养至终浓度为1×10¹⁰ CFU/mL后等比例混合,以卡波姆为佐剂制备二价灭活疫苗,经疫苗质量检验后进行雏鸭免疫试验;通过检测免疫鸭血清中特异性抗体水平和攻毒保护试验评价疫苗的保护率,对攻毒试验鸭心脏、肝脏、脾脏和脑组织进行组织病理学观察。【结果】RA-G06株和RA-HS01株均在培养12 h时到达峰值,活菌数分别为2.1×10¹¹和3.3×10¹¹ CFU/mL,LD₅₀分别为1.44×10¹⁰和2.63×10⁸ CFU/mL;制备的疫苗安全性良...     

禽霍乱油乳剂灭活菌苗的研究

选用免疫原性好的５Ａ和７Ａ血清型巴氏杆菌菌株，分别接种于马丁肉汤通气培养。要求每ｍｌ的含菌量达１００亿以上。经０．５％福尔马林灭活后，等量混合为水相。１０＃白油为油相，按适当比例制成油乳剂灭活菌苗。与禽霍乱弱毒菌苗和禽霍乱氢氧化铝菌苗，分别接种于同群蛋鸡作对比试验。结果证实油乳剂灭活苗在安全性和免疫原性方面都优于后两种疫苗，５个月的攻毒保护率达８０％。经广泛的区域试用，从反馈信息和实地调查结果说明本菌苗对各种日龄的鸡、鸭、鹅都能有效地预防和控制禽霍乱的发生或流行。     

鸡大肠杆菌病中草药佐剂多价灭活苗的研制——Ⅰ、疫苗生产工艺

采用鸡大肠杆菌多发病型菌株以及地方病型菌株作为制苗用菌种，保证了疫苗既具有一定的广谱性，又具有一定的特异性；采用液体通气培养方法，在一定程度上提高了菌数；采用中草药蜂胶作为佐剂不但可有效地提高机体的免疫功能，同时兼具有治疗，保健和促生长作用，另外蜂胶还可以增大抗原表面积，延长抗原在组织的贮存时间，可持久地释放抗原，保证了机体持续产生高效价抗体。     

滨海地区鸡致病性大肠埃希菌的分离鉴定

为了控制滨海地区鸡大肠埃希菌病的发生,对大肠埃希菌污染严重的部分鸡场进行了病原分离培养、血清型鉴定以及田间试验.结果表明,14株分离菌中有11株属于大肠埃希菌;分离株血清型主要有O78、O24、O93和O11 4种;免疫保护试验使大肠埃希菌病死率降低了6％.     

鸭疫里默氏杆菌贵州流行株蜂胶灭活疫苗制备

【目的】制备鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)贵州流行株蜂胶灭活疫苗。【方法】选取RA血清2型贵州流行株(RA-SS-8株)为基础菌株,依次利用分光光度法和平板计数法测定细菌生长曲线,再进行灭活条件筛选,以蜂胶为佐剂制备RA贵州流行株蜂胶灭活疫苗,并进行无菌检验、安全性检验及免疫鸭攻毒保护性试验。【结果】分光光度法测定RA-SS-8株菌液D_{600 nm}值随培养时间变化显示,细菌在0~3 h时增殖缓慢,在3~10 h时增殖趋势明显加快,在10 h以后增殖逐渐趋于平缓,随着培养时间的延长,细菌最终进入衰亡期;平板计数法结果显示,RA-SS-8株D_{600 nm}值为0.1~0.8时,该菌处于对数生长期,且D_{600 nm}值与活菌数呈现良好的线性关系;RA-SS-8株最佳灭活条件为0.2%甲醛溶液、37 ℃灭活12 h;蜂胶灭活疫苗含菌量为3.8×10⁹ CFU/mL,蜂胶干物质含量为10 mg/mL;无菌检验巧克力琼脂培养基上未见菌落生长;安全性检验以2倍免疫剂量接种雏鸭在观察期内未表现出不良反应,大体病变观察未见明显病变;免疫鸭攻毒保护性试验显示,蜂胶灭活疫苗免疫组鸭对RA-SS-8株的攻击后保护率为70%,蜂胶灭活疫苗对试验鸭心脏、肝脏组织均具有良好的保护效果。【结论】本研究成功制备了RA贵州流行株蜂胶灭活疫苗,为蜂胶灭活疫苗制备和动物免疫试验奠定基础。     

