人类红细胞葡萄糖—6—磷酸脱氢酶的分离纯化与鉴定

用人ACD抗凝全血450ml,制成溶血液,经NADP—Sepharose4B亲和层析,DEAE—Sephadex A50柱,Sephadex G200柱,获得G6PD纯品0.83mg。经SDS—PAGE显示单一电泳带,分子量60000。纯化倍数22027,比活性163IU/mg,回收率60％。     

人红细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶分离纯化方法的改进

葡萄糖－６－磷酸脱氢酶（Ｇ－６－ＰＤ）是磷酸戊糖途径的限速酶。传统的以ＮＡＤＰ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ作为亲和吸附剂的纯化方法由于较昂贵的ＮＡＤＰ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ用量多,且耗时长,为此,作者对此传统方法进行了改进。报道如下：１材料与方法１．１...     

人红细胞葡萄糖—6—磷酸脱氢酶变异型—Gd(一)湛江型的鉴定及分离纯化

利用自制合成NADP—Sepharose4B亲和胶,分离纯化了1例人红细胞葡萄糖—6—磷酸脱氢酶变异型,并进行了生化特征的鉴定。其生化特性与国内已报道的变异型不同,命名为Gd(—)湛     

人红细胞葡萄糖—6—磷酸脱氢酶的放射免疫检测

用本实验室所纯化的葡糖—6—磷酸脱氢酶(G6PD)和所制备的兔抗G6PD血清,初步建立了人红细胞     

人类红细胞6—磷酸葡萄糖脱氢酶分型的初步研究

人类红细胞6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PD)缺乏是一种先天性代谢缺陷,常可导致溶血发作。广东省有此缺陷者约占人群的5～8％,个别地区(海南黎族)可高达20％。此病已成为广东省新生儿溶血病的最常见原因。     

纳豆激酶分离纯化及其兔抗血清的制备

为分离纯化纳豆激酶,使用纳豆激酶粗制液经硫酸铵分级盐析、Sephodex G100和CM-Sephrose-6B FF层析等步骤纯化,经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。以纯化的纳豆激酶作为抗原,结合福氏佐剂,采用多次多点肌肉注射法对兔进行免疫,以琼脂免疫双向扩散法检测效价。试验结果表明,纳豆激酶粗制液经纯化后,得纯酶样品,酶被纯化了28.4倍,比活力为608.6 Uku.mg-1蛋白,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测为单一蛋白条带,纳豆激酶兔抗血清效价为1∶64。成功制备的兔抗纳豆激酶抗血清,为研究纳豆激酶的功能提供了物质基础。     

新生儿脐血红细胞6—磷酸葡萄糖脱氢酶活性测定正常值及基因频率分布

红细胞6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G-6 PD)缺乏是一种遗传性的红细胞酶病,是新生儿遗传性溶血性贫血的最常见原因。以往一般实验室常用高铁血红蛋白还原试验来间接检测 G-6PD 活性,在某些情况下,可出现假阴性及假阳性结果。为了了解新生儿红细胞 G-6PD 缺乏的真实发病率及基因频率分布,我们采用岛津 uv-730微流式紫外分光光度计定量测定 G-6PD 活性,并同时测     

纤溶酶原的分离纯化与抗血清的制备

纤溶酶原的分离纯化:经硫酸铵分段盐析、透析、Lys—Sepharose4B亲和层析、超滤浓缩、Sephadex G—15脱盐,从90ml人血浆中可分离制得8.03mg的纤溶酶原。SDS—PAGE电泳显示单一区带,分子量84400     

红麻6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6PDGH)基因克隆及RNAi载体构建

[目的]克隆红麻不育系和保持系6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6PDGH)基因,并构建其RNAi载体,为进一步研究其在红麻花药发育中的功能奠定基础.[方法]根据红麻花药转录组高通量测序数据结果和生物信息学方法获得6PDGH基因全长cDNA拼接序列,分别以红麻不育系(P3A)和保持系(P3B)的花药反转录cDNA及总DNA为模板克隆红麻6PGDH基因全长.依据RNAi载体设计原则,选取红麻6PGDH基因cDNA序列中段389bp的特异片段做为RNA干扰片段,构建红麻6PGDH因的RNAi载体.[结果]克隆获得的红麻不育系(P3A)和保持系(P3B)花药6PGDH基因全长均为1751 bp,均包含1458bp的开放阅读框,编码485个氨基酸残基,无内含子;其碱基序列在不育系和保持系中仅存在两个碱基差异.该基因氨基酸序列(GenBank登录号KF964027)与拟南芥、玉米、大豆、苜蓿、三角叶杨、蓖麻的6PDGH同源性分别为75.07%、84.57%、86.50%、87.24%、91.19%和92.01%.成功构建了红麻6PGDH基因的RNAi载体,获得了干扰表达载体pART27-pKANNIBAL-R1+2.[结论]成功克隆获得红麻6PGDH基因全长序列,构建的干扰表达载体可用于红麻6PGDH基因的功能研究.     