犬细小病毒性肠炎弱毒疫苗的研究

选用从犬科动物貉中分得的貉细小病毒CR86106株为种毒,用猫肾传代细胞F81系培养增殖,制成犬细小病毒性肠炎弱毒疫苗(M-CPV)。该苗对猪红细胞的HA效价平均156,对F81细胞系的TCID_(50)平均为4.02。对离乳幼犬的最低免疫剂量为5×10~(3·8)TCID_(50)。苗注后2周即可获得免疫,血清HI抗体达32即可抵抗CPV强毒感染。疫苗的免疫期为1年。于-15℃以下冰盒保存,疫苗的有效期为9个月。CR80106株遗传性稳定,经CPV易感幼犬和F81细胞系连续传5代和22代,对犬的安全性和免疫原性不变。病毒蛋白经SDS—PAGE和HPLC分析,均未发现与原始毒株有不同。M-CPV对母源抗体干扰有较强的抵抗力,母源抗体达32的幼犬,100％可对该亩产生免疫应答。HI抗体<2的CPV易感幼犬接种该苗后除粪便轻度阳转外,无其他异常,同居CPV易感幼犬也不会感染发病。两次免疫后作同居感染攻毒,可获得完全保护,不会由粪便排出强毒。于产前20d给怀孕母犬接种,也未见有流产、早产、死胎和弱胎现象发生,所产仔犬全部生长发育正常。全国16个军、警犬场队用本疫苗累计免疫各类犬3320只,全部安全,没有一只因注苗而发病,经1～2年临床观察,3296头获得保护,保护率为99.28％。     

A:L1型鸭源多杀性巴氏杆菌灭活疫苗制备及免疫效力研究

【目的】制备鸭多杀性巴氏杆菌灭活疫苗,有效控制贵州省鸭多杀性巴氏杆菌发生和流行。【方法】以实验室分离保存的A：L1型多杀性巴氏杆菌地方流行株为菌种,通过涂板法测定该菌株生长曲线,并采用改良寇氏法计算该菌株对鸭的半数致死量（median lethal dose,LD₅₀）,将该菌培养至终浓度为1×10¹⁰ CFU/mL后分别制备白油佐剂灭活疫苗和卡波姆佐剂灭活疫苗,经疫苗质量检验后进行免疫雏鸭试验;通过攻毒保护试验评价比较两种疫苗的保护率,并对攻毒试验鸭肝脏、肺脏、脾脏进行病理组织学观察。【结果】A：L1型多杀性巴氏杆菌疫苗株培养至18 h到达峰值,活菌数可达1.0×10¹⁰ CFU/mL;LD₅₀为5 CFU;制备的两种疫苗安全性良好;攻毒保护试验结果显示,一免后卡波姆佐剂灭活疫苗免疫保护率可达62.5%,高于白油佐剂灭活疫苗（50.0%）及商品灭活疫苗（50.0%）。二免后卡波姆佐剂灭活疫苗优势更为明显,免疫保护率可达87.5%,高于白油佐剂灭活疫苗（75.0%）及商品灭活疫苗（62.5%）。病理组织学结果显示,一免后卡波姆佐剂灭活疫苗能对肺脏提供较好的保护效果,二免后在肝脏、肺脏和脾脏的保护效果上,卡波姆佐剂灭活疫苗组优势明显。【结论】利用贵州地区流行的A：L1型菌株所制备的卡波姆佐剂灭活疫苗免疫效果明显,能对贵州地区多杀性巴氏杆菌病的防控起到重要作用。     

水貂细小病毒性肠炎弱毒疫苗的研究

用猫泛白细胞减少症病毒(FPV)弱毒作为制苗毒种,经CRFK细胞培养15代,使其滴度稳定在10~(5.0)～10~(5.0)TCID_(50)/0.03mL之间.经4代猫体返祖试验证明,该弱毒无返祖现象.10倍免疫剂量的水貂安全试验证明,该弱毒毒力稳定,对水貂无感染性.用FPV弱毒4～15代病毒研制成功的水貂肠炎弱毒疫苗,各项试验证明,该苗安全可靠,免疫剂量为10~(3.0)×1mL,免疫效果好,保护率在95%以上,免疫期6个月以上.     

兔大肠杆菌病二价蜂胶灭活疫苗的研究

从分离鉴定的15株致病性大肠杆菌中，筛选出2株流行广泛，致病力强，免疫原性好，具有血清型（0103、085）代表性的大肠杆菌作为制苗菌株，以蜂胶为佐剂，研制出的兔大肠杆菌病二价蜂胶灭活疫苗，使用安全，免疫效果好，保护率达87％以下。该苗在4℃保存其为8个月以上。在黑龙江、辽宁两省免疫2万只家兔，1～2年的观察表明，用苗后兔群未出现不良反应，且用苗后仔兔成活率由50％左右提高到85％以上，疫苗使用不影响敏殖母兔的妊娠过程。