鸡传染性法氏囊病毒的分离、纯化与抗血清的制备

采用鸡胚尿囊液培养传染性法氏囊病毒（ＩＢＤＶ）。将培养病毒的鸡胚尿囊液经高速离心，聚乙二醇（ＰＥＧ）沉淀、蔗糖垫底超速离心、ＮａＢｒ密度梯度离心，可获得纯化的鸡传染性法氏囊病毒带。通过透射电子显微镜观察，表明ＩＢＤＶ颗粒呈六角形，直径约６０ｎｍ，无囊膜，其浮力密度为１．３０～１．３６ｇ／ｍｌ。实验所分离的病毒粒子的平均含量为１．７２ｍｇ／ｍｌ。用这种病毒免疫健康家兔制备抗ＩＢＤＶ的血清，获得了效价在１∶３２以上的抗血清，抗血清有较高的纯度和专一性     

牛IgG轻链的分离纯化及其多克隆抗血清的制备

实验应用凝胶过滤和盐析等方法直接从牛初乳中分离纯化IgG,并应用化学方法断裂回收IgG轻链。分离纯化获得分子量约27.66 ku的IgG轻链蛋白溶液,蛋白质含量为0.105 mg.L-1,浓缩后免疫家兔,获得抗轻链抗血清,效价>11∶6,免疫双扩散和免疫电泳均为特异性条带,表明得到了纯化的IgG轻链及其特异性抗血清。     

正响应盐胁迫的甘蔗6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因的克隆

从甘蔗中克隆获得1个6PGDH基因的cDNA序列,记为Sc6PGDH(登录号:KF921299).该基因序列含有1个1467 bp的完整开放阅读框,推导编码488个氨基酸残基.生物信息学分析可知,Sc6PGDH基因编码的蛋白分子质量为53.6561 ku,为酸性稳定的亲水蛋白,含有信号肽,可能定位于内质网膜上,具有该类蛋白典型的保守结构域6PGD,且与分离自谷子、玉米和水稻的6-磷酸葡萄糖脱氢酶的氨基酸序列同源性分别高达96.11%、95.70%和93.24%,表明该基因在进化过程中比较保守.原核生物生长试验结果显示,甘蔗Sc6PGDH基因的表达蛋白可以显著增强大肠杆菌Rosetta菌株的耐盐性,推测该基因可能参与了生物体对盐胁迫的应答过程.     

正响应盐胁迫的甘蔗 6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因的克隆

从甘蔗中克隆获得1个6PGDH基因的eDNA序列,记为Se6PGDH（登录号：KD21299）．该基因序列含有1个1467bp的完整开放阅读框,推导编码488个氨基酸残基．生物信息学分析可知,Sc6PGDH基因编码的蛋白分子质量为53．6561ku,为酸性稳定的亲水蛋白,含有信号肽,可能定位于内质网膜上,具有该类蛋白典型的保守结构域6PGD,且与分离自谷子、玉米和水稻的6-磷酸葡萄糖脱氢酶的氨基酸序列同源性分别高达96．11％、95．70％和93．24％,表明该基因在进化过程中比较保守．原核生物生长试验结果显示,甘蔗S-6PGDH基因的表达蛋白可以显著增强大肠杆菌Rosetta菌株的耐盐性,推测该基因可能参与了生物体对盐胁迫的应答过程．     

黄瓜6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因cDNA片段的克隆及表达分析

以黄瓜品种露丰为材料,根据已报道的6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因(6PGDH)的保守氨基酸序列设计简并引物,利用RT-PCR技术获得黄瓜6PGDH的cDNA同源片段,命名为CSPG(登录号为EU815934)。该片段长度为1 207 bp,包含一个936 bp的开放阅读框(编码311个氨基酸)和271 bp的Poly A 3′非翻译区末端,无内含子;该基因编码的氨基酸序列与拟南芥、大豆、水稻、玉米、菠菜的6PGDH基因有75%以上的同源性。运用半定量RT-PCR技术对6PGDH基因的转录水平进行分析,结果表明:该基因在叶、根、茎中均有表达,高温胁迫下的表达量高于常温对照,说明6PGDH基因与热胁迫相关。     

异丙肾上腺素对大鼠肝细胞氮代谢及6-磷酸葡萄糖脱氢酶活性的影响

利用原代培养的肝细胞测定了异丙肾上腺素(ISO.1×10-6mol/L)对大鼠肝细胞氮代谢和6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PDH)活性的影响.结果表明ISO可影响大鼠肝细胞中尿素氮的浓度,与对照组相比ISO实验组培养液中尿素氮水平下降了30.66%(P＜0.05),且ISO的这种作用可被β-阻断剂心得安(PRO.1×10-6mol/L)所阻断.ISO也增加3H-亮氨酸参入肝细胞的量,与对照组相比其幅度提高了19.64%(P＜0.05),同样PRO可抑制这种作用.ISO还具有增加大鼠肝细胞产生IGF-Ⅰ的趋势,但与对照组相比无明显影响(P＜0.05).ISO对大鼠肝细胞G6PDH活性具有显著影响,实验组肝细胞中G6PDH活性与对照组相比下降了42.66%(P＜0.05),ISO引起的肝细胞G6PDH活性下降的作用也可被PRO所阻断.提示ISO可通过增强大鼠肝细胞氮素的保留和蛋白质的合成,以及通过抑制肝细胞G6PDH活性影响脂肪代谢从而调节机体的生长发育.     

米曲霉6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因(gnd)的克隆及生物信息学分析

采用PCR技术从米曲霉CICC2012菌株基因组中克隆6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因(gnd),并利用生物信息学手段对其氨基酸序列、进化树、理化性质、蛋白质结构等进行分析.序列测定和分析结果表明.gnd基因序列长为1 723 bp.包含1个1 551 bp的开放阅读框,编码516个氨基酸;gnd基因编码的6PGDH氨基酸序列与黄曲霉6PGDH基因的同源性为99％,存在的丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸磷酸化位点分别有11,2和6个;6PGDH蛋白分子量为57.3 kD,等电点为5.63; gnid基因编码蛋白二级结构α-螺旋区域占44.57％,β-折叠区域占12.79％.无规则卷曲区域占42.64％;氨基酸残基11～195位点为NADP+结合区域.     

热应激对猪卵母细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性及染色质构型的影响

将屠宰场采集的猪卵巢分为热应激组和对照组,分别检测两组未成熟卵母细胞的各项指标。利用亮甲酚蓝染色法研究葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性,对比分析热应激对细胞代谢活性的影响;利用Hoechst33342标记DNA区分染色质构型,对比分析热应激对细胞染色质构型的影响。结果表明:热应激组卵母细胞BCB+比例显著低于对照组(P0.05)。热应激组卵母细胞的各期染色质构型比例与对照组比例差异不显著(P0.05)。BCB+和BCB-组卵母细胞GV1-GV3染色质构型差异不显著(P0.05),但对照组BCB+卵母细胞的GV4构型比例明显高于BCB-(P0.05),且GVBD差异不显著(P0.05);而热应激组BCB+卵母细胞的GVBD比例明显低于BCB-(P0.05),且GV4差异不显著(P0.05)。综上,热应激对猪未成熟卵母细胞造成的损伤主要是影响了细胞的代谢活性,对细胞染色质构型的影响不大。     

猪红细胞抗原国际标准抗血清的制备研究

 利用俄罗斯及德国提供的抗猪红细胞抗原42种国际标准抗血清,检测了154头萍乡二头乌猪,68头汉普夏×萍乡杂交猪及43头万安花猪11个基因位点的抗原型及基因型,并利用凝集反应和溶血反应检测了萍乡二头乌猪84头母猪体内“自然抗体”的存在种类与效价,在此基础上,选定了33对供受体猪按计划进行同种免疫。先后共采集了33头受体猪近4000ml抗血清,通过吸附试验,制备了15个单价抗血清,其中5种已与国际标准统一,另外10种是否为中国猪所特有,需要进一步确定。     

侵染马铃薯的一个Tospovirus混合分离物的鉴定、纯化及多抗血清制备

在昆明地区栽培的马铃薯病株上分离鉴定出含有番茄斑萎病毒属(Tospovirus)番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus,TSWV)和花生环斑病毒(Groundnut ringspot virus,GRSV).利用蔗糖垫及差速离心法提纯了该混合分离物,提纯病毒免疫家兔5次,得到 TSWV和GRSV的混合抗血清,所制备的抗血清经间接ELISA测定效价为12560.